紫花苜蓿MsBBX24 基因的克隆及耐鹽性分析

王園，王晶，李淑霞

（寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏 銀川 750021）

紫花苜蓿（Medicago sativa）是豆科苜蓿屬多年生牧草，其產(chǎn)量高、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富、適口性好，再生能力強(qiáng)，因優(yōu)異的飼用價(jià)值而在世界各地廣泛栽培，享有“牧草之王”的美譽(yù)［1］。而我國(guó)紫花苜蓿的生產(chǎn)和種植多受到土壤鹽漬化的影響，造成單位面積產(chǎn)量低和干草品質(zhì)差等問題，同時(shí)苜蓿進(jìn)口量也呈逐年上升趨勢(shì)，嚴(yán)重制約了我國(guó)苜蓿的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展［2］。因此，利用生物學(xué)技術(shù)研究抗逆基因?qū)ψ匣ㄜ俎５恼{(diào)控作用，對(duì)加快紫花苜蓿抗逆育種的進(jìn)程具有重大意義。

BBX（B-box）是鋅指結(jié)構(gòu)蛋白家族的一個(gè)亞族，含有一個(gè)或多個(gè)由Zn2+結(jié)合的三級(jí)結(jié)構(gòu)域，根據(jù)結(jié)構(gòu)域不同可劃分為5 個(gè)亞家族，其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，氨基酸序列中包含1 或2 個(gè)參與蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互作的B-box 基序［3］。含Bbox 結(jié)構(gòu)域的蛋白廣泛存在于真核生物中，并在多種細(xì)胞過程如泛素化、蛋白運(yùn)輸以及轉(zhuǎn)錄調(diào)控等方面發(fā)揮著重要作用，研究報(bào)道，BBX 蛋白可與啟動(dòng)子順式作用元件T/G-box 結(jié)合，從而激活基因的轉(zhuǎn)錄［4-5］。BBX 在調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育如光形態(tài)建成、花發(fā)育和避蔭響應(yīng)中已有較多的研究。在植物中，擬南芥（Arabidopsis thaliana）含有32 個(gè)B-box 蛋白，水稻（Oryza sativa）含有30 個(gè)BBX 蛋白［6］。轉(zhuǎn)錄因子廣泛參與生物的生長(zhǎng)、發(fā)育、代謝以及環(huán)境響應(yīng)的調(diào)控過程，是重要的調(diào)控因子。最近的研究表明，BBX 作為轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)節(jié)各種細(xì)胞和生理過程，包括植物的生長(zhǎng)發(fā)育及多種非生物脅迫等［7-8］。大豆（Glycine max）BBX 家族多數(shù)基因參與干旱和鹽脅迫響應(yīng)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)GmBBXs啟動(dòng)子上含有逆境響應(yīng)元件TC-rich 和干旱誘導(dǎo)MYB 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)MBS，從而能夠調(diào)控逆境脅迫［9］；在菊花（Chrysanthemum morifolium）中發(fā)現(xiàn)過表達(dá)CmBBX19基因會(huì)降低植株的抗旱能力，而抑制該基因的表達(dá)能夠提高植物抗旱性［10］；茶樹（Camellia sinensis）CsBBX少數(shù)基因在干旱和鹽脅迫條件下可被誘導(dǎo)表達(dá)，提高植物耐脅迫能力［11］；香蕉（Musa nana）MaBBX基因可能參與低溫響應(yīng)過程，大部分成員都能響應(yīng)低溫脅迫，在不同低溫下表達(dá)量上調(diào)，進(jìn)而提高植物抗寒性［12］。BBX 在調(diào)控植物非生物脅迫響應(yīng)中的研究相對(duì)較少，關(guān)于其成員參與紫花苜?？鼓嫘缘难芯恳采形匆妶?bào)道，因此有必要充分利用現(xiàn)有的信息，對(duì)紫花苜蓿BBX 家族基因進(jìn)行克隆和抗逆性研究。

