介孔二氧化硅負載奧曲肽制備吸入緩釋微粉制劑

汪春江， 黃永鵬， 唐 慧， 李昇原,2， 陳 博

(1. 國民核生化災害防護國家重點實驗室， 北京 102205； 2. 四川輕化工大學 機械工程學院， 四川 宜賓 644000)

奧曲肽(octreotide，OCT)是由8個氨基酸組成的環(huán)狀多肽化合物，是首個人工合成的生長抑素類藥物，對生長激素、 胰島素等分泌具有選擇性抑制作用[1]，目前是治療肢端肥大癥的首選藥物，同時在治療急慢性胰腺炎、 消化道內分泌腫瘤等領域應用廣泛[2-3]。OCT通常需要長期用藥，主要的制劑形式為靜脈或皮下注射劑，容易對細胞組織造成傷害并引發(fā)感染， 因此，對非侵入性的新型給藥方式及其制劑需求迫切。

干粉吸入劑(dry powder inhalation，DPI)是利用吸入裝置與患者呼吸的氣流相作用，將微粉化藥物遞送至肺部以發(fā)揮局部或全身性治療作用的制劑形式[4-5]，具有方便攜帶、 操作簡單、 劑量準確、 穩(wěn)定性好、 患者依從性高等優(yōu)點，且肺泡和毛細管區(qū)域吸收面積大， 血流豐富， 交換距離短， 酶降解作用弱，特別適用于OCT等多肽藥物[6-7]。本課題組研究證明，以微粉形式吸入OCT能夠實現(xiàn)與短效皮下注射幾乎相同的生物利用度[8]。藥物遞送和釋放是DPI研究的核心問題，一般要求微粉制劑的空氣動力學粒徑小于5 μm且具有良好的流動性。由于多肽藥物普遍半衰期較短，因此藥物釋放上要求制劑能夠有效延長藥物作用時間， 降低給藥頻率， 減弱毒副作用[9-10]。

介孔二氧化硅(mesoporous silica， MS)具有生物相容性好、 微觀形貌多樣且可控、 比表面積與比孔容大、 空氣動力學性能優(yōu)越、 裝載藥物結合力強等優(yōu)點[11-14]， 理論上是用于DPI的理想載體材料， 兼具優(yōu)異的遞送和釋放性能， 但目前尚未發(fā)現(xiàn)MS材料負載多肽藥物發(fā)揮吸入并延長藥物作用時間的文獻報道。

本文中擬采用溶膠-凝膠工藝制備4種不同的MS材料，通過浸漬吸附-冷凍干燥工藝負載模型藥物OCT構建可吸入微粉制劑，并對載體及微粉制劑開展微觀形貌、 物相結構、 粒度分布、 載藥量、 體外釋放性能以及體外吸入沉積等性能評價，為設計OCT及其他多肽藥物的干粉吸入制劑提供研究基礎。

1 實驗

1.1 材料與儀器

實驗材料有奧曲肽， 純度99.1%(質量分數(shù))， 浙江湃肽生物有限公司生產(批號為2018053003-1)； 吸入α-乳糖(粒徑為74 μm)、 氯化鈉、 硅酸鈉(模數(shù)為3.5)、 十二烷基苯磺酸鈉(sodium dodecyl benzene sulfonate, SDBS)， 均為分析純， 北京化工廠生產； 乙二酸、 正硅酸乙酯(tetraethyl orthosilicate, TEOS)，均為分析純，美國默克公司生產；乙醇、 正己烷、 乙腈、 高氯酸、 硫酸、 鹽酸均為分析純，氨水的質量分數(shù)為25%，北京試劑廠生產；超純水，實驗室自制。

主要儀器設備有LGJ-18S型真空冷凍干燥機(北京松源華興科技發(fā)展有限公司)、 3H-2000PS2型比表面積及孔徑分析儀(貝士德儀器科技(北京)有限公司)、 ZS90型納米粒度電位儀(英國馬爾文儀器有限公司)、 SU8020型掃描電子顯微鏡(日本日立公司)、 Tecnai G2型場發(fā)射透射電子顯微鏡(美國FEI公司)、 D8-ADVANCE型X射線衍射儀(德國布魯克公司)、 Agilent 1260型高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)以及JMT-3型安德森級聯(lián)撞擊器(北京明杰藍天科技有限公司)。

