氧化應激影響膀胱梗阻性疾病分子機制的研究進展

汪松，楊亞飛，何江樞，李嘉，龍軍 綜述 陳林，陳書練，梁國標，楊進 審校

1.遵義醫(yī)科大學，貴州 遵義 563000；2.成都大學附屬醫(yī)院泌尿外科，四川 成都 610081

膀胱出口梗阻(BOO)在老年人下尿路疾病中普遍存在，其中最常見的疾病是良性前列腺增生。膀胱出口長期的梗阻會使得膀胱的組織結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，功能減退，甚至最終導致腎臟功能障礙。其早期的臨床表現(xiàn)為尿頻、尿急、夜尿、尿流變細、尿后滴瀝及尿不盡等下尿路癥狀，這會導致生活質(zhì)量的下降，如下腹部不適、尿失禁、睡眠質(zhì)量下降甚至失眠。

氧化應激是體內(nèi)的一種偏向于氧化的狀態(tài)，主要與氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)作用失衡有關。氧化系統(tǒng)包括活性氧(ROS)、活性氮(RNS)和自由基，如超氧陰離子自由基(O2-)、羥基自由基(OH)以及非自由基，如過氧化氫(H2O2)、一氧化氮(NO)、過氧硝酸鹽及次氯酸，在一些疾病狀態(tài)下這些分子在細胞水平會升高。ROS和RNS等物質(zhì)的產(chǎn)生過多會引起多種損傷，主要包括DNA 的損傷、脂質(zhì)分子的過氧化以及一些蛋白質(zhì)合成過程中修飾的改變，此外還能引起線粒體的損傷[1]。損傷的線粒體反過來又產(chǎn)生大量的活性物質(zhì)，形成惡性循環(huán)，同時這些物質(zhì)會通過多種途徑促進炎癥的發(fā)生[1]。此外，活性氮物種(RNS)在某些生理和病理條件下起著至關重要的作用，包括心血管系統(tǒng)和惡性腫瘤[1-2]。在生理條件下ROS 和RNS 能夠調(diào)控增殖、凋亡、分化、遷移和代謝的過程，然而過量則產(chǎn)生會引起氧化應激，這將導致各種病理狀況，包括癌癥、糖尿病和心血管疾病[1]。

在多種尿路疾病引起的膀胱出口梗阻中，已有多種動物模型證實了膀胱中血流的減少和缺血缺氧[3]，并引起膀胱功能和結(jié)構(gòu)的變化，產(chǎn)生一系列下尿路癥狀。近年來的研究證實缺血和缺氧以及再灌注引起的氧化應激是引起膀胱功能和結(jié)構(gòu)障礙的重要因素，然而其導致膀胱改變的機制的研究還比較局限，因而這一主題對于了解膀胱出口梗阻的病因和致病機制至關重要。除此之外，對膀胱疾病中的氧化應激相關知識的了解為相關疾病的潛在治療策略的研究提供了重要的條件。

1 膀胱組織中的氧化應激

隨著對膀胱出口梗阻相關疾病的深入研究，大量的證據(jù)表明了缺血缺氧在膀胱梗阻性疾病中發(fā)揮著重要的作用。BOO 引起的尿液潴留和膀胱壓力的增加對膀胱壁產(chǎn)生周期性的機械擠壓，膀胱平滑肌為了克服壓力的增加而代償性的肥大和增生。增生的平滑肌和周期性的收縮與舒張使得膀胱供氧不足，并發(fā)生周期性的缺血和再灌注，這一病理過程將導致膀胱組織結(jié)構(gòu)的變化和功能障礙，有證據(jù)表明其機制與氧化應激的增加密切相關[3]。長期的缺血/再灌注產(chǎn)生大量的ROS，過多的ROS 誘導氧化應激的產(chǎn)生，通過引起脂質(zhì)的過氧化、DNA 和線粒體的損傷，一方面導致膀胱組織的損害，另一方面抑制了膀胱能量的產(chǎn)生，進而抑制了膀胱平滑肌的收縮[4]。除此之外ROS及其誘導的氧化應激激活了多條信號通路，在BOO的慢性進展過程中發(fā)揮了重要作用。有研究表明在大鼠模型中缺血再灌注所產(chǎn)生的損傷比缺血產(chǎn)生的影響更大[5]，因而ROS及其產(chǎn)生的氧化應激被認為是BOO引起膀胱功能障礙的主要原因。