本研究以紫花苜蓿為試驗(yàn)材料，從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中篩選到顯著響應(yīng)鹽脅迫的MsBBX24基因，通過對(duì)MsBBX24基因克隆、生物信息學(xué)分析、基因表達(dá)模式分析、過表達(dá)載體構(gòu)建以及轉(zhuǎn)基因擬南芥的獲得，對(duì)其耐鹽性進(jìn)行初步評(píng)估。本試驗(yàn)旨在為后續(xù)深入研究MsBBX24基因的功能提供幫助，為紫花苜?？鼓娣肿佑N提供理論依據(jù)和基因資源參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)于2020年10 月-2021年10 月進(jìn)行。試驗(yàn)所用的植物材料紫花苜蓿和擬南芥（Col-0）由實(shí)驗(yàn)室保存。植物材料種植于植物培養(yǎng)間，培養(yǎng)條件為：溫度25 ℃，濕度60%～70%，光照/黑暗周期16 h/8 h，光照強(qiáng)度160 μmol·m-2·s-1。RNA 提 取試劑盒（MiniBEST Plant RNA Extraction Kit）、反 轉(zhuǎn)錄試劑 盒（PrimeScript?Ⅱ1st Strand cDNA Synthesis Kit）、大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞、StellarTM 感受態(tài)細(xì)胞、pMD19-T vector、限制性內(nèi)切酶EcoR I、T4 DNA 連接酶、高保真酶PrimeSTAR?HS DNA Polymerase 試劑盒等均購(gòu)自大連寶生物工程有限公司（TaKaRa）；熒光定量試劑盒（ChamQ SYBR qPCR Master Mix）和重組酶試劑盒（ClonExpress II One Step Cloning Kit）均購(gòu)自南京諾唯贊生物公司；質(zhì)粒提取試劑盒和DNA 凝膠回收試劑盒均購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 紫花苜蓿MsBBX24基因的克隆及生物信息學(xué)分析 根據(jù)實(shí)驗(yàn)室之前紫花苜蓿耐鹽轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，篩選出顯著響應(yīng)鹽脅迫的MsBBX24基因，利用Primer Premier 5 軟件設(shè)計(jì)MsBBX24基因全長(zhǎng)擴(kuò)增引物MsBBX24-F/R（表1）。根據(jù)RNA 試劑盒操作說明提取紫花苜?？俁NA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以cDNA 為模板進(jìn)行MsBBX24基因的CDS 序列擴(kuò)增，反應(yīng)體系：20 μL，cDNA 1 μL、引物各1 μL、2×Taq Master Mix 10 μL、雙蒸水7 μL；反應(yīng)程序：95 ℃5 min，95 ℃15 s，58 ℃15 s，72 ℃1 min（35 個(gè)循環(huán)），72 ℃5 min。將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)后克隆到pMD-19T 載體上，通過菌液PCR 檢測(cè)，將陽(yáng)性克隆送至上海生工生物公司進(jìn)行測(cè)序。

表1 本試驗(yàn)所用引物Table 1 Primers used in this experiment

利用NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov）對(duì)MsBBX24基因的核酸序列、氨基酸序列以及對(duì)應(yīng)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。使用在線軟件SOPMA（https：//npsa-prabi. ibcp. fr/cgi-bin/npsa_automat. pl？page=npsa_sopma. html）對(duì)氨基酸的二級(jí)結(jié)構(gòu)和親水性/疏水性進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。使用TMHMM Server 2.0 軟件（http：//www. cbs. dtu. dk/services/TMHMM）對(duì)蛋白質(zhì)的跨膜結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。通過DNAMAN 軟件（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）對(duì)紫花苜蓿MsBBX24 的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)。使用MEGA 6 軟件（https：//www.megasoftware.net/）進(jìn)行MsBBX24 蛋白進(jìn)化樹的構(gòu)建。

