白貝肉酶解工藝的優(yōu)化及其產(chǎn)物呈味特性研究

鄧宇，曹文紅,2*，陳忠琴,2，秦小明,2，高加龍,2，鄭惠娜,2，林海生,2

(1.廣東海洋大學(xué) 食品科技學(xué)院，國家貝類加工技術(shù)研發(fā)分中心(湛江)，廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點實驗室，廣東省海洋食品工程技術(shù)研究中心，廣東省海洋生物制品工程實驗室，水產(chǎn)品深加工廣東普通高等學(xué)校重點實驗室，廣東 湛江 524088；2.大連工業(yè)大學(xué)海洋食品精深加工關(guān)鍵技術(shù)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，遼寧 大連 116034)

水產(chǎn)品的風(fēng)味主要由氣味和滋味組成，揮發(fā)性的含香化合物構(gòu)成其氣味，非揮發(fā)性的呈味活性物質(zhì)構(gòu)成其滋味，滋味成分對水產(chǎn)品的風(fēng)味有重要影響[1]。呈味物質(zhì)主要包括呈味核苷酸、游離氨基酸、無機離子等，可以利用高效液相色譜儀、氨基酸分析儀、火焰原子吸收分光光度計等儀器進行檢測[2]。目前國內(nèi)外學(xué)者都對水產(chǎn)品的風(fēng)味物質(zhì)進行了廣泛的研究。Kani等[3]研究了橢圓形魷魚外套膜肌肉中的呈味成分，得出11種呈味活性物質(zhì)對該魷魚的滋味具有重大貢獻；崔妍春等[4]比較了3種不同貝類蒸煮液的呈味物質(zhì)，指出呈味核苷酸和甜菜堿對鮮味起到重要作用；錢建瑛等[5]比較了酶熱處理后文蛤的呈味物質(zhì)，指出游離氨基酸和呈味核苷酸對其鮮味有巨大貢獻。水產(chǎn)品的風(fēng)味在一定程度上反映了其新鮮程度，表明其潛在價值，對水產(chǎn)調(diào)味品的開發(fā)和利用具有指導(dǎo)意義。

白貝(Monetariamoneta)，別名貝子、貝齒、白海肥等，廣泛分布于我國南海海域，營養(yǎng)豐富，味道鮮美，價格低廉。在廣東、廣西等地區(qū)常被用來煲湯，深受消費者的喜愛[6-7]。張大為等[8]以白貝自然發(fā)酵液為分離源，從中分離得到乳酸菌并對其進行鑒定。目前國內(nèi)外針對白貝的研究相對較少，主要集中于調(diào)味液的初步研制、白貝抗氧化活性和理化性質(zhì)，尚沒有關(guān)于呈味特性的研究[9-11]。課題組前期研究顯示，白貝蛋白質(zhì)含量為10.26 g/100 g，占干質(zhì)量的58.13%；脂肪含量為1.96 g/100 g，占干質(zhì)量的11.1%；非蛋白氮含量為0.139 g/100 g，占總氮的8.47%，它是一種高蛋白、低脂肪、呈味物質(zhì)豐富的海洋貝類，因此可能是開發(fā)天然海鮮調(diào)味料的理想原料。白貝目前以直接食用為主，但在運輸和銷售過程中極易發(fā)生腐敗變質(zhì)現(xiàn)象，不僅浪費原料，而且會出現(xiàn)食品安全問題。因此，如果以白貝為原料，通過酶解等方法加工成調(diào)味品等附加值高的產(chǎn)品，將會產(chǎn)生極高的經(jīng)濟和社會效益。

本文以白貝肉為原料，通過酶解法制備白貝酶解液，并對其進行呈味分析，為白貝天然海鮮調(diào)味品的研究與開發(fā)提供了實驗數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮白貝：購自湛江市東風(fēng)市場，去殼后洗凈，將其水分瀝干后用小袋分裝(50 g)，放置于-20 ℃冰箱中備用。

