甘藍(lán)型油菜葉綠素含量的主基因+多基因遺傳分析

李遠(yuǎn)紅，余坤江，何雨琦，王曉東

(1.貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院，貴州貴陽 550025； 2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所，江蘇南京 210014)

油菜是我國食用植物油的第一大來源，同時兼具觀、菜、蜜、飼、肥等[1]多維度利用價值。2020年，我國油菜種植面積、油菜籽產(chǎn)量已達(dá)3 610.7萬hm2、7 179.6萬t，在我國食用油市場中具有舉足輕重的地位[2-3]。近年來，利用雜種優(yōu)勢來大幅度提高油菜產(chǎn)量難度較大，高光效育種受到越來越多研究者的重視[4]。葉片是植物進(jìn)行光合作用的主要器官，決定植物體內(nèi)干物質(zhì)的積累。葉綠素在綠色植物進(jìn)行光合作用時起到至關(guān)重要的作用，植物吸收太陽輻射后體內(nèi)會激發(fā)反應(yīng)中心色素從而啟動光化學(xué)反應(yīng)，為生物圈提供動力。葉綠素含量的高低直接影響植物光合潛力和初級生產(chǎn)[5]，對油菜籽粒的產(chǎn)量也具有顯著影響[6-7]。因此，解析油菜葉綠素含量的遺傳機(jī)制對于推進(jìn)我國的油菜高光效育種具有重要的理論及實踐意義。

關(guān)于油菜葉綠素含量的研究報道較多，國內(nèi)外學(xué)者已對其性狀的遺傳做了相關(guān)研究。Zhao等分離出油菜黃綠葉(yvl)突變體，通過BSA-seq定位在BnaA03，全基因組測序發(fā)現(xiàn)CHLH在突變體中堿基替換，導(dǎo)致CHLH活性降低，從而影響葉綠體發(fā)育和葉綠素的合成[8]。Ye等構(gòu)建了近等基因系 (NIL)，對葉綠素基因座進(jìn)行了精細(xì)定位，研究發(fā)現(xiàn)cqSPDA2是歐洲油菜葉綠素含量的一個顯性QTL，在A02上被精細(xì)定位到 21.89～22.04 Mb 區(qū)間[9]。郎麗娜在研究油菜在鹽脅迫中的QTL時，在LG5發(fā)現(xiàn)與葉綠素相關(guān)基因座qSPAD5[10]。代文東等利用紫紅葉油菜和綠葉油菜通過DarT-seq技術(shù)對BC1群體單株進(jìn)行基因分型并構(gòu)建連鎖遺傳圖譜，共檢測出8個葉綠素含量QTL，分別位于A0l、A03、A06、A07、C01、C03和C04連鎖群上[11]。此外，有學(xué)者利用構(gòu)建的分子遺傳連鎖圖譜，定位了油菜種胚[12]、角果皮[13]部位葉綠素含量性狀相關(guān)的QTL。這些研究均根據(jù)田間各遺傳群體測量葉綠素含量來進(jìn)行遺傳分析，而通過數(shù)量性狀遺傳分離分析方法進(jìn)行深入系統(tǒng)研究的報道較少。植物主基因+多基因混合模型是蓋鈞鎰等提出來解決數(shù)量性狀遺傳的分析方法[14]，并在多種作物中已普遍運用。雖已有研究對油菜葉綠素進(jìn)行QTL定位，但葉綠素合成和調(diào)控機(jī)制仍較復(fù)雜。彭門路等以有、無突變體(yl1)雜交的6個世代(P1、P2、F1、F2、B1、B2)為材料，利用主基因+多基因混合遺傳模型對突變性狀進(jìn)行遺傳分析，結(jié)果表明甘藍(lán)型油菜葉綠素缺失性狀受1對加性-顯性主基因控制，yl1葉綠素缺失為不完全顯性遺傳[15]。筆者旨在應(yīng)用該分析方法研究甘藍(lán)型油菜葉片葉綠素含量，解析其遺傳變異規(guī)律，為相關(guān)性狀的分子標(biāo)記開發(fā)和高光效育種改良奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究以甘藍(lán)型油菜高葉綠素含量品系A(chǔ)PL01、低葉綠素含量品系Holly及2個品系雜交后衍生的198個重組自交家系群體(AH群體目前已發(fā)展到F2：13代)為材料，種植于貴州省貴陽市貴州大學(xué)教學(xué)試驗場(26°N、106°E、海拔為1 100.55 m、土壤為黃壤)。采用隨機(jī)區(qū)組試驗設(shè)計，每個品系種植4行，行距40 cm，株距20 cm，每行15株。試驗地肥力均勻一致，田間管理參照當(dāng)?shù)卮筇镌耘喙芾泶胧?。所有試驗材料均由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所提供。