1.2.2MsBBX24基因在紫花苜蓿中的表達(dá)分析 將保定苜蓿種子用5%的次氯酸鈉溶液消毒5 min，用蒸餾水沖洗數(shù)次后置于鋪有兩層濕濾紙的培養(yǎng)皿中，放于培養(yǎng)間發(fā)芽。萌發(fā)4～5 d 后將幼苗移至水培盆中，用改良后的霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)。培養(yǎng)至一個(gè)月左右時(shí)，挑選生長(zhǎng)狀況良好、大小一致的植株進(jìn)行150 mmol·L-1NaCl 處理，分別于0、2、4、8 和12 h 采取根部和葉片樣品，并將采集的樣品放入-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩８鶕?jù)RNA 試劑盒操作說明提取各樣品總RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，方法同1.2.1。利用Primer Premier 5 軟件設(shè)計(jì)MsBBX24基因定量引物qMsBBX24-F/R，以紫花苜蓿MsActin-F/R 為內(nèi)參基因引物，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）。反應(yīng)體系為：20 μL，2×ChamQ SYBR qPCR Master Mix 10 μL、引物各0.4 μL、cDNA 3 μL，雙蒸水6.2 μL。反應(yīng)程序：第1 步：95 ℃預(yù)變性30 s；第2 步：95 ℃循環(huán)10 s、60 ℃循環(huán)30 s；第3 步：熔解：95 ℃15 s、60 ℃60 s、95 ℃15 s。根據(jù)得到的Ct 循環(huán)閾值，用2-△△CT方法［13］計(jì)算MsBBX24基因的組織特異性表達(dá)；再分別以根和葉在0 h 表達(dá)量為對(duì)照，2、4、8 和12 h 為處理，計(jì)算NaCl 處理?xiàng)l件下根和葉的相對(duì)表達(dá)量，計(jì)算方法如下：ΔΔCT=（CT目的基因-CT內(nèi)參基因）NaCl處理-（CT目的基因-CT內(nèi)參基因）對(duì)照，試驗(yàn)設(shè)置3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)和3 個(gè)技術(shù)重復(fù)。

1.2.3MsBBX24基因過表達(dá)載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)基因擬南芥獲得 以紫花苜蓿cDNA 為模板，以含有EcoR I 酶切位點(diǎn)和部分載體接頭序列的cMsBBX24-F/R 為引物，用高保真酶擴(kuò)增MsBBX24基因全長(zhǎng)。用限制性內(nèi)切酶EcoR I 酶切pCAMBIA1300 載體，用T4 DNA 連接酶將MsBBX24基因片段和酶切好的pCAMBIA1300 載體連接，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α 中，測(cè)序正確后提取質(zhì)粒，即為pCAMBIA1300-MsBBX24 重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒通過電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入至農(nóng)桿菌菌株GV3101 中，通過蘸花法［14］將其轉(zhuǎn)入野生型擬南芥。

收獲侵染后的擬南芥T0代種子，播種于蛭石中并用50 mmol·L-1的Basta 噴灑篩選，經(jīng)過連續(xù)兩代的陽(yáng)性苗篩選獲得純合的T2代種子，將該種子用作后續(xù)試驗(yàn)。培養(yǎng)純合植株提取RNA 并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以MsBBX24-F/R 為特異性引物，以AtActinF/R 為內(nèi)參基因引物，通過半定量RT-PCR 技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)基因擬南芥中MsBBX24的表達(dá)情況。

