間充質(zhì)干細(xì)胞來源外泌體在骨缺損再生中的應(yīng)用與進(jìn)展

張志偉 周楠 李孟奇 張鍇 李朋

濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院創(chuàng)傷骨科，濱州 256603

骨缺損的再生修復(fù)是一個(gè)復(fù)雜的過程，會(huì)對(duì)患者生活質(zhì)量產(chǎn)生十分重要的影響。目前，自體骨等移植物已被用于骨缺損治療，但價(jià)格昂貴，給患者家庭帶來經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。近年來組織工程技術(shù)治療成為骨缺損再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的熱門話題。眾所周知，骨缺損再生主要來自骨膜不同細(xì)胞之間的相互作用，如干細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞等。研究證實(shí)足量的間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs），尤其是骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）能夠有效調(diào)控骨折周圍的微環(huán)境以促進(jìn)成骨分化。隨著研究深入，MSCs 來源外泌體，因其可傳遞功能性RNA并介導(dǎo)細(xì)胞間通訊成為學(xué)者們新的研究方向。外泌體是由雙層脂膜包圍的圓形小顆粒，其中含有特殊類型的蛋白質(zhì)和RNA，在細(xì)胞、組織器官的再生和增殖過程中有著重要作用［1］。本綜述中，我們總結(jié)了骨缺損的治療現(xiàn)狀、介紹了MSCs來源外泌體以及骨缺損再生過程中的機(jī)制和作用。

骨缺損治療現(xiàn)狀

骨缺損是指因創(chuàng)傷、疾病或其他原因?qū)е碌墓琴|(zhì)缺失并形成較大的間隙。機(jī)體可以自我修復(fù)小部分骨缺損，Mauffrey等［2］將缺損尺寸大于1～2 cm 或大于骨周徑1/2時(shí)定義為超出“臨界大小”的骨節(jié)段缺損，在沒有二次干預(yù)的情況下缺損難以通過機(jī)體調(diào)控自我愈合，同時(shí)由于骨缺損的部位及周圍軟組織狀態(tài)的影響，極易形成骨不連［3-5］。對(duì)于難以自愈的骨缺損，目前的治療方法包括：自體骨移植、異體骨移植、Ilizarov 骨橫向搬運(yùn)延長術(shù)、髓內(nèi)釘系統(tǒng)、Masquelet誘導(dǎo)膜技術(shù)、組織生物工程技術(shù)等［6-7］。

近年來，隨著對(duì)于骨組織工程技術(shù)的研究不斷深入，骨缺損的治療逐漸有了新的思路。眾所周知，骨缺損再生修復(fù)是一個(gè)多步驟、多因素的過程，其中包括骨傳導(dǎo)、骨誘導(dǎo)和骨生成，并有機(jī)械穩(wěn)定性和血管重建的支持［8］。而一般來說，組織工程將其包括的種子細(xì)胞、生長因子搭載于生物支架上以提供所需的機(jī)械支持，以及作為生物活性分子和藥物的傳遞載體［9］。并發(fā)癥較少、成骨量相對(duì)較多的組織工程技術(shù)得到研究人員的青睞；相較于骨移植，組織工程技術(shù)較少出現(xiàn)免疫排斥、帶來傳染病等問題；相對(duì)于Ilizarov技術(shù)，利用組織工程技術(shù)治療具有無需多次手術(shù)、治療周期短、感染機(jī)會(huì)小等優(yōu)勢(shì)。1981 年Takahashi 和Yamanaka［10］通過從小鼠中分離出胚胎干細(xì)胞并驗(yàn)證其具有無限生長的能力，同時(shí)能夠分化為所有3 個(gè)胚層的細(xì)胞，但由于倫理原因臨床使用人類胚胎干細(xì)胞存在困難，而隨著技術(shù)發(fā)展，之后研究者的目光轉(zhuǎn)到了目前已被廣泛使用且相對(duì)容易提取培養(yǎng)的BMSCs［9，11］。文獻(xiàn)指出骨髓是MSCs 最豐富的來源，BMSCs 自體具有強(qiáng)大的增殖能力，并能夠分化為成骨所需的細(xì)胞分泌促進(jìn)成骨的物質(zhì)，且BMSCs 在體外培養(yǎng)較為容易，能夠維持定向組織活性，目前多個(gè)研究證實(shí)BMSCs修復(fù)骨缺損并收獲良好療效［9，12］。Kanczler等［13］于2008 年的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中將體外培養(yǎng)的BMSCs移植聯(lián)合血管內(nèi)皮生長因子搭載到生物可降解聚合物支架材料放置于大鼠股骨缺損部位，結(jié)果表現(xiàn)出顯著的骨再生能力。隨著研究深入，學(xué)者們發(fā)現(xiàn)MSCs所發(fā)揮的增強(qiáng)組織再生、減少細(xì)胞損傷與再生功能在很大程度上是由其旁分泌作用而實(shí)現(xiàn)的，通過間接調(diào)控細(xì)胞間通訊發(fā)揮作用，而外泌體便是其中一種重要的旁分泌因子［14-16］。