1.2 葉綠素含量的測定

在2019、2020、2021年3個年份環(huán)境下，使用葉綠素計(型號：SPAD-502；品牌：柯尼卡美能達(dá)；產(chǎn)地：日本)測定APL01和Holly以及AH群體各品系9張葉片期葉片的葉綠素相對含量(SPAD值)，每個品系測量3株，每株測量3張葉(由上至下第3、4、5張葉)，每張葉測量3個點，取其平均值，測量時避開主葉脈。2019、2020、2021年3個年份環(huán)境分別用19GY、20GY、21GY表示。

1.3 統(tǒng)計分析

對2019—2020年3個年份環(huán)境的甘藍(lán)型油菜葉片葉綠素含量，利用Excel、SPSS 21.0軟件[16]進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計及群體變異分析。利用植物主基因+多基因混合遺傳模型，結(jié)合SEA-G3DH軟件對親本和AH群體3個年份環(huán)境的SPAD值進(jìn)行遺傳分析[17]。遺傳模型的選擇首先根據(jù)AIC值(Akaike’s information criterion)最小原則確定3～4個候選模型，然后對候選模型進(jìn)行適合性檢驗，以確定最適模型，最后計算最適模型下的遺傳參數(shù)。分析軟件由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)章元明教授提供。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉綠素含量的變異分析

由表1可知，在3個不同年份環(huán)境下種植的AH群體葉綠素含量的變異系數(shù)大小順序依次為21GY>19GY>20GY，說明第3個年份環(huán)境測量葉綠素含量時其變異豐度最大，而3個年份環(huán)境間群體葉綠素含量存在變異，表明該性狀受環(huán)境影響。從平均值上看，19GY，21GY的平均葉綠素含量較接近，差值僅達(dá)2.16，20GY的均值較高于19GY和21GY，20GY與19GY的差值為7.32，20GY與21GY的差值為5.16。21GY的變異系數(shù)是3個環(huán)境中最高，可見在3個年份環(huán)境下所測得的葉綠素含量，第3個環(huán)境影響最大，其次是第1個環(huán)境，最后是第2個環(huán)境。

表1 在3個年份環(huán)境下AH群體的葉綠素含量變異情況

2.2 葉綠素含量分布特征分析

從圖1可以看出，在3個年份環(huán)境下的葉綠素含量在43～66的區(qū)間呈連續(xù)的分布，表現(xiàn)為典型的數(shù)量性狀特征。19GY、21GY的葉綠素含量主要都集中在40～60的區(qū)間范圍內(nèi)，而在0～40和60以上的分布頻數(shù)較低。20GY的葉綠素含量主要集中在50～65的區(qū)間范圍內(nèi)。其群體葉綠素含量分布呈現(xiàn)為正態(tài)分布，表明該群體中葉綠素含量的遺傳符合主基因+多基因遺傳特征。

2.3 葉綠素含量遺傳模型分析

2.3.1 遺傳模型的選擇 采用是植物數(shù)量性狀主基因+多基因混合遺傳模型對親本及AH群體的葉綠素含量性狀進(jìn)行遺傳分析，估算獲得了0對主基因(0MG模型)、1對主基因(1MG模型)、2對主基因(2MG模型)、多基因(PG模型)、1對主基因+多基因(MX1模型)、2對主基因+多基因(MX2模型)、3對主基因(3MG模型)、3對主基因+多基因(MX3模型)、4對主基因(4MG模型)等9類共39種遺傳模型的極大似然函數(shù)值和AIC值(表2)。根據(jù)Akaike準(zhǔn)則，選取AIC值最小及與最小AIC值比較接近的遺傳模型作為候選模型，每個環(huán)境確定4個候選模型。用2019年葉綠素含量數(shù)據(jù)獲得19GY的候選模型為3MG-A、3MG-CEA、MX3-AI-AI、4MG-AI，用2020年葉綠素含量數(shù)據(jù)獲得20GY的候選模型為3MG-A、3MG-CEA、MX3-AI-AI、MX3-AI-A；21GY獲得候選模型為MX3-AI-AI、MX3-AI-A、MX3-A-A、4MG-A。