1.2.4MsBBX24轉(zhuǎn)基因擬南芥耐鹽性分析 將野生型擬南芥Col-0 和收獲的T2代轉(zhuǎn)基因種子用75%的酒精消毒5 min，然后在超凈工作臺(tái)中用無菌水沖洗4～5 遍，均勻地點(diǎn)播于1/2 MS 固體培養(yǎng)基（MS 粉2.37 g·L-1，蔗糖10 g·L-1，瓊脂粉9 g·L-1，pH=5.8）上，置于4 ℃冰箱中春化，2 d 后將其移至正常生長(zhǎng)條件下進(jìn)行培養(yǎng)。生長(zhǎng)4～5 d 后，挑選長(zhǎng)勢(shì)一致的幼苗將其轉(zhuǎn)移至含有0、100 和150 mmol·L-1NaCl 的1/2 MS 固體培養(yǎng)基上。在移苗時(shí)將野生型（對(duì)照）和轉(zhuǎn)基因幼苗移至同一種處理的培養(yǎng)基上以避免不同平板之間的差異，然后將平板豎直放在培養(yǎng)架上，培養(yǎng)7 d 后拍照并統(tǒng)計(jì)根長(zhǎng)、側(cè)根數(shù)和子葉綠化率，每個(gè)重復(fù)5 株。

為了進(jìn)一步確定MsBBX24基因?qū)M南芥成苗耐鹽性的影響，本試驗(yàn)對(duì)生長(zhǎng)3 周的擬南芥植株進(jìn)行150 mmol·L-1NaCl 溶液處理，并于10 d 后測(cè)定如下指標(biāo)：參照Dahro 等［15］的方法測(cè)定相對(duì)電導(dǎo)率（ion leakage，IL），采用硫代巴比妥酸比色法［16］測(cè)定丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量，95% 無水乙醇浸提法［17］測(cè)定葉綠素（chlorophyll，Chl）含量，對(duì)Jiang 等［18］的方法做修改測(cè)定過氧化氫（hydrogen peroxide，H2O2）含量，分光光度計(jì)法［19］測(cè)定脯氨酸（proline，Pro）含量，愈創(chuàng)木酚法［20］測(cè)定過氧化物酶（peroxidase，POD）活性，氮藍(lán)四唑光還原法［21］測(cè)定超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

使用Excel 2016 和SPSS 25.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析，采用T檢驗(yàn)，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01。使用Origin 2021 作圖。所有試驗(yàn)均設(shè)置3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)和3 個(gè)技術(shù)重復(fù)，試驗(yàn)數(shù)據(jù)為3 次生物學(xué)重復(fù)的平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫花苜蓿MsBBX24 基因的克隆及生物信息學(xué)分析

通過PCR 擴(kuò)增從紫花苜蓿中克隆得到了MsBBX24基因，編碼區(qū)序列長(zhǎng)723 bp，編碼240 個(gè)氨基酸（圖1）?；蚓幋a的蛋白質(zhì)理化性質(zhì)預(yù)測(cè)分析發(fā)現(xiàn)，MsBBX24 蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量為30.58 kDa，理論等電點(diǎn)（theoretical isoelectric point，pI）為7.74，預(yù)測(cè)的不穩(wěn)定系數(shù)為47.91，穩(wěn)定系數(shù)大于40，屬于不穩(wěn)定蛋白。MsBBX24 蛋白的親水性預(yù)測(cè)值為-0.301，因此屬于親水性蛋白（圖2A）。跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)結(jié)果顯示該蛋白沒有跨膜結(jié)構(gòu)域（圖2B）。二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示MsBBX24 蛋白包含22.5%的α-螺旋、16.25%的延伸鏈、2.08%的β-轉(zhuǎn)角和59.17%的不規(guī)則卷曲（圖2C）。

圖1 MsBBX24 基因的核苷酸序列及其編碼的氨基酸序列Fig.1 Nucleotide and predicted amino acid sequences of MsBBX24 geneATG：起始密碼子；*：終止密碼子；橫線標(biāo)記：保守區(qū)域。ATG：Initiation codon；*：Temination codon；Horizontal line mark：Conserved domains.

