小分子熱休克蛋白與腫瘤凋亡關(guān)系的研究進(jìn)展

王怡民 李清華

桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 廣西神經(jīng)系統(tǒng)疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心 桂林醫(yī)學(xué)院廣西腦與認(rèn)知神經(jīng)科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，桂林 541001

小分子熱休克蛋白（small heat shock proteins，sHSPs）是一類不依賴三磷酸腺苷（ATP）的分子伴侶，包括HSPB1、HSPB5、HSPB6、HSPB8等［1］。它的特征是在高度靈活可變的c端和不太保守?zé)o序的n端之間有80～100個(gè)氨基酸的保守序列，稱為晶體蛋白結(jié)構(gòu)域。晶體蛋白結(jié)構(gòu)域?qū)τ趕HSPs的二聚化和功能至關(guān)重要［2］。sHSPs 的單體分子量一般在10～42 kDa之間，但在自然狀態(tài)下，它們?cè)诓煌臈l件下形成12～32個(gè)亞基的低聚物。電子顯微鏡和X射線晶體學(xué)表明，這些低聚物形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，內(nèi)部空腔由對(duì)稱堆積的二聚亞基所組成［3］。像其他分子伴侶一樣，它們有一個(gè)高能力結(jié)合且未折疊的蛋白質(zhì)和促進(jìn)底物復(fù)合的功能。它們保護(hù)細(xì)胞免受蛋白質(zhì)聚集的影響，但必須將容易聚集的客戶蛋白釋放到其他下游伴侶，以促進(jìn)重新折疊［4］。與其他HSPs 相比，sHSPs底物結(jié)合和伴侶功能的機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

凋亡是所有細(xì)胞的一種死亡形式，腫瘤細(xì)胞也包括在內(nèi)。腫瘤細(xì)胞凋亡的發(fā)生表現(xiàn)為細(xì)胞形態(tài)學(xué)的明顯變化，包括膜漂浮、核碎裂、細(xì)胞固縮和mRNA 衰變［5-6］。最后剩下的細(xì)胞被包裝成凋亡小體，在胞吐的過程中被吞噬細(xì)胞迅速清除［7］。腫瘤凋亡的標(biāo)志性核心是半胱氨酸蛋白酶（caspases）的激活以及達(dá)到頂峰，它介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)重要蛋白質(zhì)的蛋白水解裂解。而死亡細(xì)胞到達(dá)凋亡執(zhí)行點(diǎn)的方式可以通過內(nèi)在和外在2種機(jī)制來實(shí)現(xiàn)［8］。近年來，國(guó)內(nèi)外有許多研究表示sHSPs 有可能通過凋亡途徑影響腫瘤的遷移增殖等一系列表型，以及可能對(duì)腫瘤的增殖產(chǎn)生抑制作用，本文將以上兩者關(guān)系予以綜述，以期對(duì)腫瘤的治療及研究方向給予參考。

HSPB1（HSP27）的概述與腫瘤凋亡

HSP27 是sHSPs 家族中研究較多的成員，在許多信號(hào)通路中發(fā)揮著重要作用，例如腫瘤的發(fā)生、治療抗性和抑制凋亡以及其他的通路中，和其他sHSPs 類似，它的存在也不依賴于ATP［9-10］。在一定條件下，它可以用來調(diào)節(jié)多種信號(hào)傳導(dǎo)途徑和細(xì)胞功能，這一般發(fā)生在磷酸化之后［11］。HSP27 在人類細(xì)胞中表達(dá)程度較為普遍，且在心肌、骨骼肌中高度表達(dá)［12］。HSP27 的表達(dá)在細(xì)胞生長(zhǎng)、環(huán)境應(yīng)激條件（如熱誘導(dǎo)、氧化應(yīng)激）和癌癥中都會(huì)被上調(diào)［13-14］。