動物蛋白酶(酶活100 U/mg)、菠蘿蛋白酶(酶活300 U/mg)、中性蛋白酶(酶活100 U/mg)、木瓜蛋白酶(酶活800 U/mg)、復(fù)合蛋白酶(酶活150 U/mg)：廣西龐博生物工程有限公司；甲醇(色譜級)；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

T18型高速分散機 德國艾卡儀器設(shè)備有限公司；Agilent 1200型半制備高效液相色譜儀 美國安捷倫公司；SA402B型電子舌 日本Insent公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 白貝肉酶解產(chǎn)物的制備

稱取40 g原料，按料液比1∶3 (mg/mL)加去離子水打漿，以8 000 r/min均質(zhì)2 min，調(diào)節(jié)pH后加入蛋白酶，確定酶解溫度和時間；酶解完全后，沸水浴15 min，待其冷卻至室溫后，用高速離心機10 000 r/min離心15 min(4 ℃)，用紗布過濾后取上清液，于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 白貝肉水解蛋白酶的選擇

選擇動物蛋白酶、菠蘿蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和復(fù)合蛋白酶5種蛋白酶分別對白貝肉進行酶解；按“1.3.1”調(diào)節(jié)各蛋白酶最適酶解溫度和pH，控制加酶量為3 000 U/g，酶解時間為3 h，料液比為1∶3，采用水解度(degree of hydrolysis，DH)作為測定指標，按水解度的高低篩選出最佳的水解蛋白酶。

1.3.3 白貝肉復(fù)合蛋白酶單因素實驗

根據(jù)“1.3.2”選擇水解度最高的復(fù)合蛋白酶進行單因素實驗，探究其加酶量、料液比及酶解溫度3個因素對白貝水解度的影響；設(shè)置料液比分別為1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6，酶解溫度分別為40，45，50，55，60 ℃，加酶量分別為2 000，3 000，4 000，5 000，6 000 U/g，控制酶解pH 7.0和酶解時間3 h，以水解度作為指標，篩選出最佳條件。

1.3.4 響應(yīng)面優(yōu)化白貝肉酶解工藝

在單因素實驗的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken原理，設(shè)計溫度、料液比、加酶量三因素三水平實驗，見表1。以白貝蛋白水解度為指標。

表1 響應(yīng)面實驗因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface experiment

1.3.5 酶解時間對白貝肉酶解工藝的影響

在響應(yīng)面法優(yōu)化的基礎(chǔ)上，設(shè)置酶解時間分別為1，2，3，4，5，6，7 h，酶解pH為7.0，以水解度為指標，確定最佳酶解時間。

1.3.6 主要呈味物質(zhì)測定

1.3.6.1 游離氨基酸測定

準確量取1 mL樣品，加入5 mL質(zhì)量分數(shù)為10%的三氯乙酸溶液，混勻后定容至25 mL，靜置30 min后取上清液。將上清液在4 ℃下以10 000 r/min離心20 min，用水相濾膜過濾后采用氨基酸自動分析儀對其進行分析測定。

1.3.6.2 呈味核苷酸測定

參考司蕊等的方法進行測定，取0.30 g樣品溶解完全后定容至10 mL，然后吸取5 mL溶液，向其中加入30 mL的冷高氯酸，振蕩5 min后靜置30 s，用高速離心機以8 000 r/min離心15 min后取上清液；先用KOH調(diào)pH值至6.50，放置于4 ℃冰箱中靜置30 min將鉀鹽沉淀完全，用超純水將過濾后的上清液定容至50 mL，用于HPLC分析。

HPLC條件：色譜柱為5C18-MS-Ⅱ(4.60 mm×250 mm,5 μm)；柱溫為25 ℃；檢測波長為254 nm；流動相A：0.05 mol/L KH2PO4-K2HPO4緩沖液，流動相B：0.05 mol/L KH2PO4-K2HPO4緩沖液與甲醇的混合液，進樣量為20 μL；流速為0.70 mL/min。

1.3.6.3 有機酸測定

參考饒夢微等[12]的方法略作改動，取30 mL pH為2.5的NH4H2PO4溶液加入燒杯中，稱取3.00 g樣品加入其中并超聲振蕩30 min使其完全溶解，用高速離心機以8 000 r/min離心15 min后取上清液；沉淀，按上述步驟進行重復(fù)，將兩次獲得的上清液進行合并，用超純水定容至50 mL容量瓶中用于HPLC分析。