圖2 MsBBX24 蛋白生物信息學(xué)分析Fig.2 Bioinformatics analysis of MsBBX24 proteinA：MsBBX24 蛋白質(zhì)親水性分析；B：MsBBX24 蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)；C：MsBBX24 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)（圖中線條由高到低依次表示：α-螺旋、延伸鏈、β-轉(zhuǎn)角、不規(guī)則卷曲）。A：Hydrophilicity analysis of MsBBX24 protein；B：Transmembrane structure prediction of MsBBX24 protein；C：Secondary structure prediction of MsBBX24 protein（The lines in the figure were alpha helix，extended strand，beta turn and random coil in descending order）.

蛋白質(zhì)多序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)MsBBX24 蛋白包含兩個(gè)B-box 保守結(jié)構(gòu)域（5～47 和53～98），與其他植物的BBXs（B-box zinc finger genes）蛋白具有高度的同源性，其中與蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）、刺毛黧豆（Mucuna pruriens）、大豆和紅豆（Abrus precatorius）的相似性分別達(dá)到了97%、82%、81%和80%（圖3）。進(jìn)化樹結(jié)果分析表明MsBBX24 與鷹嘴豆（Cicer arietinum）和蒺藜苜蓿的親緣關(guān)系較近，與其他豆科植物的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)（圖4）。

圖3 MsBBX24 氨基酸多序列比對(duì)Fig.3 Multiple sequence alignment of MsBBX24 amino acids

圖4 MsBBX24 蛋白進(jìn)化樹構(gòu)建Fig.4 Phylogenetic tree analysis of MsBBX24 protein

2.2 MsBBX24 基因的表達(dá)模式分析

以紫花苜蓿根和葉組織的cDNA 為模板，利用qRT-PCR 技術(shù)分析MsBBX24基因在正常條件和鹽（150 mmol·L-1NaCl）脅迫條件下的相對(duì)表達(dá)量變化，150 mmol·L-1NaCl 脅迫下MsBBX24基因的表達(dá)量分別以正常條件下根和葉的表達(dá)量為一個(gè)單位作對(duì)照進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。結(jié)果顯示，正常條件下，MsBBX24基因在葉中的表達(dá)量顯著高于根的（P＜0.01），為根的24.56 倍（圖5A）；在12 h 的脅迫時(shí)間內(nèi)，隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，MsBBX24基因在根和葉的表達(dá)量均呈先上升再下降的趨勢(shì)，在4 h 時(shí)根和葉片組織中的表達(dá)量都達(dá)到最大值，其中根中的表達(dá)量為對(duì)照的17.65 倍，葉中為對(duì)照的4.33 倍，根的表達(dá)量顯著高于葉的表達(dá)量（P＜0.05 或P＜0.01）；在12 h 時(shí)，葉片中的表達(dá)量下降為對(duì)照的1.73 倍，根中下降為0.69 倍（圖5B）。

圖5 MsBBX24 基因的表達(dá)量分析Fig.5 Analysis of MsBBX24 gene relative expression levelA：組織特異性表達(dá)，**表示根和葉表達(dá)量差異極顯著（P＜0.01）；B：150 mmol·L-1 NaCl 處理下根和葉的表達(dá)量，*和**分別表示同一組織中不同處理時(shí)間的表達(dá)量與0 h 相比差異顯著（P＜0.05）和差異極顯著（P＜0.01）。A：Tissue-specific expression，** indicated that significant differences in root and leaf expression（P＜0.01）；B：Relative expression level of roots and leaves under 150 mmol·L-1 NaCl treatment；* and ** respectively indicated the difference between different time in same organization and 0 h is significant（P＜0.05）and extremely significant（P＜0.01）.