2 膀胱出口梗阻中氧化應激生物標記物的變化

氧化應激引起的對組織的損傷會產(chǎn)生各種相應的產(chǎn)物分子，因而通過損傷后產(chǎn)物的檢測能夠作為氧化應激損傷的標志及其對組織損傷程度的評估。在BOO模型中，氧化應激的生物標志物的變化支持了氧化應激與膀胱功能障礙之間的關系。氧化應激所產(chǎn)生的生物標志物主要包括脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物、蛋白質(zhì)修飾的產(chǎn)物，如蛋白質(zhì)羰基以及損傷DNA 產(chǎn)生的產(chǎn)物，如8-羥基-20 脫氧鳥苷(8-OHdG)、丙二醛(MDA)、異前列素(IsoPs)[6-7]。8-OHdG是自由基誘導的氧化損傷的主要形式，是廣泛地應用在氧化應激、衰老、糖尿病和癌變的生物標志物，在人類和動物的研究中其升高可能是由于自由基對受損的細胞核或線粒體DNA的氧化攻擊形成的[8]。在BOO 模型中，8-OHeG 主要出現(xiàn)于尿液中，在血液和組織中很難檢測到或者很明顯的檢測到，尿中8-OHeG水平的變化支持了氧化應激與尿功能障礙之間的關聯(lián)。MDA是一種在不飽和脂肪酸在氧化分解的過程中由酮醛分解產(chǎn)生的生理性酮醛，作為花生四烯酸鹽代謝的副產(chǎn)物，其主要在血液中表現(xiàn)升高。MDA已經(jīng)被用作評估氧化應激和組織破壞程度的標記物[9]，在BOO模型中顯著升高[8]。IsoPs是自由基刺激脂質(zhì)過氧化的最終產(chǎn)物[9]，f2-IsoPs 是一種在ROS的作用下產(chǎn)生的穩(wěn)定的代謝產(chǎn)物，在組織中可被檢測到，而在血液和尿液中檢測不到[10]。

3 膀胱出口梗阻后的進展過程

膀胱出口長期的梗阻會使膀胱組織結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，功能減退，甚至最終導致腎臟功能障礙。膀胱出口梗阻使尿液潴留于膀胱中而不能按正常的排尿節(jié)律排出，從而引起膀胱體積增大，排尿壓力增加，膀胱過度充盈，當壓力大于出口的阻力時尿液得以排空，然而殘尿量增加，再次充盈時尿液的潴留量進一步增加，壓力也進一步增加，循環(huán)往復。周期性的膀胱過度充盈和排出引起膀胱缺血/再灌注損傷，長期的缺血/再灌注損傷及其產(chǎn)生的氧化應激引起膀胱功能變化、組織重構(gòu)等一系列進展過程，甚至最終導致膀胱功能障礙。

膀胱出口梗阻的進展分為三個時期：肥大期、代償期、失代償期[11]。肥大期是由于膀胱長期反復的充盈，體積增大，壓力增高，膀胱壁被反復拉伸，為了維持膀胱的正常功能，膀胱平滑肌增生肥大以克服排尿過程中阻力的增加，新生毛細血管大量增生以維持供氧需求的增加。隨著平滑肌和毛細血管增生的停止，逐漸由肥大期進展到了代償期，此期膀胱功能仍維持在正常范圍內(nèi)。然而隨著平滑肌的大量增生，膀胱體積增大的范圍有限，長期的缺血缺氧和慢性炎癥最終激活一系列分子機制，引起膀胱平滑肌細胞萎縮和凋亡，導致細胞數(shù)量減少和神經(jīng)元丟失，膀胱功能障礙。另外促進膀胱重構(gòu)的分子機制也會被激活，其結(jié)果是成纖維細胞被活化，最終結(jié)果是大量的膠原和細胞外基質(zhì)被大量合成并沉積于膀胱組織，導致膀胱擴張受限，收縮功能降低，最終引起腎臟功能的障礙[12]。