HPLC條件：色譜柱為5C18-MS-Ⅱ(4.60 mm×250 mm,5 μm)；柱溫為25 ℃；流動相：2%的NH4H2PO4溶液；流速為0.70 mL/min；進樣量為20 μL；檢測波長為205 nm。

1.3.6.4 甜菜堿測定

取25 mL超純水，加入10.00 g樣品，溶解完全后加入150 mL的乙醇溶液，溶液合并后放置于4 ℃冰箱中冷藏一夜后，用高速離心機以8 000 r/min離心15 min后取上清液；沉淀，按上述步驟進行重復(fù)，將兩次獲得的上清液進行合并，濃縮定容后得到樣品制備液，制備液中甜菜堿含量的測定參照黃麗貞[13]的方法。

1.3.6.5 無機離子測定

Na+、K+含量：參考GB 5009.91-2017中火焰原子吸收光譜法測定；Cl-含量：參考GB 5009.44-2016測定；PO43-：參考GB 5009.87-2016測定。

1.3.6.6 滋味活性值(taste activity value,TAV)定義

呈味物質(zhì)的濃度與其呈味閾值的比值用TAV表示，當(dāng)TAV>1時，說明該化合物對滋味有貢獻[14]。

1.3.6.7 電子舌測定

將Insent電子舌系統(tǒng)進行活化，加入水相過濾后的酶解液進行測定。以參比溶液作為對照，取3次測定結(jié)果，對酶解產(chǎn)物進行滋味分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每組實驗需要進行3組平行，實驗數(shù)據(jù)以“平均值±標準差”表示，數(shù)據(jù)用JMP Pro 14軟件進行分析，通過Design-Expert 8.0.6進行響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計，采用Origin 2021作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 白貝肉水解蛋白酶的選擇

酶具有高效性和專一性，不同蛋白酶的作用位點不同，導(dǎo)致對蛋白的水解能力也不同。木瓜蛋白酶可以作用于香菇煮菇水，達到增鮮提味的作用[15]。中性蛋白酶是一種既包含內(nèi)切酶又包含外切酶的復(fù)合蛋白酶，可用于修飾豌豆蛋白液[16-17]。菠蘿蛋白酶可用于牛肉的嫩化[18]。復(fù)合蛋白酶可對牡蠣中風(fēng)味物質(zhì)進行研究[19]。

由圖1可知，不同蛋白酶的水解能力不同，復(fù)合蛋白酶的水解度較高，達到22.20%，遠高于其他4種酶(P<0.05)。因此，選擇復(fù)合蛋白酶進行后續(xù)研究。

圖1 不同蛋白酶對白貝肉蛋白水解能力的影響Fig.1 Effects of different proteases on hydrolysis ability of Monetaria moneta protein

2.2 復(fù)合蛋白酶解單因素實驗結(jié)果

酶的催化能力隨著條件的變化而變化，從溫度、料液比及加酶量3個因素探討復(fù)合蛋白酶對白貝水解能力的影響，見圖2。

圖2 不同條件對白貝肉蛋白水解度的影響Fig.2 Effects of different conditions on the DH of Monetaria moneta protein

2.2.1 溫度對白貝肉水解度的影響

蛋白酶對溫度較為敏感，合適的溫度會使蛋白酶的水解能力達到最大。由圖2 中a可知，蛋白酶水解能力先隨溫度的上升而增加，之后隨著溫度的上升反而減小，溫度為55 ℃時水解度值達到最高，為23.70%，55～60 ℃之間水解度大幅降低；降幅相較前一個溫度跨度極為顯著(P<0.05)。這是因為蛋白酶對溫度變化敏感，低于最適溫度時，未達到最佳酶活，水解度隨著溫度的上升而升高；高于最適溫度時，酶活性降低或部分活性喪失，水解度也隨之下降。因此，選擇55 ℃為優(yōu)化中心點。