2.3 MsBBX24 轉(zhuǎn)基因擬南芥陽(yáng)性苗鑒定

通過擬南芥蘸花法將含有MsBBX24基因的農(nóng)桿菌（GV3101）轉(zhuǎn)入野生型擬南芥（WT）中，通過Basta（50 mg·L-1）逐代篩選得到T2代純合種子，共篩選得到25 個(gè)純合株系。從中隨機(jī)挑選2 個(gè)轉(zhuǎn)基因株系（L8，L13）進(jìn)行陽(yáng)性鑒定。通過半定量RT-PCR 技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)基因擬南芥中MsBBX24的表達(dá)情況（圖6），在WT中沒有MsBBX24基因的表達(dá)，轉(zhuǎn)基因株L8和L13中都有目的基因表達(dá)的條帶，說明MsBBX24基因在擬南芥中成功過表達(dá)，可用作后續(xù)試驗(yàn)。

圖6 轉(zhuǎn)基因擬南芥陽(yáng)性苗驗(yàn)證Fig.6 Validation of transgenic Arabidopsis positive seedlings

2.4 MsBBX24 轉(zhuǎn)基因擬南芥耐鹽性分析

2.4.1MsBBX24轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗耐鹽性分析 為了檢測(cè)MsBBX24基因?qū)M南芥幼苗的影響，將在1/2 MS 培養(yǎng)基上生長(zhǎng)了5 d 的幼苗轉(zhuǎn)移至含有0、100 和150 mmol·L-1NaCl 的1/2 MS 固體培養(yǎng)基上進(jìn)行處理，每天觀察不同株系之間的表型差異。如圖7 所示，在0 mmol·L-1NaCl 條件下，轉(zhuǎn)基因株系L8和L13和WT 幼苗植株之間沒有差異，而在100 和150 mmol·L-1NaCl 處理?xiàng)l件下，L8和L13的幼苗根長(zhǎng)顯著長(zhǎng)于WT（P＜0.05 或P＜0.01）（圖7A，B），側(cè)根數(shù)也顯著多于WT（P＜0.05 或P＜0.01）（圖7C），說明MsBBX24基因受鹽脅迫誘導(dǎo)表達(dá)。同時(shí)在150 mmol·L-1NaCl 處理?xiàng)l件下，L8和L13的子葉綠化率顯著高于WT（P＜0.05 或P＜0.01）（圖7D）。以上結(jié)果表明：MsBBX24基因的過表達(dá)能夠提高擬南芥的耐鹽性。

圖7 WT 和轉(zhuǎn)MsBBX24 基因擬南芥的幼苗耐鹽性分析Fig.7 Salt tolerance analysis of WT and MsBBX24 transgenic Arabidopsis seedlings*和**分別表示轉(zhuǎn)基因擬南芥植株與野生型相比差異顯著（P＜0.05）和差異極顯著（P＜0.01），下同。* and ** respectively indicated the transgenic Arabidopsis plants showed significant difference（P＜0.05）and extremely significant difference（P＜0.01）compared with wild type，the same below.

2.4.2MsBBX24轉(zhuǎn)基因擬南芥耐鹽生理指標(biāo)分析 為了進(jìn)一步確定MsBBX24基因?qū)M南芥成苗耐鹽性的影響，本研究將生長(zhǎng)3 周的WT 和轉(zhuǎn)基因植株用150 mmol·L-1NaCl 溶液處理，10 d 后對(duì)IL、MDA、H2O2、Chl 和Pro 含量以及POD 和SOD 活性等生理指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明，在正常生長(zhǎng)條件下，WT 和MsBBX24轉(zhuǎn)基因植物的IL 無顯著差異，經(jīng)鹽脅迫處理后，兩種植物中的IL 都明顯升高，但轉(zhuǎn)基因植物的顯著低于WT（P＜0.05 或P＜0.01）（圖8A），表明在鹽脅迫下，轉(zhuǎn)基因擬南芥能減少植物質(zhì)膜受損程度。類似地，在鹽脅迫處理?xiàng)l件下，MsBBX24轉(zhuǎn)基因植物中的MDA 和H2O2含量顯著低于WT（P＜0.05 或P＜0.01）（圖8B，C）。同時(shí)通過測(cè)定Chl、Pro 含量和抗氧化酶活性發(fā)現(xiàn)，在正常生長(zhǎng)條件下，轉(zhuǎn)基因植物和WT 的各指標(biāo)間均無顯著差異，但在鹽脅迫條件下，轉(zhuǎn)基因株系的Chl 和Pro 含量、POD 和SOD 活性都顯著高于WT（P＜0.05 或P＜0.01）（圖8D～G）。以上結(jié)果說明轉(zhuǎn)基因株系植株的細(xì)胞質(zhì)膜受損程度更低，光合作用和滲透調(diào)節(jié)能力更強(qiáng)，同時(shí)抗氧化能力高于WT。

