間充質(zhì)干細(xì)胞在組織修復(fù)和再生中應(yīng)用的研究進(jìn)展

蔡海軍 綜述，簡華剛 審校

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院急診外科 400010)

再生醫(yī)學(xué)是指利用生物學(xué)和工程學(xué)的理論方法促進(jìn)受損組織的修復(fù)和再生，使機(jī)體恢復(fù)正常的組織特征與功能。細(xì)胞和基因治療與組織工程的結(jié)合是目前再生醫(yī)學(xué)的主要研究方向，對徹底治療疾病和損傷具有巨大的潛力。間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是一種具有自我更新能力和多向分化潛能的多系細(xì)胞，是再生醫(yī)學(xué)治療領(lǐng)域中應(yīng)用最廣泛的細(xì)胞來源，在組織修復(fù)愈合和再生中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[1]。本文就MSCs的功能特性及其在組織修復(fù)和再生中的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 MSCs概述

20世紀(jì)60年代，F(xiàn)RIEDENSTEIN等首次從骨髓中分離出MSCs，其為一種非造血干細(xì)胞。2006年，國際細(xì)胞治療學(xué)會提出了定義MSCs的3個最低標(biāo)準(zhǔn)：(1)MSCs在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下具有塑料粘附性；(2)MSCs表達(dá)CD105、CD73和CD90，且缺乏造血標(biāo)志物CD45、CD34、CD14或CD11b、CD79α或CD19和人類白細(xì)胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)-DR的表達(dá);(3)MSCs在體外具有分化成成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和成軟骨細(xì)胞的能力[2]。

MSCs豐富的來源是其廣泛研究和應(yīng)用的重要基礎(chǔ)，可以從骨髓、牙髓、脂肪、滑膜、臍帶、羊膜和胎盤等多種組織中分離和培養(yǎng)。脂肪組織在人體內(nèi)特別豐富且容易獲得，這使它成為最安全、最可靠的干細(xì)胞分離場所[3]。人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUC-MSCs)主要來源于臍帶血、沃頓氏膠、血管及其周圍組織[4]，被認(rèn)為比骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BM-MSCs)和脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(adipose-derived mesenchymal stem cells,AD-MSCs)具有更高的增殖和克隆能力。

MSCs具有獨(dú)特的生物學(xué)特性和功能：(1)MSCs具有強(qiáng)大自我更新能力。(2)MSCs具有多向分化潛能，即可塑性。MSCs不僅能分化成各種組織，如骨、軟骨、肌肉、脂肪、肌腱、韌帶、真皮、椎間盤等[5]，還能分化成非中胚層細(xì)胞系，如肝細(xì)胞、神經(jīng)元樣細(xì)胞和胰腺細(xì)胞等。(3)MSCs具有抗炎和免疫調(diào)節(jié)特性[6]。(4)MSCs具有趨向性和歸巢能力[4]，能夠向損傷、炎癥和腫瘤的部位遷移及定向遷移到特定的組織。(5)MSCs可以表達(dá)和分泌多種生物活性因子，包括細(xì)胞因子、生長因子和趨化因子，這些細(xì)胞因子參與MSCs的旁分泌活動[7]。MSCs的這些特性和功能使其成為再生醫(yī)學(xué)中最有希望的候選者，在組織再生和修復(fù)方面得到了廣泛的研究。

2 MSCs的多向分化潛能

MSCs具有多向分化潛能，能定向分化成各種組織。MSCs高成骨分化的特性被廣泛應(yīng)用于骨和軟骨損傷修復(fù)[8]。骨缺損通常伴隨著創(chuàng)傷、關(guān)節(jié)翻修或腫瘤切除手術(shù)的恢復(fù)，自體骨移植是治療的金標(biāo)準(zhǔn)，但其存在許多缺點(diǎn)，包括自體骨供應(yīng)有限、手術(shù)時間和出血量增加、供體部位骨結(jié)構(gòu)暫時中斷、異體骨移植有排斥反應(yīng)和(或)感染的風(fēng)險。因此，以MSCs為基礎(chǔ)的骨組織工程被認(rèn)為是一種有希望和可行的骨結(jié)構(gòu)和功能修復(fù)的治療方法。在坐骨神經(jīng)損傷模型中，通過局部植入MSCs，可以促進(jìn)損傷部位神經(jīng)突和血管的生長，促進(jìn)靶肌的神經(jīng)再生[9]。MSCs在減輕心肌損傷中的作用于2002年首次被報道[10]，純化的BM-MSCs移植到小鼠心肌后可分化為心肌細(xì)胞。在體外誘導(dǎo)hUC-MSCs分化為組織工程角膜內(nèi)皮，移植可以維持角膜厚度和透明度，組織工程角膜內(nèi)皮可能被用作治療角膜內(nèi)皮疾病的異體細(xì)胞來源[11]。

