響應(yīng)面法優(yōu)化抑菌洗液提取工藝的研究

彭一峰， 李文慧， 來(lái)海中， 孫琰琴,4， 徐建軍， 張 薇， 羅恒磊， 冀祖恩,

(1新疆全安藥業(yè)股份有限公司； 2新疆甘草及制品研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 新疆 庫(kù)爾勒 841000； 3中國(guó)科學(xué)院新疆理化技術(shù)研究所， 烏魯木齊 830011；4新疆凱美嘉生物科技有限公司， 新疆 昌吉 831100; 5新疆環(huán)拓生物科技有限公司， 烏魯木齊 830011)

抑菌洗液是由苦參、百部、黃柏、蛇床子、醋酸氯己定、甘草總黃酮組成，具有清熱解毒，燥濕止帶的功效，對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌病原微生物引起的婦科炎癥有較好的抗菌消炎作用，臨床多用于私處清潔和日常衛(wèi)生護(hù)理[1-3]。中藥材在治療陰道炎癥方面積累了豐富的經(jīng)驗(yàn)，在菌群平衡方面具有明顯優(yōu)勢(shì)[4-6]。本研究采用響應(yīng)曲面法優(yōu)化抑菌洗液的提取工藝，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備LMQC-80E型立式滅菌器(山東新華醫(yī)療器械股份有限公司)，SPX-150型生化培養(yǎng)箱(上海金慧科電子有限公司)；ZHJH-C1112B型超凈工作臺(tái)(上海智誠(chéng)分析儀器制造有限公司)。

1.2 藥材與試劑藥材苦參、百部、黃柏、蛇床子均在2020年9月采購(gòu)于新疆維草集藥材有限公司，由新疆全安藥業(yè)有限公司趙向英藥師鑒定為豆科植物苦參(SophoraflavescensAit.)、百部科植物直立百部[Stemonasessilifolia(Miq.)]、蕓香科植物黃皮樹(shù)(PhellodendornChinense Schneid.)、傘朵科植物蛇床[Cnidiummonnieri(L.)Cuss.]。甘草總黃酮(新疆全安藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：D2022001)。金黃色葡萄球菌(蘇州大禧生物科技有限公司，批號(hào)：CMCCB26003)，大腸桿菌(蘇州大禧生物科技有限公司，批號(hào)：CMCCB44102)，白色念珠菌(蘇州大禧生物科技有限公司，批號(hào)：CMCCF98001)。

2 方法

2.1 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)以抑菌洗液對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌抑菌圈直徑大小來(lái)判斷抑菌效果為指標(biāo)，固定其他工藝條件，依次改變煎煮提取時(shí)間(1、2、3、4、5、6 h)、煎煮次數(shù)(1、2、3、4、5、6 次)、液料比(v∶m,6∶1、7∶1、8∶1、9∶1、10∶1、11∶1)進(jìn)行測(cè)定。

2.2 抑菌實(shí)驗(yàn)測(cè)定采用梯度稀釋比濁法，將白念珠菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌配成106 CFU/mL的菌懸液備用。取上述菌懸液0.2 mL分別涂布在相應(yīng)的胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，取經(jīng)滅菌直徑為 5.5 mm的圓形濾紙片，每片滴加抑菌洗液5 μL，以生理鹽水為對(duì)照組，在37℃的環(huán)境下，將大腸桿菌和金黃色葡萄球菌培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h；在28℃的環(huán)境下，將白色念珠菌培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h。測(cè)量抑菌圈的直徑，重復(fù)測(cè)定3次，取平均值。

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)依據(jù)Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原則，在前期單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，選取對(duì)抑菌洗液中大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌等抑菌圈直徑大小影響較大的3個(gè)因素：液料比，煎煮次數(shù)和煎煮提取時(shí)間，各取3個(gè)水平分別記為水平-1、0、1，進(jìn)行因素水平共17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)曲面分析試驗(yàn)，并運(yùn)用數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，進(jìn)而得到最佳抑菌洗液中大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌抑菌效果的條件，見(jiàn)表1。

表1 3因素3水平響應(yīng)曲面分析實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表

3 結(jié)果

3.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1.1 煎煮提取時(shí)間對(duì)抑菌洗液抑菌效果的影響 當(dāng)煎煮提取時(shí)間為2 h時(shí)，抑菌洗液對(duì)大腸桿菌抑菌圈直徑為8.30 mm，對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌圈直徑為21.56 mm，對(duì)白色念珠菌抑菌圈直徑為12.00 mm。因此確定煎煮提取時(shí)間為2 h，見(jiàn)表2。

表2 煎煮提取時(shí)間對(duì)抑菌效果的影響

3.1.2 煎煮次數(shù)對(duì)抑菌洗液抑菌效果的影響 當(dāng)煎煮提取次數(shù)為2次時(shí)，抑菌洗液對(duì)大腸桿菌抑菌圈直徑為9.89 mm，金黃色葡萄球菌抑菌圈直徑為19.90 mm，白色念珠菌抑菌圈直徑為10.90 mm。因此確定煎煮提取次數(shù)為2次，見(jiàn)表3。

表3 煎煮次數(shù)對(duì)抑菌效果的影響

3.1.3 液料比對(duì)抑菌洗液中抑菌效果的影響 液料比為8倍時(shí)，抑菌洗液對(duì)大腸桿菌抑菌圈直徑為8.85 mm，金黃色葡萄球菌抑菌圈直徑為22.40 mm，白色念珠菌抑菌圈直徑為11.30 mm。因此確定液料比值為8倍，見(jiàn)表4。