2.2.2 料液比對白貝肉水解度的影響

料液比的不同會導(dǎo)致溶質(zhì)濃度的變化，因此選擇合適的料液比能使酶與底物的接觸更充分，反應(yīng)更完全。由圖2 中b可知，水解度隨著料液比的減小而增大，當(dāng)料液比減小到1∶4時，水解度達到25.30%，之后雖然料液比繼續(xù)減小，但水解度基本趨于穩(wěn)定(P>0.05)。這可能是因為當(dāng)料液比較大時，底物質(zhì)量濃度也高，從而影響酶的擴散。同時，隨著料液比的減小，底物濃度也隨之降低，當(dāng)酶與底物接觸完全時，水解度也不會隨著料液比的減小而大幅增加。同時結(jié)合用水等成本考慮，選擇料液比1∶4作為優(yōu)化中心點。

2.2.3 加酶量對白貝肉水解度的影響

由圖2中c可知，水解度隨著加酶量的增加呈現(xiàn)先快速上升后逐漸平穩(wěn)的趨勢，當(dāng)加酶量為4 000 U/g時，水解度達到26.08%且與6 000 U/g加酶量的水解度之間差異性不顯著(P>0.05)。這可能是因為隨著加酶量的不斷增加，底物與酶分子結(jié)合的可能性增大，反應(yīng)速度加快。同時酶具有專一性，只會與特定的位點相結(jié)合，當(dāng)?shù)孜锓磻?yīng)完全時，水解度不會隨著加酶量的增大而增大。因此，結(jié)合生產(chǎn)成本選擇4 000 U/g作為響應(yīng)面優(yōu)化中心點。

2.3 白貝肉水解度響應(yīng)面優(yōu)化

Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計實驗結(jié)果見表2，回歸模型分析結(jié)果見表3?？梢钥闯鯠H擬合模型的F值為37.16，對應(yīng)的P值<0.01，說明模型具有高度顯著性，表明其擬合度良好，擬合方程可用于模擬分析[20]。

表2 響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計及結(jié)果Table 2 Response surface optimization design and results

續(xù) 表

表3 DH響應(yīng)面二次模型方差分析Table 3 Variance analysis of DH response surface quadratic model

通過Design-Expert 8.0.6得出水解度擬合方程為DH=33.18+3.91A+2.67B+1.72C-0.85AB-0.66AC+1.78BC-2.46A2-3.96B2-1.71C2。

由表3可知，所選自變量對復(fù)合蛋白酶水解度的影響較大，由F值可知，溫度對水解度的影響程度最大，其次是料液比，加酶量對水解度的影響最小，水解度模型擬合系數(shù)為0.983 5，模型校正系數(shù)為0.962 3，說明該模型的擬合度和可信度較高，可用于酶解條件的分析和預(yù)測。

2.4 不同酶解時間對水解度的影響

在響應(yīng)面優(yōu)化條件基礎(chǔ)上，控制酶解pH相同，設(shè)置不同梯度酶解時間，探究其對水解度的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 酶解時間對水解度的影響Fig.3 Effect of enzymolysis time on DH

由圖3可知，水解度隨著時間的增加呈現(xiàn)先快速增加后逐漸平緩的趨勢，水解度在5 h時達到42.46%后趨于穩(wěn)定，與酶解7 h的水解度差異不顯著(P>0.05)。這是因為隨著時間的增加，底物與酶的接觸機會增大，水解度也增大；隨著酶解時間的繼續(xù)增加，底物被消耗完全，酶只會與特定位點結(jié)合，這些部位水解完全，水解度也不會增加。