有研究者在A549 細(xì)胞（人肺癌細(xì)胞）的基礎(chǔ)上，用槲皮素（HSP27 抑制劑）、KRIBB3（HSP27 磷酸化抑制劑）和SB203580 與超氧化物或細(xì)胞毒劑共同作用，以上幾組都能增加caspase-9 和caspase-3 的裂解，而使用促凋亡劑處理后凋亡增加［15］。有文獻(xiàn)指出，用pCMV6-AC-HSP27、pCMV6-AC 轉(zhuǎn)染U2OS 細(xì)胞（人骨肉瘤細(xì)胞），并與Bufalin（50 nM）或不與Bufalin 孵化48 h，與對(duì)照組相比，過表達(dá)的HSP27凋亡率明顯下降［16］。為了觀察HSP27下調(diào)對(duì)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響：Bax、Bcl-2 和PARP1，研究者觀察了光動(dòng)力療法（PDT）后KB 細(xì)胞（人口腔表皮樣癌細(xì)胞）的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示，HP（5 μM）處理HSP27 siRNA 細(xì)胞后，Bax、PARP 水平下降［17］。通過將HSP27 或c-FLIP 基因的siRNA 轉(zhuǎn)染到人前列腺癌細(xì)胞（PC-3）中，在多梯度濃度的多沙唑嗪處理后，研究者發(fā)現(xiàn)，與非沉默細(xì)胞相比，TUNEL陽性細(xì)胞的數(shù)量都有所增加。而當(dāng)他們同時(shí)將上述2 種基因轉(zhuǎn)染時(shí)，TUNEL 陽性細(xì)胞的數(shù)量增加更明顯［18］。眾所周知，TUNEL陽性細(xì)胞中會(huì)出現(xiàn)核濃縮和核碎裂，這是細(xì)胞凋亡的特征性表現(xiàn)。有研究者通過Hoechst 33258 染色檢測(cè)法檢測(cè)細(xì)胞凋亡來驗(yàn)證HSP27下調(diào)對(duì)人鼻咽癌細(xì)胞（CNE1-IR 細(xì)胞）輻射的敏感性。結(jié)果顯示在6 Gy 輻照1 d后，轉(zhuǎn)染HSP27 反義寡核苷酸（ASO）的CNE1-IR 細(xì)胞與轉(zhuǎn)染SO 的CNE1-IR 細(xì)胞相比，前者的凋亡細(xì)胞更多。此外，轉(zhuǎn)染了HSP27 ASO 的CNE1-IR 細(xì)胞在輻照后的細(xì)胞比轉(zhuǎn)染了SO 的CNE1-IR 細(xì)胞存活率降低［19］。以上結(jié)果均可說明，HSP27 在腫瘤凋亡中可以影響相應(yīng)凋亡蛋白的表達(dá)，以及影響腫瘤細(xì)胞存活率，可以為后續(xù)研究提供更寬廣的方向。

HSPB5（αβ晶體蛋白）的表達(dá)與腫瘤細(xì)胞凋亡通路

目前研究表示，HSPB5 可以保護(hù)細(xì)胞免受不利條件的影響，調(diào)節(jié)與生存和壓力恢復(fù)有關(guān)的幾個(gè)細(xì)胞過程，如蛋白質(zhì)降解、細(xì)胞骨架穩(wěn)定和細(xì)胞凋亡［20-22］。在沒有壓力誘導(dǎo)的情況下，它也可以表達(dá)。在健康成年人及生物體的發(fā)育過程中也可被檢測(cè)到［23］。例如，在骨骼肌和心肌中，HSPB5的表達(dá)對(duì)于適當(dāng)?shù)募」?jié)排列和線粒體結(jié)構(gòu)以及維持被動(dòng)硬度和氧化還原平衡至關(guān)重要［23］。

有文獻(xiàn)指出，HSPB5 可以通過與半胱天冬酶-3 酶原（procaspase-3）的結(jié)合和抑制其自身蛋白裂解進(jìn)而產(chǎn)生抗凋亡的作用，或與Bax 和Bcl-XS 結(jié)合，避免其轉(zhuǎn)入線粒體，從而有利于異常細(xì)胞增殖［24-26］。HSPB5 上調(diào)后通過與Bcl-2家族成員（如caspase-3、Bax和Bcl-XS）的直接相互作用以及Akt 和Raf/MEK/ERK 通路的組成性對(duì)細(xì)胞激活負(fù)向調(diào)控凋亡過程。CRYAB還被發(fā)現(xiàn)通過抑制Ras激活來抑制由鈣激活細(xì)胞介導(dǎo)的p53 依賴性細(xì)胞凋亡Raf/MEK/ERK 信號(hào)通路［27］。CRYAB還可以通過參與調(diào)節(jié)PKCalpha 和Raf/MEK/ERK 信號(hào)通路蛋白來阻斷UVA 細(xì)胞凋亡［28］。由于其抗凋亡作用，其也被認(rèn)為是乳腺癌中的一種癌蛋白，因?yàn)樗诘蛲龅挚怪械淖饔每梢越忉尠┘?xì)胞的侵襲性［29］。更準(zhǔn)確地說，磷酸化的HSPB5 與抗凋亡蛋白Bcl-2 相互作用，在抗癌藥物治療的細(xì)胞中可以增加凋亡。此外，在人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中，αβ 晶體蛋白在耐凋亡的侵襲性腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)。在U-373MG中，抑制αβ 晶體蛋白的表達(dá)可使腫瘤細(xì)胞對(duì)放線菌素D誘導(dǎo)的凋亡敏感［30］。