1.2 介孔二氧化硅的制備

采用溶膠-凝膠工藝，通過改變反應條件，分別制備粒徑為厘米級、 微米級和納米級的MS氣凝膠顆粒材料，具體方法如下所示。

塊狀氣凝膠(MS1)：按照物質的量比為1∶4∶5∶0.2的比例混合TEOS、 乙醇、 乙二酸和氨水溶液，在溫度為30 ℃條件下水浴攪拌12 h；攪拌結束后逐滴滴加氨水，待溶液中形成凝膠后的36 h內用乙醇交換凝膠中的水，重復3次；再用正己烷交換凝膠中的乙醇，重復3次后干燥至恒重。

微米級氣凝膠(MS2)：將37.5 mL TEOS、 250 mL乙醇與100 mL超純水混合均勻后用鹽酸調節(jié)pH至2～3；攪拌2 h后用濃氨水調節(jié)混合溶液的pH至9～10；取10 mL溶液靜置，在形成透明凝膠后，加入10 mL TEOS和90 mL乙醇的混合溶液，反應48 h；將溶液預凍后，真空冷凍干燥。

納米級微球氣凝膠(MS3)：將40 mL濃氨水和400 mL乙醇混合均勻后水浴加熱至溫度為35～40 ℃；將20 mL TEOS和200 mL乙醇混合均勻，取3/4的TEOS乙醇溶液滴加至氨水-乙醇混合溶液，劇烈攪拌30 min；滴加余下1/4的TEOS溶液，在溫度為60 ℃條件下反應2 h；待體系冷卻至室溫后，靜置陳化3 h后過濾洗滌干燥至恒重。

納米級顆粒氣凝膠(MS4)：將100 mL硅酸鈉溶液(摩爾濃度為0.4 mol/L)加熱至溫度為70 ℃后加入5 mL氯化鈉溶液(質量分數(shù)為20%)和0.4 g SDBS；在攪拌下滴加稀硫酸至溶液出現(xiàn)大量絮狀沉淀；在溫度為70 ℃條件下靜置陳化0.5 h后過濾洗滌干燥至恒重。

1.3 奧曲肽的負載

將制備的MS載體材料置入溫度為120 ℃烘箱活化2 h； 配制質量濃度為50 g/L的OCT水溶液， 按照載體與OCT的質量比為1∶2的條件向溶液中加入載體， 在轉速為1 000 r/min的條件下持續(xù)吸附24 h； 過濾OCT溶液與MS的混合物， 分離固體進行冷凍干燥。

1.4 性能研究

1.4.1 OCT定量分析

采用高效液相色譜法對OCT進行定量分析，具體實驗條件如下：色譜柱(安捷倫Eclipse plus C18)的尺寸為φ4.6 mm×250 mm (直徑×長度)、色譜柱內填料間的孔徑為5 μm，流動相為乙腈與質量分數(shù)為0.25%的高氯酸水溶液的混合液(體積比為30∶70)，進樣量為5 μL，流速為1.0 mL/min，檢測波長為210 nm；柱溫為25 ℃[15]。

1.4.2 理化性能

采用X射線衍射儀對載體進行物相結構表征，操作電壓為40 kV，操作電流為40 mA，Cu靶，波長為1.540 6 ?，掃描區(qū)域為10°～90°，掃描速率為6(°)/min。

采用掃描電子顯微鏡和場發(fā)射透射電子顯微鏡表征載體和制劑的微觀形貌，掃描電鏡操作電壓為3～5 kV，放大倍數(shù)為200～25 000；透射電鏡操作電壓為200～300 kV，放大倍數(shù)為1 000～150 000。

采用比表面積及孔徑分析儀測定載體的比表面積與孔徑，操作過程中選擇氮氣作為吸附質，設定脫氣溫度為300 ℃，脫氣時間為2 h。

采用納米粒度電位儀測量Zeta電勢，選擇水為分散介質。

1.4.3 載藥量分析

精密稱取適量的微粉制劑置于燒杯中， 加入適量的超純水； 以500 r/min的轉速攪拌6 h， 超聲20 min， 將藥物充分溶解； 吸取清液過濾后，采用高效液相色譜法進行定量分析，根據(jù)質量換算得出載藥量(微粉制劑中OCT的質量分數(shù)，w)。

1.4.4 體外釋放性能

參照文獻[16]， 以溫度為(37±0.5) ℃的水作為溶出介質， 取適量微粉制劑裝進透析袋中， 注水至充盈以保證微粉制劑能夠完全潤濕； 兩端扎緊后浸沒于100 mL水中， 在溫度為37 ℃、 轉速為100 r/min條件下攪拌， 分別在攪拌1、 5、 10、 30、 60、 120、 240、 360、 720、 1 440 min時對溶出介質進行采樣并補充置換同體積、 同溫度的水；通過高效液相色譜法對樣品進行定量分析，藥物累計溶出度Q的計算公式為

(1)