3 MSCs的免疫調(diào)節(jié)能力

MSCs具有固有的免疫調(diào)節(jié)特性[12]，包括抗炎、免疫調(diào)節(jié)和免疫抑制能力。MSCs參與先天免疫和適應(yīng)性免疫，主要通過細(xì)胞間接觸和分泌細(xì)胞因子、免疫細(xì)胞如T細(xì)胞、B細(xì)胞、自然殺傷(natural killer，NK)細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞(dentritic cell，DC)和中性粒細(xì)胞相互作用發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)功能[13]。MSCs獨(dú)特的免疫調(diào)節(jié)特性使其成為修復(fù)慢性炎癥、移植物抗宿主病、過敏性疾病等自身免疫性疾病引起的組織/器官損傷的寶貴細(xì)胞類型。

自身免疫性疾病與宿主免疫系統(tǒng)、慢性炎癥和對自身抗原的免疫反應(yīng)有關(guān)，會導(dǎo)致多個組織的損傷和衰竭。MSCs在自身免疫性疾病(包括類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化癥、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、炎癥性腸病、自身免疫性肝病和干燥綜合征)的治療中具有積極影響[14]。MSCs能夠在受損的心肌組織中建立穩(wěn)定的炎癥微環(huán)境，其免疫調(diào)節(jié)功能可能是治療心血管疾病的一種新的治療策略[15]。MSCs可通過抑制促炎因子[如白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-1β、IL-6、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α、干擾素-γ等]的表達(dá)和增加抗炎因子(如IL-10、IL-4、IL-13、IL-35、轉(zhuǎn)化生長因子-β等)的表達(dá)發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用促進(jìn)周圍神經(jīng)損傷的修復(fù)和再生[16]。

4 MSCs的旁分泌能力

4.1 旁分泌因子和條件培養(yǎng)基

目前多項(xiàng)研究表明，在組織修復(fù)過程中，移植的MSCs可通過分泌旁分泌因子，即能夠分泌有助于組織修復(fù)再生的趨化因子、細(xì)胞因子和生長因子來促進(jìn)損傷組織的愈合[17]。hUC-MSCs分泌4種主要因子，即血管生成素、白細(xì)胞介素-8、單核細(xì)胞趨化蛋白-1和血管內(nèi)皮生長因子，提高小鼠后肢缺血模型的血管再生能力[18]。hUC-MSCs衍生的內(nèi)皮細(xì)胞的分泌因子中富集5種可溶性蛋白質(zhì)，即血管生成素-1、血管生成素-2、成纖維細(xì)胞因子、基質(zhì)金屬蛋白酶-9和血管內(nèi)皮生長因子，可以促進(jìn)2型糖尿病小鼠模型的傷口愈合[19]。

MSCs條件培養(yǎng)基(mesenchymal stem cell-conditioned media,MSC-CM)也被用于組織修復(fù)，MSC-CM中含有MSCs分泌的細(xì)胞因子，MSC-CM的使用成為干細(xì)胞治療中一種無細(xì)胞治療方法。研究發(fā)現(xiàn)，人臍帶MSC-CM中含有許多與皮膚再生相關(guān)的旁分泌因子，如上皮生長因子、堿性成纖維細(xì)胞生長因子、血小板衍生生長因子、肝細(xì)胞生長因子、Ⅰ型膠原，特別是其中一種再生因子，即生長分化因子-11通過刺激人真皮成纖維細(xì)胞的生長和細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生來誘導(dǎo)皮膚傷口愈合[20]。骨髓MSC-CM可以保護(hù)H9c2心肌細(xì)胞免受缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的損傷，其機(jī)制是通過調(diào)節(jié)Notch2/mTOR/自噬信號通路介導(dǎo)的，為治療心肌缺血/再灌注損傷及其他缺血性疾病提供了新的見解[21]。

4.2 外泌體

外泌體由MSCs通過旁分泌信號通路分泌，由內(nèi)溶酶體微粒內(nèi)陷或向內(nèi)出芽形成多泡體，隨后多泡體外膜與細(xì)胞膜融合而產(chǎn)生[22]。外泌體分布廣泛，存在于各種體液中，如血液、尿液、唾液、腦脊液、乳汁和汗液[7]。外泌體是具有脂質(zhì)雙層膜的納米級細(xì)胞外囊泡，在顯微鏡下呈杯狀結(jié)構(gòu)，直徑為30～120 nm，密度為1.13～1.19 g/mL，包含脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸，如DNA、mRNA、非編碼RNA[包括微RNA(microRNA，miRNA)和長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA，LncRNA)]等[22]，表達(dá)特異膜蛋白CD9、CD63和CD81等。外泌體是促進(jìn)細(xì)胞間通信的重要介質(zhì)，不需要細(xì)胞與細(xì)胞直接接觸，且具有靶向傳遞、低免疫原性和高修復(fù)性的優(yōu)點(diǎn)，在組織修復(fù)和再生中具有關(guān)鍵作用，外泌體已經(jīng)成為再生醫(yī)學(xué)發(fā)展新方向。