表2 葉綠素含量各遺傳模型的AIC值

從上述結(jié)果來看，其中2個年份環(huán)境(20GY、21GY)的最適模型皆為MX3-AI-AI，而19GY年份環(huán)境下所檢驗出的最適模型為4MG-AI，而3個年份環(huán)境下2個候選模型的AIC值(MX3-AI-AI為1 248.57，4MG-AI為1239.92)較接近，造成這個分析結(jié)果的原因可能是因為19GY的環(huán)境差異較大，葉片的葉綠素含量所受環(huán)境的影響也相對加強，結(jié)合3個環(huán)境結(jié)果，推測出AH群體葉綠素的最適模型為MX3-AI-AI。

表3 AH群體的模型適合性檢驗

2.3.3 最適模型下遺傳參數(shù)的估計 分別計算油萊AH群體在3個年份環(huán)境下葉片葉綠素含量在最適遺傳模型下的各遺傳參數(shù)，結(jié)果(表4)表明，在19GY環(huán)境下，群體葉綠素含量的3對主基因的加性效應(yīng)均表現(xiàn)為負(fù)向遺傳效應(yīng)，效應(yīng)大小順序為da>dc>db；主基因上位性效應(yīng)分別為-6.35、-6.35、-6.34、-6.34；主基因遺傳率為63.22%；多基因遺傳率為35.7%。 20GY環(huán)境下的群體葉綠素含量3對主基因的加性效應(yīng)均表現(xiàn)為負(fù)向遺傳效應(yīng)，加性效應(yīng)大小順序為da>dc>db；主基因上位性效應(yīng)分別為-6.60、-6.61、-6.60、-6.60；主基因遺傳率為73.09%；多基因遺傳率為26.32%。21GY環(huán)境下的群體葉綠素的3對主基因的加性效應(yīng)均表現(xiàn)為負(fù)向遺傳效應(yīng)，加性效應(yīng)大小順序為da>dc>db；主基因上位性效應(yīng)分別為-7.24、-7.25、-7.24、-7.24；在19GY、20GY中，主基因加性效應(yīng)和主基因上位性效應(yīng)值都是負(fù)值，說明2個效應(yīng)都能使葉綠素含量降低。在21GY中，主基因加性效應(yīng)值都為負(fù)值，主基因上位性效應(yīng)為正值，說明主基因加性效應(yīng)使葉綠素含量降低，則主基因上位性效應(yīng)提高葉綠素含量。綜上所述，AH群體葉綠素含量受主基因加性和上位性效應(yīng)調(diào)控，同時，存在明顯的多基因加性效應(yīng)影響。

連續(xù)2年3個環(huán)境的數(shù)據(jù)中，主基因遺傳率為63.22%～73.33%，多基因遺傳率在25.94%～35.7%，主基因遺傳率平均值69.88%，顯著大于多基因遺傳率，可見葉片葉綠素含量的遺傳體系中，主基因的貢獻(xiàn)率占主要部分。此外，AH群體葉綠素含量在3個環(huán)境方差都為0.66左右，說明葉綠素含量易受環(huán)境影響。