式中：Ci、Cn分別為第i次和第n次取樣時的質量濃度，i=1，2，…,n， g/L；m為微粉制劑的質量， mg；w為載藥量，%；V1為各時刻的取樣體積， mL；V2為溶出介質的體積，mL。

1.4.5 體外吸入性能

參照文獻[16]，采用安德森級聯(lián)撞擊器(ACI)測定微粉制劑的排空率Ed和有效部位沉積率FP，安德森級聯(lián)撞擊器示意圖如圖1所示。Ed和FP是指在氣流作用下，微粉從吸入裝置和膠囊中排出以及在肺部有效部位實現(xiàn)沉積的能力，是評價微粉制劑體外吸入性能的關鍵指標。ACI的第0—8級分離層模擬人體的下呼吸道，當氣流流速為28.3 L/min時，第0—8級分離層的空氣動力學截止直徑分別為9.0、 5.8、 4.7、 3.3、 2.1、 1.1、 0.70、 0.43、 0.22 μm。ACI的第9級為預分離器，第10級為連接吸入裝置和ACI的L型管，第11級為吸入裝置。

圖1 安德森級聯(lián)撞擊器示意圖Fig.1 Schematic of anderson cascade impactor

將微粉制劑根據(jù)載藥量混入適量的乳糖，混合均勻后將樣品裝載于膠囊中；稱取10粒膠囊置于吸入器后連接ACI；刺破膠囊后以28.3 L/min的氣流流速抽吸8 s，間隔1 s后復吸8 s，重復3次后停止；用純水溶解回收留在各級的微粉制劑，定容后通過HPLC進行定量分析。計算公式為

(2)

(3)

(4)

式中：R為藥物回收率，%；Vi為ACI中第i(i=0, 1, …, 11)級OCT的體積， mL。 當R值為95%～105%時， 通過式(3)、 (4)分別計算Ed和Fp。

2 結果與討論

2.1 介孔二氧化硅載體的表征和物理性能

4種介孔二氧化硅載體的的XRD圖譜和SEM圖像如圖2、 3所示， 物理性能如表1所示。 結果表明： 4種孔二氧化硅載體材料的XRD圖譜中均無晶體衍射峰， 且在2θ約為22 °處出現(xiàn)1個強峰， 說明是具有無定形結構的二氧化硅。 MS1為平均粒徑為1.8 cm的淡藍色塊狀固體， MS1由25 nm的單元顆粒組成， 單元顆粒間平整地聚集連接但中間存在縫隙， 這樣的結構讓MS1雖然具有較大的粒徑， 但仍具有較大的比表面積和和比孔容； MS2是白色粉末狀固體， 由具有立體網狀結構的、 平均粒徑為34 μm的無規(guī)則小塊組成， 網狀結構讓MS2具有在4種材料中最大的比表面積和比孔容； MS3是由粒徑約為100 nm的微球組成的白色粉末狀固體， 微球表面粗糙， 微球中存在明顯的孔道結構； MS4則是由粒徑為34 nm的小顆粒組成的白色粉末狀固體， 小顆粒相互連接聚集， MS4無明顯孔道結構； 孔道結構使得MS3比MS4具有了更大的比表面積和比孔容。

圖2 4種介孔二氧化硅載體的XRD圖譜Fig 2 XRD patterns of four kinds of mesoporous silica carriers

(a)MS1的宏觀形貌(b)MS1(放大100 000倍)(c)MS2(放大200倍)(d)MS2(放大100 000倍)(e)MS3(放大100 000倍)(f)MS3(放大100 000倍)(g)MS4(放大100 000倍)(h)MS4(放大100 000倍)圖3 4種介孔二氧化硅載體的SEM圖像Fig.3 SEM images of four kinds of mesoporous silica carriers

表1 4種介孔二氧化硅載體的物理性能

2.2 微粉制劑的表征和載藥量

負載藥物的過程中，淡藍色的大塊材料MS1在OCT溶液中逐漸溶蝕分散，形成乳白色懸浮液；MS2在吸附過程剛開始時，漂浮在溶液表面，但隨著攪拌時間的增加逐漸分散于溶液中；MS3和MS4在OCT溶液中分散速度較快且分散良好。將MS1、 MS2、 MS3、 MS4材料制備的微粉制劑分別記為P1、 P2、 P3、 P4，冷凍干燥后得到的所有微粉制劑均為白色粉末。4種微粉制劑的微觀形貌如圖4所示。由圖可見，MS1載藥后原有的結構發(fā)生改變，單元顆粒無規(guī)則地聚集在一起，顆粒之間仍存在空隙；MS2載藥后，原有的立體網狀結構被填充，并部分形成了片狀結構；MS3與MS4載藥前后變化不大，MS3載藥后仍然保持了原有的規(guī)則形貌，MS4載藥后的空隙部分明顯減少，小顆粒間存在團聚現(xiàn)象。