外泌體通過其包含的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸和其他生物活性分子在MSCs及其靶細(xì)胞之間相互轉(zhuǎn)移發(fā)揮作用。源自硬膜外脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(epidural fat mesenchymal stem cells,EF-MSCs)的外泌體可以改善大鼠脊髓損傷后的神經(jīng)功能恢復(fù)，其潛在的分子機(jī)制與抑制NLRP3炎性小體激活，降低促炎因子IL-1β、IL-18和TNF-α的表達(dá)，減少神經(jīng)元凋亡有關(guān)[23]。嗅鞘細(xì)胞有利于神經(jīng)再生，但受缺氧環(huán)境的限制，hUC-MSCs來源的外泌體可調(diào)節(jié)缺氧引起的病理損傷，嗅鞘細(xì)胞和外泌體聯(lián)合可以促進(jìn)坐骨神經(jīng)再生和功能恢復(fù)[24]。hUC-MSCs衍生的外泌體可通過減少氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)來調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞功能，從而促進(jìn)血管生成并最終加速糖尿病傷口的愈合[25]。MSCs衍生的細(xì)胞外囊泡可以抑制輔助型T細(xì)胞(helper T cell，Th)1、Th17和M1巨噬細(xì)胞等多種促炎細(xì)胞的活化和增殖，減少促炎細(xì)胞因子(IL-1β、IL-6)的分泌，同時促進(jìn)M2巨噬細(xì)胞和調(diào)節(jié)型T細(xì)胞等抗炎細(xì)胞的增殖，增加抗炎細(xì)胞因子(轉(zhuǎn)化生長因子-β、IL-10)的分泌，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，改善肝臟炎癥，從而緩解不同種類的肝臟疾病，包括非酒精性脂肪肝、自身免疫性肝炎、急性肝衰竭、肝纖維化和肝缺血再灌注損傷等[26]。

外泌體中的LncRNA在組織修復(fù)與損傷中的作用在越來越多的研究中被發(fā)現(xiàn)。miRNA被認(rèn)為是一種長度約為22個核苷酸的非編碼RNA，是主要的外泌體效應(yīng)分子之一，可調(diào)控基因表達(dá)，參與多種生理病理過程，包括細(xì)胞分化、凋亡、血管生成和炎癥通路。研究發(fā)現(xiàn)，在具有施旺細(xì)胞表型分化的AD-MSCs分泌的外泌體中發(fā)現(xiàn)了更多的miRNA，如miR-132-3p和miR-199b-5p，與神經(jīng)保護(hù)、抗炎和血管生成高度相關(guān)，能下調(diào)M1巨噬細(xì)胞的促炎基因表達(dá)和細(xì)胞因子分泌，保護(hù)大鼠施旺細(xì)胞免受氧化應(yīng)激，并促進(jìn)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移和血管生成，以及誘導(dǎo)多能干細(xì)胞分化的感覺神經(jīng)元軸突生長，增強(qiáng)神經(jīng)再生[27]。hUC-MSCs衍生外泌體中的miR-140-3p可沉默糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)激酶1，抑制炎癥、氧化應(yīng)激和纖維化，減輕類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎大鼠的關(guān)節(jié)損傷[28]。外泌體中的LncRNA在組織修復(fù)與損傷中也發(fā)揮重要的作用。來自經(jīng)巨噬細(xì)胞遷移抑制因子預(yù)處理的MSCs的外泌體通過轉(zhuǎn)移LncRNA-NEAT1抑制miR-221-3p，并導(dǎo)致Sirt2激活，在阿霉素誘導(dǎo)的心肌病中恢復(fù)心功能并發(fā)揮抗衰老作用[29]。AD-MSCs在缺氧條件下分泌的外泌體中LncGm37494表達(dá)增加，通過抑制miR-130b-3p和促進(jìn)過氧化物酶體增殖物激活受體γ的表達(dá)，加速了小膠質(zhì)細(xì)胞M1/M2的極化，抑制炎癥因子表達(dá)，促使功能恢復(fù)，有效修復(fù)脊髓損傷[30]。