4 BOO病理生理過程與缺氧和氧化應激的相關性及分子機制

4.1 膀胱肥大期 膀胱肥大期平滑肌表現(xiàn)為增殖和體積增加，與平滑肌表型的轉(zhuǎn)化相關，BOO 膀胱平滑肌“肌肥大”結(jié)構(gòu)模式的特點有四個明顯的特征，包括平滑肌細胞肥大、細胞與細胞之間的連接減少、細胞外機質(zhì)沉積和血管的增生。過去的觀點認為膀胱肥大及膀胱平滑肌(SMCs)的增生主要是由尿液對膀胱壁的機械壓力引發(fā)一系列分子通路(如P38-MAPK 通路、PI3K-SGK1-Kv1.3 通路、JUN-AP-1通路等)的激活和細胞因子(如神經(jīng)生長因子、表皮生長因子樣生長因子)等及其他分子(如環(huán)氧化酶-2)的釋放而導致的，近來的研究逐漸把主要原因歸因于氧化應激和組織缺氧[13]。有研究表明氧化應激可引起多條通路引起多種生理病理功能，如ROS-P38-MAPK通路[14]、ROS-PI3K/AKt通路、RNS-TNF-α/NF-κB通路[15]。

4.1.1 一氧化氮合酶-ROS-PI3K-AKt通路 研究證實了一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)在壓力負荷的作用下引發(fā)氧化應激促進膀胱平滑肌肥厚和膀胱功能障礙的結(jié)果[16]。在BOO 的作用下一氧化氮合酶減少，同時也會使一氧化氮輔因子4 缺乏和轉(zhuǎn)變?yōu)槭Щ顮顟B(tài)，這就使得NOS 合成NO 的能力降低，導致NO 最終轉(zhuǎn)化為超氧陰離子(O2—)，稱為NOS 解偶聯(lián)[16]。壓力超負荷會觸發(fā)NOS的解偶聯(lián)，促進活性氧的產(chǎn)生，最后導致膀胱平滑肌肥厚和膀胱結(jié)構(gòu)的重塑[16]。近期的研究還闡述了部分其他導致膀胱肥大的分子機制，其主要是由缺氧和氧化應激引起膀胱平滑肌去分化，表現(xiàn)為α-平滑肌肌動蛋白、波形蛋白、結(jié)蛋白表達增加，并呈現(xiàn)為纖維化表型，其變化表現(xiàn)為膠原蛋白的增加。SMCs表型的轉(zhuǎn)化可能與PI3K-AKt通路相關[17]?；钚匝醍a(chǎn)生的氧化應激一方面引發(fā)炎癥反應，另一方面ROS本身作為生物分子激活相關通路[1]，兩者均可激活磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)，活化的PI3K進一步活化其下游的絲氨酸/蘇氨酸激酶(auto-ja kuljetusalan Ty ntekij liitto，Akt)分子，活化的AKt 促進平滑肌細胞內(nèi)α-平滑肌肌動蛋白、H3、i型膠原蛋白等合成增加，誘導SMCs 去分化并表現(xiàn)出促進纖維化的表型，最終引起膀胱壁增厚、膀胱肥大[17-18]。有研究表明抑制體內(nèi)PI3K通路可緩解因膀胱炎癥導致的膀胱肥大及膀胱的儲存功能[17]。