表4 液料比對(duì)抑菌效果的影響

3.2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)及結(jié)果

3.2.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，選擇影響較大的3個(gè)因素：煎煮提取時(shí)間和煎煮次數(shù)，液料比，各取3個(gè)水平分別記為水平-1、0、1，進(jìn)行因素水平共17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)曲面分析試驗(yàn)，采用抑菌實(shí)驗(yàn)測(cè)定大腸桿菌抑菌環(huán)直徑、金黃色葡萄球菌抑菌環(huán)直徑、白色念珠菌抑菌環(huán)直徑大小來(lái)判斷抑菌效果，直徑越大抑菌效果越好，見(jiàn)表5。

表5 響應(yīng)曲面優(yōu)化抑菌洗液抑菌效果實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

3.2.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù) 運(yùn)用Design expert 10.0數(shù)據(jù)分析軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，設(shè)液料比、煎煮次數(shù)和煎煮提取時(shí)間分別為A、B、C，分別以抑菌洗液中大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌抑菌效果為響應(yīng)值進(jìn)行多元回歸擬合，得到二次多項(xiàng)回歸模型如下：

3.2.4 各因素的交互作用 一次項(xiàng)液料比倍數(shù)、煎煮次數(shù)、煎煮提取時(shí)間對(duì)抑菌洗液中大腸桿菌抑菌效果均具有極顯著影響(P<0.01)，大腸桿菌中各因素的主效應(yīng)關(guān)系為：B>C>A，即煎煮次數(shù)>煎煮提取時(shí)間>液料比。金黃色葡萄球菌抑菌效果分析各因素的主效應(yīng)關(guān)系為：C>B>A，即煎煮提取時(shí)間>煎煮次數(shù)>液料比。白色念珠菌抑菌效果分析各因素主效應(yīng)關(guān)系為：C>A>B，即煎煮提取時(shí)間>液料比>煎煮次數(shù)，見(jiàn)圖1-9。

表6 抑菌洗液中大腸桿菌抑菌效果模型及回歸系數(shù)的回歸分析結(jié)果

表7 抑菌洗液中金黃色葡萄球菌抑菌效果模型及回歸系數(shù)的回歸分析結(jié)果

表8 抑菌洗液中白色念球菌抑菌效果模型及回歸系數(shù)的回歸分析結(jié)果

3.3 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果根據(jù)回歸方程模型結(jié)合響應(yīng)面，得到預(yù)測(cè)的最優(yōu)條件為：液料比為7.909倍、煎煮次數(shù)為2.574次、煎煮提取時(shí)間為2.593 h。根據(jù)實(shí)際操作，將實(shí)驗(yàn)條件修正為液料比為8倍、煎煮次數(shù)為2次、煎煮提取時(shí)間為2.5 h，證實(shí)了預(yù)測(cè)值和實(shí)驗(yàn)值之間的良好相關(guān)性，表明試驗(yàn)?zāi)Ｐ涂煽俊８鶕?jù)重復(fù)性實(shí)驗(yàn)且工藝穩(wěn)定，因此適用于優(yōu)化抑菌洗液的工藝提取。優(yōu)化后的抑菌洗液提取工藝對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌的抑菌效果更好，見(jiàn)圖10-12。

圖2 液料比(A)、提取時(shí)間(C)交互作用對(duì)大腸桿菌抑菌效果的響應(yīng)圖和等高線

圖3 提取次數(shù)(B)、提取時(shí)間(C)交互作用對(duì)大腸桿菌抑菌效果的響應(yīng)圖和等高線

圖4 液料比(A)、煎煮次數(shù)(B)交互作用對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌效果響應(yīng)圖和等高線

圖5 液料比(A)、提取時(shí)間(C)交互作用對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌效果的響應(yīng)圖和等高線

圖6 提取次數(shù)(B)、提取時(shí)間(C)交互作用對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌效果的響應(yīng)圖和等高線

圖7 液料比(A)、煎煮次數(shù)(B)交互作用對(duì)白色念珠菌抑菌效果的響應(yīng)圖和等高線

圖8 液料比(A)、提取時(shí)間(C)交互作用對(duì)白色念珠菌抑菌效果的響應(yīng)圖和等高線

圖9 提取次數(shù)(B)、提取時(shí)間(C)交互作用對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌效果的響應(yīng)圖和等高線

注：1，2，3為響應(yīng)面設(shè)計(jì)中實(shí)驗(yàn)組，4為優(yōu)化工藝實(shí)驗(yàn)組。

注：1，2，3為響應(yīng)面設(shè)計(jì)中實(shí)驗(yàn)組，4為優(yōu)化工藝實(shí)驗(yàn)組。

注：1，2，3為響應(yīng)面設(shè)計(jì)中實(shí)驗(yàn)組，4為優(yōu)化工藝實(shí)驗(yàn)組。

4 討論

超聲提取[7-9]、微波提取[10]、超臨界流體提取等[11]新型藥材提取方法，設(shè)備相對(duì)昂貴，提取成本較高。結(jié)合抑菌洗液中苦參、百部、黃柏、蛇床子等中藥材理化性質(zhì)及生產(chǎn)成本方慮，采煎煮法進(jìn)行工藝提取，具有成本較低、操作簡(jiǎn)單、無(wú)溶劑殘留等優(yōu)點(diǎn)[12-15]，提取物對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌等病原微生物有較強(qiáng)抑制作用。本研究采用響應(yīng)面法優(yōu)化抑菌洗液提取工藝，工藝穩(wěn)定，簡(jiǎn)單可行，為抑菌洗液的工藝提取發(fā)展提供了理論依據(jù)。