圖8 150 mmol·L-1 NaCl 脅迫下WT 和MsBBX24 轉(zhuǎn)基因擬南芥生理響應(yīng)Fig.8 Physiological response of WT and MsBBX24 transgenic Arabidopsis under 150 mmol·L-1 NaCl stress

3 討論

Box 蛋白家族廣泛存在于真核生物中，家族成員數(shù)量龐大，在植物色素積累、光形態(tài)發(fā)生、種子發(fā)育及逆境脅迫反應(yīng)等過程中具有重要的調(diào)節(jié)作用。鹽脅迫對(duì)植物生長(zhǎng)、發(fā)育、產(chǎn)量和品質(zhì)均有影響，表現(xiàn)為抑制植物組織和器官的生長(zhǎng)和分化，導(dǎo)致發(fā)育遲緩［22］。

本研究克隆得到的MsBBX24基因，其編碼區(qū)序列長(zhǎng)723 bp，編碼240 個(gè)氨基酸，包含兩個(gè)B-box 保守結(jié)構(gòu)域。預(yù)測(cè)其屬于不穩(wěn)定親水性蛋白，無跨膜結(jié)構(gòu)域，二級(jí)結(jié)構(gòu)的主要構(gòu)成元件是α-螺旋。氨基酸序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化樹中MsBBX24 與鷹嘴豆和蒺藜苜蓿的同源性較高，表明該蛋白在進(jìn)化上的保守性。

本研究發(fā)現(xiàn)，在鹽（150 mmol·L-1NaCl）脅迫條件下的12 h 內(nèi)，MsBBX24基因在紫花苜蓿根和葉的表達(dá)量呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)，與之前竇錦青等［23］報(bào)道的光皮樺（Betula luminifera）的BBX 類基因BlCOL13表達(dá)情況一致，同時(shí)劉欣［24］發(fā)現(xiàn)蘋果（Malus domestica）MdBBX10基因在鹽脅迫下表達(dá)量上調(diào)，本研究結(jié)果與此一致。此外，楊寧等［25］發(fā)現(xiàn)EgrBBX 家族不同基因具有不同的組織表達(dá)特異性，其中巨桉（Eucalyptus grandis）EgrBBX7基因葉的表達(dá)量也是大于根的，本研究結(jié)果與此一致。MsBBX24基因受鹽脅迫的顯著誘導(dǎo)表達(dá)，且在根和葉不同組織具有表達(dá)特異性，推測(cè)該基因在響應(yīng)鹽脅迫時(shí)在不同組織發(fā)揮的功能也可能存在差異。此外，本研究發(fā)現(xiàn)MsBBX24基因的過表達(dá)顯著提高了轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗在鹽脅迫下的根長(zhǎng)、側(cè)根數(shù)和子葉綠化率。結(jié)合本研究中MsBBX24的蛋白結(jié)構(gòu)、被鹽脅迫誘導(dǎo)表達(dá)及對(duì)鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因擬南芥表型的改善，推測(cè)MsBBX24可能具有提高植物耐鹽性的功能。

