參葛顆粒水提及純化工藝研究

張蓓 李國文

（1.上海中醫(yī)藥大學(xué)市中西醫(yī)結(jié)合臨床醫(yī)學(xué)院 上海 201203；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬上海市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院藥劑科 上海 200082）

參葛顆粒為上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院內(nèi)制劑，由丹參、葛根、炒白術(shù)、片姜黃、垂盆草、女貞子等組方，方中丹參活血化瘀；葛根清熱生津、升清排濁；白術(shù)健脾益氣、燥濕利水；姜黃芳香健胃，可活血行氣；垂盆草清熱利濕退黃；女貞子養(yǎng)陰益腎、補氣舒肝，諸藥配伍，共奏健脾祛痰、化濕活血之效。前期藥理實驗和臨床研究表明參葛顆粒對非酒精性脂肪肝病有較好的療效[1-2]。目前用于治療此病的中藥方劑眾多，常用的主要方劑有健脾疏肝方、健脾化痰方、疏肝調(diào)脂方、益氣補腎調(diào)脂方及一些自擬方劑[3]。研究表明參葛顆粒能夠顯著降低患者血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶水平（P＜0.05），具有保肝降酶的作用；還可明顯降低血清總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇水平（P＜0.05），說明其能夠改善脂質(zhì)代謝，還能夠有效改善中醫(yī)證候積分，緩解臨床癥狀（P＜0.05）[1]。參葛顆粒能增加血清脂聯(lián)素水平，激活A(yù)MP依賴的蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）信號，增加PGC1-α及Nrf2表達(dá)水平，發(fā)揮抗氧化作用。這可能是參葛方治療非酒精性脂肪性肝炎的作用機制之一[4]。方中姜黃，炒白術(shù)的主要有效成分為揮發(fā)油，由于這類成分具有較強的揮發(fā)性，故采用水蒸氣蒸餾法提取揮發(fā)油后，藥渣與其他藥材合并提取。丹參的水溶性酚酸類成分[5]、葛根中所含異黃酮類化合物均為其有效成分[6]，應(yīng)對其質(zhì)量進(jìn)行有效控制。本方藥味多、劑量大，為了最大限度地減少浸膏量，提高有效成分的含量，對參葛顆粒水提及乙醇沉淀工藝參數(shù)進(jìn)行研究，結(jié)合實際條件，確定最佳水提及純化工藝條件[7]。本實驗以水為溶媒進(jìn)行有效成分的提取，并采用乙醇沉淀的方式進(jìn)行純化，以期為該中藥制劑的臨床推廣提供技術(shù)支撐。

1 材料和方法

1.1 儀器

Agilent 1100高效液相色譜儀（美國安捷倫科技有限公司）；Kromasil 100-5 C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5.0 μm，Akzo Nobel公司）；Senco R206B 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海申生科技有限公司）；Sartorius CPA225D 電子天平（賽多利斯公司）；3K18型小型臺式冷凍離心機（美國Sigma公司）。

1.2 試藥

丹參、葛根、炒白術(shù)、片姜黃、垂盆草、女貞子均購于上海康橋中藥飲片有限公司，經(jīng)上海中醫(yī)藥大學(xué)教學(xué)實驗中心鑒定均符合2020年版《中國藥典》的標(biāo)準(zhǔn)；丹酚酸B對照品（批號11562-200908）、葛根素對照品（批號110752-200511）均購自中國藥品生物制品檢定所；乙腈和甲醇（色譜級，霍尼韋爾公司）；純化水自制；其余試劑均為市售分析純。

1.3 方法

1.3.1 丹酚酸B測定

1）對照品溶液的配制 取適量丹酚酸B對照品，精密稱定，以75%甲醇制成每1 mL含45 μg的溶液。

2）供試品溶液的配制 精密移取濃縮液0.5 mL，以75%甲醇溶解并定容至50 mL，離心（13 000 r/min，10 min）后取上清液作為供試品溶液。

3）色譜條件 流動相為甲醇-乙腈-甲酸-水（30∶10∶1∶59）；檢測波長286 nm；柱溫40 ℃；體積流量1.0 mL/min；進(jìn)樣量10 μL。

1.3.2 葛根素測定

1）對照品溶液的配制 葛根素對照品適量，精密稱定，用甲醇配制成1 mL含20 μg的溶液。

2）供試品溶液的配制 精密移取提取液0.25 mL于50 mL容量瓶中，以25%甲醇稀釋至刻度，取少量溶液離心（13 000 r/min，10 min）后吸取上清液作為供試品溶液。

3）色譜條件 流動相為甲醇-0.01% KH2PO4（28∶72）；體積流量1.0 mL/min；柱溫40 ℃；檢測波長250 nm；進(jìn)樣量20 μL。

1.3.3 工藝優(yōu)化

1）水提工藝的優(yōu)化 以浸泡時間、加水量、提取時間為考察因素，以丹酚酸B和葛根素含量為評價指標(biāo)，采用L9（34）正交試驗進(jìn)行水提工藝條件的優(yōu)選。

2）純化工藝的優(yōu)化 取水提液加入95%乙醇，考察不同濃度乙醇及沉淀次數(shù)對丹酚酸B、葛根素純化的影響，并測定其含量加權(quán)值，以二成份加權(quán)值為主要評價指標(biāo)。