HSPB6（HSP20）

HSPB6 屬于在生物體中表達(dá)普遍的sHSPs，在平滑肌、骨骼肌和心肌細(xì)胞中表達(dá)程度最高［31-36］。大鼠比目魚肌的HSPB6表達(dá)水平也有一定程度升高［37］。HSPB6的表達(dá)有可能與熱誘導(dǎo)關(guān)系不大，因此可能不依賴于熱休克因子（HSF）-1的作用。有試驗(yàn)指出，把脊髓分離出去，去除神經(jīng)的支配，有可能導(dǎo)致大鼠比目魚肌、跖肌和長(zhǎng)收肌中的HSPB6表達(dá)減少［34，37-39］。把大鼠的膀胱結(jié)扎掉之后，在其中也檢測(cè)到HSPB6 的變化，而這種變化與前者正好相反［40］。這表明，某些生理因素和試驗(yàn)可以影響細(xì)胞內(nèi)的HSPB6水平。

有文獻(xiàn)報(bào)道，HSPB6 可以激活Huh-7 細(xì)胞的凋亡途徑并誘導(dǎo)凋亡。在caspase 信號(hào)的上游，有線粒體介導(dǎo)的系統(tǒng)，可以調(diào)節(jié)凋亡途徑，這其中就包括Bcl-2 家族［41］。Bcl-2 家族包括2 種與凋亡相關(guān)的蛋白，一種是促進(jìn)作用，另一種與之相反。眾所周知，異硫氰酸熒光素是一種常用的熒光染料，可以與磷脂酰絲氨酸結(jié)合，這種物質(zhì)一般位于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)。在凋亡早期，這種物質(zhì)可以產(chǎn)生異位，從而來到細(xì)胞表面。而碘化丙啶只能對(duì)中晚期的凋亡細(xì)胞產(chǎn)生反應(yīng)。二者結(jié)合則可分辨出凋亡的時(shí)期。有文獻(xiàn)指出，與植入LLC細(xì)胞對(duì)照組的小鼠相比，對(duì)照組、即注射了HSPB6組的腫瘤細(xì)胞上Annexin V-FITC 的結(jié)合很少。而對(duì)照組在第14 天的結(jié)合率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于HSPB6組［42］。以上結(jié)果說明，HSPB6 可以對(duì)LLC 腫瘤產(chǎn)生影響，而且這種影響一部分是通過減少細(xì)胞凋亡來實(shí)現(xiàn)的。在接下來的增殖實(shí)驗(yàn)、遷移實(shí)驗(yàn)以及血管生長(zhǎng)因子基因和蛋白定量實(shí)驗(yàn)中，都取得了與之前實(shí)驗(yàn)一致的趨勢(shì)。有文獻(xiàn)報(bào)道，將野生型HSP20 cDNA 轉(zhuǎn)染肝細(xì)胞癌（HCC）來源Huh-7細(xì)胞后，檢測(cè)了凋亡的相關(guān)指標(biāo)。結(jié)果顯示高表達(dá)HSP20的Huh-7細(xì)胞與空載組相比，PARP 的裂解明顯增加，而前者的裂解一般提示細(xì)胞發(fā)生了凋亡程序，以上提示HSP20 誘導(dǎo)caspase 級(jí)聯(lián)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［43］。眾所周知，Bcl-2家族蛋白是線粒體介導(dǎo)凋亡的關(guān)鍵死亡調(diào)節(jié)因子［41］。以上實(shí)驗(yàn)還顯示，HSP20 過表達(dá)細(xì)胞中的HSP20 蛋白與BAD、Bcl-2 或Bcl-XL 蛋白沒有免疫共沉淀，但與Bax 的結(jié)果卻相反，說明與后者可直接作用，而與前者卻沒有作用。