IL 是逆境傷害的一個(gè)生理指標(biāo)，植物遭受逆境傷害時(shí)細(xì)胞膜會(huì)受損，表現(xiàn)為選擇透性喪失、膜透性增加和細(xì)胞內(nèi)部分電解質(zhì)外滲［26］。MDA 是一種脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，研究表明其在植物中的積累量與細(xì)胞膜的透性變化呈正相關(guān)，作為細(xì)胞膜的受損程度的指標(biāo)［27-28］。研究結(jié)果顯示，MsBBX24基因的過表達(dá)能夠降低鹽脅迫下擬南芥的IL 和MDA，說明MsBBX24轉(zhuǎn)基因植株受到的膜脂過氧化損傷程度更低，該結(jié)果表明MsBBX24可以通過降低細(xì)胞膜損傷和膜脂過氧化來緩解鹽脅迫。Chl 是一類與光合作用有關(guān)的重要色素，常作為評(píng)價(jià)植物光合作用能力的一個(gè)重要指標(biāo)［29］，其含量的多少反映了植物光合能力的強(qiáng)弱。研究表明，鹽脅迫能夠損傷植物細(xì)胞內(nèi)的葉綠體，進(jìn)而降低植物光合作用能力［30］。本研究結(jié)果表明鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因擬南芥Chl 含量高于WT，說明轉(zhuǎn)基因擬南芥的光合能力更強(qiáng)，推測(cè)轉(zhuǎn)基因植株可能是通過提高光合作用能力來改善耐鹽性。逆境脅迫時(shí)的Pro 是公認(rèn)的滲透調(diào)節(jié)劑［31］。逆境時(shí)，植物體內(nèi)的游離氨基酸含量會(huì)明顯增加，通過平衡細(xì)胞代謝以維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的相對(duì)穩(wěn)定［32］。本研究發(fā)現(xiàn)，在鹽脅迫下MsBBX24轉(zhuǎn)基因擬南芥中Pro 積累量明顯高于WT，說明MsBBX24過表達(dá)增強(qiáng)了擬南芥轉(zhuǎn)基因植株的滲透調(diào)節(jié)能力，維持了滲透平衡，提高了耐鹽性。植物處于逆境時(shí)產(chǎn)生的活性氧（reactive oxygen species，ROS）傷害會(huì)被SOD、POD 和過氧化氫酶（catalase，CAT）組成的抗氧化酶系統(tǒng)消除和抵御，減少膜脂過氧化，在一定范圍內(nèi)維持膜穩(wěn)定，增強(qiáng)其清除超氧陰離子自由基（O2·-）和H2O2的能力，能夠保護(hù)膜結(jié)構(gòu)從而維持細(xì)胞正常的生理功能［33-34］。Liu 等［35］研究發(fā)現(xiàn)擬南芥MdBBX10的過表達(dá)可以增強(qiáng)植物在鹽脅迫下清除ROS 的能力，在本研究中，鹽脅迫下MsBBX24轉(zhuǎn)基因植株中H2O2的含量明顯降低，對(duì)應(yīng)地，SOD 和POD 的活性顯著升高，由此猜測(cè)可能是轉(zhuǎn)基因植株通過增強(qiáng)抗氧化酶系統(tǒng)來清除鹽脅迫下植物體內(nèi)增加的ROS，減輕鹽脅迫對(duì)植株造成的傷害，從而使轉(zhuǎn)基因植株具有更高的耐鹽性。

4 結(jié)論

本研究克隆了保定苜蓿的MsBBX24基因，發(fā)現(xiàn)其與蒺藜苜蓿的親緣關(guān)系最近，是不穩(wěn)定親水性蛋白，屬于BBXs 家族的成員。該基因能夠顯著響應(yīng)鹽脅迫，并具有組織表達(dá)特異性。MsBBX24基因的過表達(dá)顯著提高了轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗的根長(zhǎng)、側(cè)根數(shù)和子葉綠化率，同時(shí)降低了轉(zhuǎn)基因擬南芥的IL、MDA 和H2O2含量，提高了Chl和Pro 含量以及POD 和SOD 活性，表明MsBBX24基因具有調(diào)控植物耐鹽性的功能。因此，MsBBX24可作為紫花苜蓿耐鹽育種的候選基因，為苜蓿耐鹽品種的選育奠定了基礎(chǔ)。