4.1.2 HIF 途徑 缺氧狀態(tài)下缺氧誘導因子-1(HIF-1)和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)表達顯著增加并呈時間依賴性，HIF-1α在梗阻后72 h達到頂峰，VEGF在2 h后增加兩倍，并呈時間依賴性持續(xù)[19]。HIF-1和HIF-2 是密切相關的蛋白質(zhì)復合物，分別由HIF-1α和HIF-2α組成，它們與組成型表達的HIF-1β亞單位形成異二聚體。在常氧條件下，HIF-1α亞單位迅速降解，而在低氧條件下，它被穩(wěn)定和上調(diào)[19]。HIF激活多種基因的轉(zhuǎn)錄，這些基因編碼參與廣泛的生理過程以適應低氧條件的蛋白質(zhì)，包括血管生成、細胞增殖、細胞周期控制，細胞死亡和能量代謝。增加的HIF-1 和VEGF促進膀胱組織新生血管的生成以抵抗缺氧狀態(tài)，而大量增生的血管使得膀胱壁增厚[19-20]。HIF-1也被證實可以通過其他途徑引起膀胱組織肥厚，研究表明使用HIF-1抑制物阿螺旋霉素(AlvespiMycin，17-DMAG)抑制HIF-1在膀胱出口梗阻(BOO)中引起膀胱肥大的作用，結(jié)果表明17-DMAG 可通過抑制HIF-1 而阻止膀胱體積和重量增加及膀胱肥大，并改善膀胱的功能，然而具體的分子通路需進一步探索[19]。

4.1.3 ROS-NF-κB-JMJD3 通路 先前的研究已證實了ROS可激活κ基因結(jié)合核誘導因子(nuclear factor-k-gene binding，NF-κB)通路，調(diào)節(jié)炎癥的發(fā)生。有研究證明在脂多糖(LPS)誘導的膀胱炎模型中，磷酸化的NF-κB 的表達增加，據(jù)報道，賴氨酸特異性去甲基酶6B (KDM6B，又稱JMJD3)作為NF-κB 的下游靶點，調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細胞炎癥基因的表達[21]。NF-κB通過激活JMJD3，而活化的JMJD3 通過上調(diào)周期蛋白D1(CCND1)，促進其過表達。GSK-J4 作為JMJD3 的抑制劑，能降低細胞的增殖指數(shù)。在研究中與LPS組相比，LPS+GSK-J4組CCND1的mRNA和蛋白水平均顯著降低，提示JMJD3 通過調(diào)節(jié)CCND1 的表達影響細胞增殖[21]?；罨腏MJD3 還可促進Ⅰ型/Ⅲ型膠原蛋白(COL1/3)表達的增加，進而引起膠原的沉積，在平滑肌細胞中膠原的沉積可引起平滑肌細胞的肥大。而使用NF-κB 抑制劑JSH 可顯著抑制細胞增殖，JSH還可顯著降低CCND1mRNA的表達，最終結(jié)果表明該通路可引起膀胱平滑肌增值肥大，膀胱壁增厚[21]。

4.1.4 其他分子途徑 在多發(fā)性硬化癥的研究中，氧化應激可通過激活P38-MAPK-SGK1通路引起疾病的發(fā)生和進展，而該通路在BOO中可被低壓刺激激活引起平滑肌增殖，因而在BOO中氧化應激或許可引起血清/糖皮質(zhì)激素調(diào)節(jié)激酶1(recombinant serum/glucocorticoid regulated kinase 1，SGK1)的活化成為平滑肌細胞增殖的潛在機制，有待進一步的研究證實[22-23]。缺氧和氧化應激在膀胱肥大和組織重構(gòu)中的作用的相關研究還比較局限，但是已經(jīng)有很多研究表明在BOO動物模型中逆轉(zhuǎn)缺氧和抗氧化應激的治療能夠有效地抑制膀胱組織的肥大和功能障礙以及阻止BOO 后續(xù)的一系列發(fā)展，然而其致病機制還需進一步研究和發(fā)掘。