5 MSCs的臨床應(yīng)用

目前在Clinicaltrials.gov上已經(jīng)列出了超過1 000項(xiàng)關(guān)于“MSCs”的臨床試驗(yàn)研究，MSCs治療的疾病包括自身免疫性疾病(如炎癥性腸病、1型糖尿病)、移植物抗宿主病、骨科疾病(如膝關(guān)節(jié)炎、退行性椎間盤疾病)、心肌病、肺部疾病(如急性呼吸窘迫綜合征、慢性阻塞性肺疾病)、急慢性創(chuàng)面修復(fù)(如燒傷、糖尿病足)、神經(jīng)退行性疾病(如帕金森病)等，MSCs的臨床研究正在快速發(fā)展。在一項(xiàng)前瞻性、單盲、隨機(jī)對照的初步研究中，15例膝骨關(guān)節(jié)炎患者經(jīng)關(guān)節(jié)內(nèi)注射自體骨髓濃縮液和富血小板血漿治療12個月后，疼痛減輕、運(yùn)動功能及與膝關(guān)節(jié)相關(guān)的生活質(zhì)量明顯改善[31]。一項(xiàng)人體試驗(yàn)首次在9例慢性靜脈性潰瘍患者的12處創(chuàng)面使用ABCB5+真皮MSCs進(jìn)行局部治療，12周時創(chuàng)面中位尺寸縮小63%，疼痛感減輕，治療具有良好的耐受性和安全性[32]。ZANG等[33]進(jìn)行了一項(xiàng)前瞻性、單中心、隨機(jī)、雙盲、安慰劑對照的Ⅱ期臨床試驗(yàn)，對45例2型糖尿病患者靜脈輸注hUC-MSCs，結(jié)果顯示減少了患者對外源性胰島素的需求，緩解了胰島素抵抗，說明hUC-MSCs移植可能是2型糖尿病潛在的治療選擇。在一項(xiàng)Ⅰ～Ⅱ期隨機(jī)臨床試驗(yàn)中，為了評估BM-MSCs對急性-慢性肝衰竭(acute-on-chronic liver failure,ACLF)2級和3級患者的初始療效和安全性，結(jié)果顯示完成整個MSCs輸注方案的患者Child-Pugh評分、終末期肝病模型(model for end-stage liver disease，MELD)評分和ACLF評分均有明顯改善[34]。在另一項(xiàng)臨床試驗(yàn)中，對10例子宮損傷后愈合不良的患者(6例宮內(nèi)粘連、4例剖宮產(chǎn)疤痕憩室)進(jìn)行宮內(nèi)注射臨床級的hUC-MSCs治療，結(jié)果顯示治療安全，對于子宮損傷后愈合不良的患者，干細(xì)胞移植可能是一種有前途的治療方法[35]。ZHU等[36]為了評估從AD-MSCs中提取的外泌體霧化吸入治療新型冠狀病毒感染患者的安全性，將7例感染患者連續(xù)5 d吸入臨床級外泌體高達(dá)2.0×109納米囊泡的劑量，結(jié)果表明方法可行，且患者耐受性良好，為以MSCs為基礎(chǔ)治療急性呼吸道疾病提供了依據(jù)。

6 總結(jié)與展望

MSCs目前依然是再生醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)，自我更新能力、多向分化潛能、免疫調(diào)節(jié)能力、旁分泌因子及外泌體等決定了其在組織修復(fù)與再生中的廣泛應(yīng)用與無限潛力。此外，合適的誘導(dǎo)因子，如缺氧預(yù)處理[37]、物理刺激[38]、基因修飾及具有生物相容性的可降解支架[39]等可以促進(jìn)MSCs發(fā)揮功能。同時，MSCs和外泌體也可以作為一種天然的生物活性物質(zhì)或藥物的靶向遞送載體[22,40]。當(dāng)然，也存在一些問題，MSCs及外泌體在體內(nèi)如何發(fā)揮作用(生物分布、生物利用度、靶向性、藥代動力學(xué)等)及如何準(zhǔn)確給藥(給藥途徑、劑量、間隔、效力測定等)需要進(jìn)一步的研究。MSCs的培養(yǎng)及外泌體的分離純化，選擇合適的支架和誘導(dǎo)因子對MSCs治療至關(guān)重要。MSCs及外泌體的保存、運(yùn)輸和儲存至關(guān)重要。細(xì)胞產(chǎn)品臨床應(yīng)用的安全性、副作用的未知性應(yīng)該得到密切關(guān)注。盡管目前存在諸多挑戰(zhàn)，但以MSCs為基礎(chǔ)的組織工程依然代表了未來再生醫(yī)學(xué)治療領(lǐng)域的發(fā)展方向。