3 討論與結(jié)論

3.1 油菜葉片葉綠素含量變異豐富

自20世紀(jì)70年代以來，許多國家將遺傳改良的重點放到了提高作物光合效率上，并且明確指出提高光效是作物育種的重要內(nèi)容[18]。本研究利用APL01、Holly品系及2個品系雜交后衍生的198個重組自交家系群體，葉綠素含量在2019、2020、2021年的變異系數(shù)分別為9.57%、8.45%、10.49%，葉綠素含量(SPAD值)為50.76、58.08、52.92。從結(jié)果分析來看，薦紅舉等對連續(xù)2年588份甘藍(lán)型油菜品種的葉綠素分析后發(fā)現(xiàn)，在不同年份中葉綠素含量變化較小，變異系數(shù)分別為11.27%、12.73%[19]。有研究對紫紅葉和綠葉油菜品系構(gòu)建遺傳分離群體的葉綠素含量分析，葉綠素含量的變異系數(shù)為8.00%[11]。研究結(jié)果表明，油菜葉綠素含量變異系數(shù)較穩(wěn)定，具有豐富的變異，本研究與前人研究結(jié)果相符。而造成葉綠素含量變異的原因，主要是受環(huán)境的影響[20-21]。

表4 AH群體葉綠素含量在MX3-AI-AI模型下遺傳參數(shù)估計值

3.2 葉綠素含量受主基因+多基因共同控制

葉色調(diào)控在光合作用和干物質(zhì)生產(chǎn)中具有重要作用，明確其遺傳機(jī)制有利于后續(xù)育種實踐。關(guān)于植物葉綠素或黃化性狀的遺傳，國內(nèi)外已有較多研究，但針對甘藍(lán)型油菜葉片葉綠素含量相關(guān)QTL或候選基因的研究相對較少。本研究采用植物主基因+多基因混合遺傳模型，結(jié)合SEA-G3DH軟件得出AH群體葉綠素含量最優(yōu)遺傳模型為MX3-AI-AI，即3對加性-上位性主基因+多基因加性-上位性混合遺傳模型，與前人研究結(jié)果不盡相同。田穎等利用油菜黃化突變體L638-y與正常葉色材料2598雜交后代用于黃化基因標(biāo)記，發(fā)現(xiàn)葉色由2對隱性核基因gr1、gr2調(diào)控[22-23]。相關(guān)研究認(rèn)為，調(diào)控葉綠素含量受1對加性-顯性主基因控制，不存在多基因效應(yīng)的影響[14]。唐亮等研究了水稻群體葉綠素含量基因的遺傳規(guī)律，發(fā)現(xiàn)葉綠素含量受2對主基因+多基因共同控制[24]。可見，葉綠素含量的遺傳機(jī)制相對復(fù)雜。代文東等研究檢測出8個葉綠素含量QTL，證實葉綠素含量同時也受加性效應(yīng)的調(diào)控，加性效應(yīng)在4.99～9.20[10]。本研究加性效應(yīng)在6.35～7.25，與前人研究結(jié)果不同，為進(jìn)一步挖掘相關(guān)QTL提供參考。造成這些異同點的原因，首先是試驗材料的不同，揭示甘藍(lán)型油菜葉綠素遺傳機(jī)制的研究較少。其次，研究方法大都采用蓋鈞鎰等編制的植物數(shù)量性狀分離分析軟件。本研究采用南京農(nóng)業(yè)大學(xué)劉兵等研制的植物數(shù)量性狀分離分析Windows軟件包SEA，該軟件具有友好的操作界面，能夠計算出一階遺傳參數(shù)和部分二階遺傳參數(shù)，結(jié)果更易分析。葉綠素屬數(shù)量性狀，環(huán)境因素干擾大，大多研究群體較小，本研究擴(kuò)大育種群體規(guī)模，更利于考察該性狀。甘藍(lán)型油菜葉綠素含量性狀是由主基因控制和多基因共同控制，且主基因遺傳率顯著高于多基因遺傳率。本研究明確了甘藍(lán)型油菜主基因間作用方式為累加作用，并且得到了主基因加性效應(yīng)、主基因上位性效應(yīng)各效應(yīng)值，這為深入研究甘藍(lán)型油菜葉綠素含量性狀的遺傳機(jī)制提供了基礎(chǔ)。研究結(jié)果表明，葉綠素含量的遺傳力高，育種過程中在早期世代對葉綠素含量高的材料進(jìn)行選擇是有效的，在本試驗中，后代存在葉綠素含量超過親本的材料，說明可以采用雜交和回交方式轉(zhuǎn)移主基因，獲得超親材料。