4.2 代償期 早期缺血缺氧可促進旁觀平滑肌增生和新生血管的生成，隨著缺血缺氧的持續(xù)，梗阻的中后期出現(xiàn)嚴重的缺血再灌注損傷，平滑肌肥大/增生和新生血管的停滯，膀胱功能進入代償期，該期排出功能基本維持正常。平滑肌減少和功能減退正常：平滑肌的功能與細胞內(nèi)Ca2+的平衡相關，代償期缺血再灌注產(chǎn)生大量活性氧，活性氧將脂質(zhì)過氧化導致平滑肌膜損傷及破壞細胞器膜，導致Ca2+失調(diào)，Ca2+失調(diào)導致平滑肌功能障礙并能夠激活相關蛋白酶和脂肪酶活性增加，進一步破壞膀胱功能。另外，ROS 還可通過激活線粒體途徑引起細胞凋亡，主要機制是引起B(yǎng)cl-2相關蛋白X/B細胞淋巴瘤/白血病-2(Bax/Bcl-2)比例升高和細胞色素C的釋放。這些凋亡途徑都增加了平滑肌細胞的凋亡，使膀胱功能障礙[24]。

4.3 失代償期 如果梗阻的狀態(tài)沒有解除，膀胱周期性的收縮和舒張將會反復壓迫血管，引起周期性的缺血和再灌注，膀胱重構(gòu)將繼續(xù)進行，最終導致膀胱功能轉(zhuǎn)入失代償階段，其表現(xiàn)為膀胱順應性降低和殘余尿的增加[25]。

4.3.1 MMPS/TIMPS 途徑 膀胱功能失代償與纖維化導致膀胱順應性密切相關，纖維化主要是與細胞外基質(zhì)，如i、iii型膠原蛋白、纖黏蛋白等的沉積及彈性蛋白的減少相關。膠原和細胞外機制在細胞間的沉積主要受蛋白水解酶，即基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPS)的調(diào)節(jié)，而蛋白水解酶的活性受其抑制物，即金屬蛋白酶的組織抑制劑(TIMPS)的調(diào)節(jié)，因而蛋白水解酶與其抑制劑之間的平衡是膠原和外機制沉積與否的關鍵[26]。當細胞外基質(zhì)沉積過多或蛋白水解酶與其抑制物之間平衡失調(diào)都會導致膀胱纖維化的發(fā)生。有研究顯示在用H2O2處理后的視網(wǎng)膜細胞中TIMP-1在細胞內(nèi)表達增加，并呈H2O2依賴性，是氧化損傷引起改變的目標之一。雖然在BOO中未涉及研究，但可表明在BOO 誘導的氧化應激可使TIMP-1增加，使金屬蛋白酶及其抑制物之間的平衡失衡。還有研究顯示活性氧可以直接激活TIMP-1，并可促進其轉(zhuǎn)錄，增加其活性，加劇纖維化[26-27]。

4.3.2 TGFβ-smad1/2 途徑 轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)途徑是引起細胞外基質(zhì)沉積的最主要的通路[28]，該通路主要通過配體與受體的結(jié)合和激活產(chǎn)生作用，最終活化轉(zhuǎn)錄激活因子smad1/2，并激活啟動子和輔助因子，促進基因的轉(zhuǎn)錄。成纖維細胞的增殖和分化受該通路的調(diào)節(jié)，并合成膠原和細胞外機制。有研究表明氧化應激可激活TGF-β，引起一系列后續(xù)的反應，導致膀胱纖維化，TGF-β也可增加活性氧的產(chǎn)生并可抑制抗氧化酶的活性，TGF-β與活性氧之間的相互作用加劇了膀胱的纖維化[29-30]。