HSPB8（HSP22）的特點(diǎn)和腫瘤細(xì)胞凋亡

在所有sHSPs 家族中，HSPB8（也被命名為HSP22、H11、E2IG1）近年來尤其受到關(guān)注。HSPB8 在許多組織中都有表達(dá)，在人類骨骼肌和平滑肌、心臟及大腦中表達(dá)量較高。但在人類皮膚中，HSPB8卻在角質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)，角質(zhì)細(xì)胞因此表現(xiàn)出長(zhǎng)期的增長(zhǎng)潛力［44］。其他的sHSPs 主要以包含其他sHSPs 伴侶的同質(zhì)或異質(zhì)多聚體形式存在，而HSPB8 主要以單體和二聚體的平衡混合物形式存在，這點(diǎn)是兩者的區(qū)別［45］。HSPB8 可以誘導(dǎo)促凋亡和抗凋亡信號(hào)，這點(diǎn)是相互矛盾的，而這取決于細(xì)胞類型以及蛋白的表達(dá)水平［46］。一般情況下，在壓力誘導(dǎo)以及細(xì)胞類型不同的情況下，HSPB8的表達(dá)程度不盡相同，且這種程度呈正相關(guān)。

有文獻(xiàn)報(bào)道，恢復(fù)HSPB8 通過激活新的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF）-β激活的激酶1（TAK1）依賴的死亡途徑可以導(dǎo)致黑色素瘤生長(zhǎng)停滯和凋亡［47］。而Huh-7 細(xì)胞中HSPB8 蛋白的下調(diào)通過抑制PI3K/Akt/p70 S6激酶信號(hào)傳導(dǎo)明顯增強(qiáng)了TGF-α 誘導(dǎo)的細(xì)胞遷移，也表明HSPB8 在HCC 細(xì)胞遷移中的抑制作用［48］。有文獻(xiàn)指出，將轉(zhuǎn)染了HSPB8-siRNA1 和NC 的AGS 和BGC803 細(xì)胞進(jìn)行Annexin V-FITC/7AAD 染色和流式細(xì)胞儀檢測(cè)，結(jié)果表明在AGS 和BGC-803 細(xì)胞系中，HSPB8敲除對(duì)早期凋亡影響不明顯，但晚期凋亡細(xì)胞的比例增加較多［49］。這表明敲除了HSPB8后，對(duì)以上細(xì)胞系的凋亡有明顯影響，且跟細(xì)胞的時(shí)期有關(guān)。HSPB8 在胃癌細(xì)胞系中是一種促增殖的蛋白，它也可以幫助胃癌細(xì)胞逃避凋亡對(duì)其的影響，在這點(diǎn)上，HSPB8的致癌作用與大多數(shù)其他sHSPs 成員基本一致。體外下調(diào)的HSPB8 表達(dá)抑制了乳腺癌細(xì)胞的增殖，而過表達(dá)的HSPB8 則能促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖生長(zhǎng)［50］。另有文獻(xiàn)指出，HSPB8 在黑色素瘤細(xì)胞系和原發(fā)性黑色素瘤組織中的表達(dá)水平高于正常黑色素細(xì)胞［51］。綜上，根據(jù)細(xì)胞類型和條件，HSPB8可能同時(shí)顯示抗凋亡和促凋亡活性。

總結(jié)與展望

癌癥是目前威脅人類健康的其中疾病之一，且目前沒有較為有效的治療手段。在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，HSPs扮演著舉足輕重的角色，尤其是sHSPs。sHSPs 參與了腫瘤細(xì)胞多種機(jī)制，如細(xì)胞增殖、分化、侵襲等。由上所述，3 種sHSPs具有一定的抗凋亡功能，研究者認(rèn)為敲減sHSPs可能會(huì)增加腫瘤細(xì)胞對(duì)凋亡的敏感性，從而對(duì)腫瘤的治療有一定的指導(dǎo)意義。目前關(guān)于sHSPs 與腫瘤凋亡之間仍有亟待明確的問題，例如：大部分用傳統(tǒng)的凋亡途徑解釋了問題，如Bcl-2 家族蛋白、Raf/MEK/ERK 信號(hào)通路等，是否存在其他途徑，如泛素化蛋白酶體途徑或自噬溶酶體途徑；大部分研究者是通過基因敲減或過表達(dá)來實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白的調(diào)控，是否有其他方法來實(shí)現(xiàn)蛋白的過表達(dá)，抗凋亡和促凋亡的細(xì)胞系之間是否有某種聯(lián)系等，這些問題都有待于進(jìn)一步研究與探討。可以預(yù)見的是，隨著研究的深入，不斷對(duì)上下游的機(jī)制進(jìn)行探索，可能會(huì)發(fā)掘更多的聯(lián)系，以對(duì)腫瘤在凋亡方面的解釋更加明晰，從而提供一個(gè)在治療上的新思路和新策略。