2.5 白貝肉酶解產(chǎn)物主要呈味物質(zhì)含量分析

2.5.1 游離氨基酸含量分析

水產(chǎn)品中游離氨基酸有著重要的呈味作用，對其滋味有著巨大貢獻。由表4可知，白貝勻漿和酶解液均分別檢測出17種氨基酸。白貝勻漿中總游離氨基酸含量為23.93 mg/100 g，甜味和鮮味氨基酸總含量占游離氨基酸總量的59.63%，其中甜味氨基酸含量最高的是丙氨酸，占總量的28.00%；鮮味氨基酸含量最高的是谷氨酸，占總量的10.00%。酶解液中總游離氨基酸含量為62.17 mg/100 g，甜味和鮮味氨基酸含量占游離氨基酸總量的44.7%，其中甜味氨基酸含量最高的是丙氨酸，占總量的15.39%；鮮味氨基酸含量最高的是谷氨酸，占總量的9.8%。雖然酶解后鮮味和甜味氨基酸占比降低，但是鮮味氨基酸含量從3.03 mg/100 g上升到8.13 mg/100 g，甜味氨基酸含量上升到19.66 mg/100 g，說明酶解后不僅鮮、甜味氨基酸被釋放，而且苦味氨基酸也被釋放，酶解后可以增加風(fēng)味，成為制備貝類風(fēng)味基料的優(yōu)質(zhì)原料。

表4 白貝肉及其酶解物游離氨基酸含量(mg/100 g)和TAVTable 4 The content of free amino acids (mg/100 g) and TAV of Monetaria moneta and its enzymatic hydrolysates

通過各氨基酸的TAV，可直觀了解各呈味氨基酸對整體滋味的貢獻情況。白貝勻漿中丙氨酸的TAV最高(11.33)，其次為谷氨酸(8)，說明丙氨酸和谷氨酸對白貝勻漿的鮮味、甜味具有巨大貢獻。同時酶解液中所有游離氨基酸的TAV相對于酶解前都顯著提升，其中TAV最高的為谷氨酸(20.3)，其次為丙氨酸(15.95)，說明酶解更有利于呈味物質(zhì)的釋放，從而提升滋味。饒夢微等對菲律賓蛤仔肉不同提取物游離氨基酸含量進行了研究，發(fā)現(xiàn)酶解提取物中TAV最高的分別為谷氨酸和丙氨酸；司蕊等對馬氏珠母貝肉不同提取物游離氨基酸含量測定發(fā)現(xiàn)，新鮮酶解提取物中谷氨酸、精氨酸和丙氨酸的TAV最高，與本研究的結(jié)果一致。

2.5.2 核苷酸含量分析

核苷酸是一類風(fēng)味增強劑，可以與其他呈味物質(zhì)協(xié)同增鮮，對水產(chǎn)品的風(fēng)味提升有巨大作用。其中GMP、IMP和AMP是主要呈鮮核苷酸[21]。通過對魚貝類的研究發(fā)現(xiàn)，ATP的分解有兩種途徑[22]：第一種途徑是ATP→ADP→AMP→IMP→HxR→Hx，第二種途徑是ATP→ADP→AMP→AdR→HxR→Hx。

由表5可知，酶解液中只檢測出GMP和IMP兩種核苷酸，未檢測出AMP。司蕊等對馬氏珠母貝肉酶解產(chǎn)物的呈味核苷酸進行檢測，未檢測出IMP，說明不同原料中呈味核苷酸種類未必相同。推斷白貝ATP關(guān)聯(lián)產(chǎn)物的主要降解途徑可能主要以第一種為主；另外，可以推測出白貝酶解物中AMP含量低。鮮味核苷酸GMP和IMP的TAV都大于1，其中GMP的TAV最大(3.50)，可以推論其對酶解物的滋味貢獻最大。饒夢微等對菲律賓蛤仔肉酶解后的呈味物質(zhì)進行研究，發(fā)現(xiàn)GMP含量最高，與本研究結(jié)果一致。

表5 白貝肉酶解產(chǎn)物呈鮮核苷酸含量(mg/100 g)及TAVTable 5 The content of umami nucleotides (mg/100 g) and TAV of Monetaria moneta enzymatic hydrolysates

2.5.3 有機酸、有機堿含量分析

琥珀酸是貝類中呈鮮的有機酸，主要由貝類的糖原及氨基酸的降解產(chǎn)生；乳酸是反映機體代謝的重要指標，對鮮味具有增強作用；甜菜堿具有爽快的鮮甜味，這些物質(zhì)都對滋味有特殊貢獻[23]。