MSCs來源外泌體的生物學(xué)特性

1.外泌體的來源與結(jié)構(gòu)

外泌體由Trams等［17］于1981 年首次被發(fā)現(xiàn)并描述為50～100 nm 的“可能具有生理功能”的小分子囊泡。首先，細(xì)胞內(nèi)溶酶體微粒內(nèi)陷形成多囊泡體，而后在多種刺激作用下與細(xì)胞膜融合，合成并通過胞吐的方式釋放到細(xì)胞外環(huán)境形成大小均一、呈杯口狀的外泌體［18］。外泌體含有脂質(zhì)、核酸、蛋白質(zhì)和信號(hào)分子，表面具有特定的蛋白標(biāo)志物，而這些蛋白標(biāo)志物根據(jù)其來源、內(nèi)吞途徑而有所不同［19-20］。但不同外泌體膜上都富含標(biāo)志性蛋白四跨膜蛋白家族表達(dá)標(biāo)志物，包括Alix、TSG101、CD9、CD81、CD63 等。首先供體細(xì)胞的質(zhì)膜內(nèi)化產(chǎn)生內(nèi)小體，之后通過內(nèi)小體分選復(fù)合體將蛋白質(zhì)和RNAs［包括長鏈非編碼RNA（lncRNA）、環(huán)狀RNA（circRNA）、信使RNA（mRNA）和微RNA（miRNA）］選擇性地包涵到多小體中，以實(shí)現(xiàn)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)。目前外泌體被定義為各種組織和細(xì)胞釋放的細(xì)胞器，可通過內(nèi)吞作用被受體細(xì)胞內(nèi)化［21］。外泌體分布廣泛，能夠從幾乎所有類型的生物體液中分離出來，如精液、唾液、尿液等［20，22-24］。外泌體的內(nèi)吞作用可以促進(jìn)蛋白質(zhì)、mRNA和miRNA 的吸收，從而影響靶細(xì)胞，同時(shí)，這些功能性RNAs 通過實(shí)現(xiàn)細(xì)胞間信號(hào)通信，進(jìn)而調(diào)節(jié)靶細(xì)胞和器官的功能、活性［25-26］。此外，外泌體中還含有多種脂肪酸、膽固醇和鞘磷脂，這些脂質(zhì)不但作為運(yùn)輸信號(hào)分子的載體，還起到調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的作用［27］。

2.外泌體的功能與特性

最初，人們認(rèn)為如果能將MSCs 募集到受損組織，便可以通過環(huán)境誘導(dǎo)自主分化以替代并填充受損部位，達(dá)到修復(fù)的作用［28-29］。而近年越來越多的研究證明是因?yàn)橥饷隗w中包含的蛋白質(zhì)和小分子RNA 能夠作為介導(dǎo)細(xì)胞間通信介質(zhì)起到了主要作用［30］。眾多研究指出外泌體內(nèi)包含的各類mRNA、miRNA 等對(duì)細(xì)胞分化、活性調(diào)節(jié)至關(guān)重要［31］。外泌體能夠在各種組織和器官的損傷中表現(xiàn)出再生修復(fù)效應(yīng)，包括皮膚組織、神經(jīng)組織、軟骨組織、肝組織、骨組織等［32-40］。諸多學(xué)者相信外泌體因其能夠促進(jìn)組織再生的能力，為其在骨再生的作用探索提供了基礎(chǔ)。同時(shí)，有學(xué)者指出外泌體因其攜帶的小分子RNA 及蛋白質(zhì)在疾病發(fā)展過程中會(huì)有明顯變化，故從血液樣本或其他體液樣本中分離的外泌體含量可以作為疾病可靠生物標(biāo)志物［41］。外泌體的性質(zhì)非常穩(wěn)定，在體內(nèi)是不可自我復(fù)制，相比干細(xì)胞而言大大降低了免疫風(fēng)險(xiǎn)。同時(shí)，外泌體能夠在-20 ℃下體外長時(shí)間保存而不變性以致?lián)p失其功能［20］。此外，外泌體與膜結(jié)合蛋白一起釋放，這些蛋白便可以很容易被改造成相應(yīng)特定組織，包括骨，并被結(jié)合到細(xì)胞中。這為外泌體的體外治療提供了必要條件。