4.3.3 NLRP3-IL-1途徑 炎癥體復合物3(nucleotide-binding oligomerization domain，leucine-rich repeat and pyrin domain-containing 3，NLRP3)是引起炎癥和膀胱纖維化的關鍵物質(zhì)[31]。NLRP3 的典型功能是炎癥小體的核心組成部分，炎癥小體是由NLRP3蛋白、凋亡相關斑點樣蛋白[含有CARD結(jié)構(gòu)域(ASC)銜接蛋白]和半胱氨酸蛋白酶Caspase-1 組成的復合物。NLRP3 炎癥小體的組裝將前胱天蛋白酶-1 切割成活性形式，其介導促炎細胞因子的成熟，包括白細胞介素(IL)-1β和IL-18。IL-1β是引起纖維化的關鍵因子[32]。缺血-再灌注和壓力拉伸促進損傷相關的分子模式(damage associated molecular patterns，DAMPs)釋放，NLRP3因此被激活并產(chǎn)生IL-1β，IL-1β然后與IL-1受體1 結(jié)合并促進前膠原釋放和切割、修飾成為成熟的膠原并轉(zhuǎn)運到固有層。IL-1β也可以通過激活TGF-β，其再活化smad1/2引起細胞外基質(zhì)的沉積[32]。

4.3.4 其他途徑 有研究表明缺血-再灌注損傷能產(chǎn)生單核細胞趨化蛋白(MCP-1)，該蛋白可結(jié)合巨噬細胞的特異性受體促進巨噬細胞趨化、激活和極化成不同的亞群，其中M2群與膀胱纖維化有關，通過阻止該途徑可緩解膀胱的纖維化[33]。還有證據(jù)顯示缺血缺氧引起炎癥途徑可誘導NF-kB 活化，活化的NF-kB進一步激活下游的JMJD 分子，進一步激活COL1 和COL3 引起膠原沉積[21]。JMJD 分子還可促進炎癥介質(zhì)如白介素-11(IL-11)和白介素8(IL-8)等顯著上調(diào)，以及促進金屬蛋白酶1(TIMP1)和TIMP2的組織抑制劑的表達顯著上調(diào)，引起膀胱纖維化[21]。有研究表明一些RNA 分子也有抑制纖維化的作用，如MicroRNA101、MicroRNA-219c-5p等[30，34]。

4.3.5 神經(jīng)元丟失 膀胱功能維持正常的一個重要的因素是正常的神經(jīng)傳導，機械壓力刺激膀胱壁壓力感受器并通過感覺神經(jīng)傳入相應的刺激到中樞，中樞發(fā)出運動神經(jīng)支配膀胱平滑肌收縮引發(fā)排尿動作。缺血-再灌注引起的缺氧和氧化損傷會直接損害周圍神經(jīng)，也能減少神經(jīng)營養(yǎng)因子的產(chǎn)生從而損害其對周圍神經(jīng)的營養(yǎng)支持作用，這都會導致膀胱中神經(jīng)的退化，引起膀胱收縮功能的障礙。另外神經(jīng)營養(yǎng)因子還是抗氧化機制的重要調(diào)節(jié)劑，可誘導抗氧化酶的表達，其減少又進一步加重氧化應激引起的損傷，形成惡性循環(huán)，加劇膀胱功能的惡化[35]。

5 總結(jié)

目前的研究已經(jīng)為氧化應激作為膀胱出口梗阻(BOO)引起膀胱功能和結(jié)構(gòu)障礙的重要原因提供了大量的證據(jù)，多條在BOO進展過程中發(fā)揮作用的分子通路都證明了氧化應激作為重要環(huán)節(jié)來誘導膀胱功能和結(jié)構(gòu)的變化。然而在BOO中有許多與氧化應激相關的分子機制和病理過程仍不清楚，還需要進一步的研究來彌補這樣的空缺和推動氧化應激在BOO的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮作用的研究進展以及為克服BOO在臨床上遇到的難題提供研究證據(jù)和潛在的治療策略。