由表6可知，酶解液中檢測出琥珀酸、乳酸和甜菜堿，且TAV均大于1，說明對滋味都有貢獻，其中乳酸的TAV最高(50.72)，說明乳酸對酶解液的滋味貢獻較大。錢建瑛等對文蛤酶解前后呈味物質(zhì)進行分析，發(fā)現(xiàn)乳酸在有機酸含量中占比最高，這是文蛤味道鮮美的原因之一，與本研究的結(jié)果一致。

表6 白貝肉酶解產(chǎn)物有機酸、有機堿含量(mg/100 g)及TAVTable 6 The content of organic acids,organic alkali (mg/100 g) and TAV of Monetaria moneta enzymatic hydrolysates

續(xù) 表

2.5.4 無機離子含量分析

無機離子是水產(chǎn)品中不可或缺的輔助呈味成分，Na+對水產(chǎn)品中的鮮咸味具有增強作用，Cl-可以提高鮮甜味并抑制酸味，K+可以提升鮮味和整體風(fēng)味，PO43-的缺失會使整體味道下降。

由表7可知，酶解液中檢測出Na+、K+、Cl-、PO43-，且TAV均遠大于1，說明對滋味都有貢獻，其中Na+的TAV最高(28.02)，說明Na+對酶解液的滋味貢獻較大。邊昊等[24]對魚露發(fā)酵過程中的呈味物質(zhì)進行研究，發(fā)現(xiàn)Na+是對其滋味貢獻最大的無機離子，與本研究的結(jié)果一致。

表7 白貝酶解產(chǎn)物無機離子含量(mg/100 g)及TAVTable 7 The content of inorganic ions (mg/100 g) and TAV of Monetaria moneta enzymatic hydrolysates

2.6 電子舌滋味輪廓分析

電子舌檢測可以對水產(chǎn)品進行整體輪廓分析，電子舌檢測樣品的味覺值通常以參比溶液(無味點)為對照。

由圖4可知，酶解液中的酸味值、苦味回味值和咸味值均小于無味點(0)，說明酶解液中無這3種滋味[25]。酶解液中的甜味值最大(12.73)，其次是苦味值(12.61)和鮮味值(9.87)，說明其具有濃郁鮮甜的特點。甜味值最大，可能是因為酶解后甜味氨基酸得到大量釋放，甜菜堿對酶解液的甜味貢獻巨大；鮮味值含量較高，可以推斷出是游離氨基酸、鮮味核苷酸、有機酸和無機離子共同作用的結(jié)果。步營等[26]用高壓輔助法酶解藍蛤并對其進行滋味評價，電子舌分析表明，鮮味和苦味含量較高；饒夢微等對菲律賓蛤仔肉酶解后進行滋味分析，電子舌分析表明，甜味、鮮味和苦味含量較高，與本研究的結(jié)果一致。

圖4 白貝肉酶解產(chǎn)物電子舌檢測有效味覺指標雷達圖Fig.4 Radar map of effective taste indexes of Monetaria moneta enzymatic hydrolysates detected by electronic tongue

3 結(jié)論

本研究通過酶解法制備白貝肉的酶解產(chǎn)物并優(yōu)化其酶解工藝，最佳酶解工藝為：采用復(fù)合蛋白酶，加酶量4 586 U/g、料液比1∶4.4、酶解溫度58 ℃，水解度達35.58%，且酶解5 h時水解度最高，達到42.46%。白貝肉的酶解產(chǎn)物中鮮味和甜味氨基酸總含量占游離氨基酸總量的44.70%，鮮味核苷酸、有機酸、甜菜堿、無機離子等呈鮮物質(zhì)的TAV均大于1，說明這些物質(zhì)對酶解產(chǎn)物中的鮮味具有較大貢獻。電子舌味覺特征分析表明，酶解產(chǎn)物中鮮甜味和苦味特征明顯。綜上，白貝肉的酶解產(chǎn)物呈味物質(zhì)豐富，具有較強的鮮甜味，可為白貝天然海鮮調(diào)味料的開發(fā)提供理論指導(dǎo)。