MSCs來源外泌體在骨組織再生中的作用

隨著人們對(duì)MSCs 來源外泌體促進(jìn)骨缺損修復(fù)不斷研究與探索，MSCs 來源外泌體將會(huì)在骨缺損修復(fù)領(lǐng)域擁有廣闊的應(yīng)用前景。研究顯示外泌體能夠在骨組織再生修復(fù)中加速骨的再生血管化、通過小分子RNA 調(diào)控細(xì)胞通路、調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)等多種方式參與成骨。外泌體在以上幾個(gè)治療方式中都能夠顯示出積極的作用。

1.加速骨再生血管化

大量文獻(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)，MSCs 來源外泌體內(nèi)包含多種小分子RNA、各種細(xì)胞因子、生長因子等，能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖、調(diào)控細(xì)胞凋亡。Osugi等［42］將體外培養(yǎng)的MSCs培養(yǎng)液注入大鼠顱骨骨缺損模型，并分為MSCs/瓊脂糖組與MSC-CM（MSCs 培養(yǎng)液）組，通過Micro-CT 等技術(shù)比較發(fā)現(xiàn)MSCs/瓊脂糖組移植后骨再生明顯低于MSC-CM 組。此外，在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中團(tuán)隊(duì)假設(shè)并驗(yàn)證得出MSC-CM 具有動(dòng)員內(nèi)源性MSCs，促進(jìn)血管生成和骨再生的潛力。Furuta等［43］研究發(fā)現(xiàn)MSCs 來源的外泌體能夠通過促進(jìn)軟骨內(nèi)骨化在骨折愈合中發(fā)揮重要作用，團(tuán)隊(duì)通過在CD92/2 小鼠（已知自身產(chǎn)生外泌體量較少）骨折端注射MSCs 來源外泌體，在模型中發(fā)現(xiàn)骨折端血管形成加速，軟骨細(xì)胞肥大化較前明顯增快，在向?qū)φ战M野生小鼠骨折端注射相同量外泌體同樣發(fā)現(xiàn)骨折愈合加速。Qin等［44］相信這是外泌體中含有的小分子RNA 所起的作用，于是進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)miR-196a、miR-27a、miR-206 在BMSCs 來源的外泌體中呈現(xiàn)高表達(dá)，推測(cè)這些小分子RNA 與外泌體中含有的其他細(xì)胞因子與生長因子對(duì)成骨與加速血管化有密切關(guān)系。

2.通過信號(hào)通路調(diào)控誘導(dǎo)成骨

Liao等［31］通過構(gòu)建兔動(dòng)物模型設(shè)計(jì)對(duì)照實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)BMSCs 來源的外泌體攜帶miRNA-122-5P，在體內(nèi)能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖與分化，并同時(shí)促進(jìn)血管生成。而這一功能是通過RTK/Ras/MAPK 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑抑制SPRY2 的表達(dá)和激活RTK 的活性來實(shí)現(xiàn)的。Zhang等［40］構(gòu)建了大鼠骨不連模型，將大鼠BMSCs來源外泌體注入斷端，通過對(duì)照實(shí)驗(yàn)證明外泌體移植明顯能夠促進(jìn)大鼠股骨骨不連模型的成骨、血管生成和骨愈合過程。此外，研究團(tuán)隊(duì)利用BMP-2抑制劑的實(shí)驗(yàn)證實(shí)，BMP-2/Smad1/RUNX2信號(hào)通路在大鼠BMSCs來源外泌體誘導(dǎo)骨形成和促進(jìn)骨不連愈合中起重要作用。