2 結(jié)果

2.1 水提工藝研究

2.1.1 藥材浸泡時間的考察

按處方量稱取丹參、葛根、女貞子、垂盆草、片姜黃與炒白術(shù)藥渣（片姜黃，炒白術(shù)已提前加熱回流提取揮發(fā)油），加入其12倍量水，每隔15 min觀察藥材的浸潤程度。結(jié)果顯示，浸泡0.5 h時，藥材基本浸潤透，故浸泡時間為0.5 h。

2.1.2 水提工藝條件優(yōu)選

采用正交試驗設(shè)計，以第一次提取時間，第二、三次提取時間，加水量為考察因素，每個因素確定3個水平，選取正交表L9（34）（表1、2），以丹酚酸B和葛根素含量為評價指標(biāo)，對水提工藝進(jìn)行優(yōu)選。

表1 因素水平表

表2 正交實驗結(jié)果

2.1.3 試驗結(jié)果與分析

根據(jù)極差值大小，影響因素順序為C＞A＞B即加水量＞第一次提取時間＞第二、三次提取時間。方差分析結(jié)果顯示加水量對加權(quán)值有顯著性差異（表3），其中水平1的試驗指標(biāo)平均值最大，故加水量為12倍。而第一次提取時間和第二、三次提取時間對其無顯著性差異，采用直觀分析，根據(jù)極差值和試驗指標(biāo)值，選擇第一次提取時間為1.5 h，第二、三次提取時間在隨機誤差范圍內(nèi)，出于節(jié)約時間和能源考慮，選擇0.5 h。綜合考慮，確定最佳工藝條件為A2B1C1，即第一次提取時間為1.5 h，第二、三次提取時間為0.5 h，加水量為藥材質(zhì)量的12倍。

表3 正交試驗方差分析

2.1.4 驗證

進(jìn)行3批提取驗證試驗，結(jié)果表明，平均得膏率為29.83%，二成份加權(quán)值的平均值為4.21 mg/mL（表4）。其得膏率與二成份加權(quán)值正交實驗結(jié)果基本一致，說明該提取工藝穩(wěn)定，重現(xiàn)性良好。

表4 驗證實驗結(jié)果

2.2 純化工藝研究

2.2.1 純化方式的考察

取水提液32.5 mL，共5份。加入95%乙醇至含乙醇濃度分別為65%，70%，75%，80%，85%，靜置過夜，過濾，濾液濃縮至32.5 mL。測定丹酚酸B、葛根素含量，計算加權(quán)值。取濃縮液各20 mL真空干燥，計算得膏率。結(jié)果表明，得膏率以乙醇濃度85%時最小、70%最大；丹酚酸B、葛根素含量的加權(quán)值隨著乙醇濃度的升高變化不大?？紤]到節(jié)約成本，確定沉淀用乙醇濃度為65%（表 5）。

表5 乙醇濃度對丹酚酸B和葛根素提取的影響

2.2.2 乙醇沉淀次數(shù)考察

分別測定乙醇沉淀1次、2次、3次備用液中丹酚酸B、葛根素含量，并計算加權(quán)值。各取20 ml真空干燥，計算得膏率。結(jié)果表明，得膏率隨著乙醇沉淀次數(shù)的增多而減??；其丹酚酸B、葛根素加權(quán)值也隨著乙醇沉淀次數(shù)的增加而降低。以二成份加權(quán)值為主要評價指標(biāo)，綜合分析，確定乙醇沉淀次數(shù)為一次（表6）。

表6 乙醇沉淀次數(shù)對丹酚酸B和葛根素提取的影響

2.2.3 驗證實驗

取1倍量處方藥材（65 g），按上述方法和最佳工藝條件進(jìn)行3批提取驗證試驗，結(jié)果表明，用最佳提取工藝進(jìn)行三份驗證試驗，其得膏率和加權(quán)值均與正交實驗結(jié)果基本一致，說明該提取工藝穩(wěn)定，重現(xiàn)性良好。綜上所述，確定最佳乙醇沉淀工藝為：用65%乙醇沉淀1次（表7）。

表7 驗證實驗

3 討論

本試驗采用正交設(shè)計對水提和乙醇沉淀純化工藝進(jìn)行選擇，此試驗次數(shù)少，效果好。但考慮到實際生產(chǎn)中的成本、可行性、效率等，所以最后確定工藝參數(shù)并不一定是目前理論上的最佳選擇，往往需要根據(jù)實際情況，進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整[8]。

參葛顆粒方由多味藥組成，化學(xué)成分復(fù)雜，含丹酚酸B、異黃酮成分葛根素、糖類等多種成分。本方中脂溶性與水溶性成分都較多[9-10]。其中白術(shù)與片姜黃主要有效成分為揮發(fā)油，在制劑中易揮發(fā)，失去其功用，故在水提工藝前[11]，采用水蒸氣蒸餾法對炒白術(shù)、片姜黃中的揮發(fā)油進(jìn)行提取[12]，提取后的藥渣在水提工藝中和方中所有藥味一起提取，過程中不會造成處方中成分的流失，也不影響處方的工藝參數(shù)。本試驗優(yōu)選出的參葛顆粒最佳水提和純化工藝穩(wěn)定，具有良好的重現(xiàn)性和可操作性，可為實際生產(chǎn)提供參考。