3.免疫反應(yīng)促進(jìn)成骨

有文獻(xiàn)指出，MSCs 來源外泌體在免疫反應(yīng)中能發(fā)揮其一定的作用。Lin等［45］通過構(gòu)建小鼠骨折模型，并將MSCs來源外泌體搭載于水凝膠上，利用對(duì)照實(shí)驗(yàn)比較有無搭載程序性死亡受體配體1（PD-L1）、外泌體的水凝膠對(duì)骨折愈合的作用效果，證實(shí)了外泌體PD-L1 與T 細(xì)胞表面的程序性死亡受體1（PD-1）偶聯(lián)，降低免疫反應(yīng)以促進(jìn)小鼠骨折愈合，同時(shí)此實(shí)驗(yàn)證明了攜帶活性因子的外泌體可以搭載嵌入到一種新型的水凝膠中以應(yīng)用于局部骨折部位緩慢釋放，提供了一種新型支架的可行方案。一般來說，在機(jī)體損傷的情況下，體內(nèi)巨噬細(xì)胞的耗竭不利于組織的再生和修復(fù)。Kim等［46］通過研究發(fā)現(xiàn)MSCs 來源外泌體中含有白細(xì)胞介素（IL）-6、IL-12、前列腺素E2、巨噬細(xì)胞刺激因子等細(xì)胞因子以及血管內(nèi)皮生長因子、成纖維細(xì)胞生長因子等。而外泌體的注入能夠提高體內(nèi)巨噬細(xì)胞水平，以促進(jìn)組織的再生。有學(xué)者在研究中發(fā)現(xiàn)，通過在受損部位局部注射MSCs 來源外泌體能夠誘導(dǎo)M2 巨噬細(xì)胞的極化以改善炎性微環(huán)境，促進(jìn)受損界面的纖維軟骨再生，加速組織的修復(fù)進(jìn)程［47］。

外泌體在應(yīng)用中的局限性

然而在外泌體進(jìn)入臨床應(yīng)用之前，仍然有許多問題等待研究者們解決。首先，目前實(shí)驗(yàn)中提取分離外泌體大多采用超速離心法，耗費(fèi)時(shí)間長的同時(shí)得到的量較低，因此對(duì)其高效提取的研究十分重要。其次，需要了解影響調(diào)節(jié)特定生物活性分子在外泌體內(nèi)組裝的因素和機(jī)制。在不同來源的外泌體中含有的活性分子具有較大差異，例如，與成骨相關(guān)的生物因子在正常骨髓來源的MSCs 外泌體中大量表達(dá)，而在骨惡性腫瘤細(xì)胞來源的外泌體中卻提取出能夠破骨細(xì)胞增殖分化的因子，致使骨質(zhì)的破壞。同時(shí)，應(yīng)用外泌體后在體內(nèi)是否會(huì)作用于其他組織器官而引起不良反應(yīng)尚不清楚。

小結(jié)

通過簡述骨缺損再生修復(fù)的治療現(xiàn)狀，介紹了MSCs來源外泌體的結(jié)構(gòu)功能與特性，闡述了MSCs來源外泌體參與骨缺損再生方式，比較了MSCs來源外泌體與其他方式應(yīng)用于治療骨缺損再生的優(yōu)缺點(diǎn)，得出結(jié)論：外泌體能夠動(dòng)員并募集內(nèi)源性MSCs 以加速骨再生血管化、通過RTK/Ras/MAPK 信號(hào)通路誘導(dǎo)成骨、抑制免疫反應(yīng)等方式參與骨的再生。應(yīng)用外泌體治療其具有免疫風(fēng)險(xiǎn)低、易搭載等優(yōu)勢(shì)。應(yīng)用外泌體進(jìn)行治療是一種極有前景的治療方式，是骨組織工程的應(yīng)用熱點(diǎn)。外泌體在組織修復(fù)尤其是骨再生領(lǐng)域，有很大的應(yīng)用前景和研究價(jià)值，相信在不久的將來在組織工程技術(shù)促進(jìn)骨缺損再生修復(fù)中，尤其是在由創(chuàng)傷等因素造成大段骨缺損骨不連的治療等醫(yī)學(xué)難題上能夠取得突破性的進(jìn)展，從而推動(dòng)骨缺損再生領(lǐng)域醫(yī)學(xué)事業(yè)的不斷進(jìn)步。