(a) P1(b)P2(c)P3(d)P4圖4 4種微粉制劑的SEM圖像Fig.4 SEM images of four kinds of micropowder pharmacies

4種微粉制劑的載藥量如圖5所示。由圖可見，制劑P1、 P2和P4的載藥量均大于30%，其中比孔容最大且Zeta電勢為負值的載體材料MS2制備的微粉制劑P2的載藥量最高，達到了36%；制劑P3的載藥量最低為13%，可能是由于載體材料MS3的Zeta電勢為正值，與OCT產生電荷排斥作用而導致載藥量偏低。4種載體均實現(xiàn)了對藥物的有效裝載，這是因為，OCT水溶液的Zeta電勢為正值，Zeta電勢為負值的載體材料容易通過電荷的相互作用而吸引在一起；除載體材料的孔道以外，材料的顆粒與顆粒之間形成的縫隙以及材料顆粒的表面也容易發(fā)生吸附；載體材料在孔道裝載、表面吸附和靜電作用的共同影響下完成對藥物的裝載。

圖5 4種微粉制劑的載藥量Fig.5 Drug loading of fourkinds of micropowder pharmacies

2.3 微粉制劑的體外釋放性能

微粉制劑的溶出度隨反應時間的變化體現(xiàn)了微粉制劑的體外釋放性能。 4種微粉制劑的溶出度隨反應時間的變化規(guī)律如圖6所示。 由圖可見， 反應時間為0～10 min時， 載藥量高的3種微粉制劑P1、 P2和P4在溶出過程初期的溶出度高于純OCT， 說明被吸附在載體顆粒間的縫隙和載體顆粒表面的OCT在溶出介質中迅速溶出后， 載體孔道內的OCT可持續(xù)緩慢溶出； 反應時間為0～1 440 min時， 制劑P1的溶出曲線與純OCT的基本一致， 未能延長溶出時間， 制劑P2、 P3和P4延長了溶出時間， 4種材料中粒徑最小、 平均孔徑最大的載體MS4載藥后得到的制劑P4延長藥物作用時間的效果最好； 微粉制劑P3的溶出度始終低于純OCT的，且持續(xù)釋藥時間達24 h， 有效延長了藥物作用的時間。

(a)0～10 min(b)0～1 440 min圖6 4種微粉制劑的溶出度隨反應時間的變化Fig.6 Variation of dissolution of four kinds of micropowder pharmachies with reaction time

2.4 體外吸入性能

微粉制劑的體外吸入性能由有效部位沉積率Fp和排空率Ed來體現(xiàn)。4種微粉制劑的有效部位沉積率和排空率如表2所示。由表可知，4種微粉制劑均有較好的Ed，達到了99%以上。制劑P4的顆粒之間存在團聚導致Fp最低，超過一半的顆粒被截留在了預分離器中，無法實現(xiàn)有效部位的沉積；制劑P1、 P2和P3的Fp均超過了50%，其中制劑P1的顆粒偏大，仍有小部分單元顆粒留在了預分離器；制劑P2具有片狀結構，在氣流下更容易分散，因此具有最高的Fp； 制劑P3保持了載體原有的規(guī)則形貌，F(xiàn)p大于60%， 均勻分布在ACI的0—7級且沒有被預分離器截留，有利于藥物的傳遞。

表2 微粉制劑的有效部位沉積率和排空率

3 結論

本文中制備了4種MS載體材料之后，通過浸漬吸附-冷凍干燥工藝負載藥物奧曲肽構建了4種微粉制劑，并對MS載體材料以及微粉制劑進行了理化、 釋放以及吸入等性能的研究。

1)4種MS載體材料完成了預期設計，具有不同的形貌、 粒徑、 比孔容、 比表面積等性能，能夠實現(xiàn)對藥物OCT的有效負載。

2)4種微粉制劑中P2的載藥量最高，達到了36%； P3的載藥量最低，達到了13%； P1、 P2、 P4未能保持載體的形貌；P2、 P3和P4延長了溶出時間； P2、 P3具有較高的有效部位沉積率，能夠滿足肺部吸入的遞送要求，并能夠延長藥物作用的時間。

3)單分散介孔二氧化硅微球-OCT微粉制劑(P3)具有最佳的綜合性能，排空率達到了100%，有效部位沉積率大于60%，具有良好的吸入性能；在溶出過程中的溶出速率始終低于純OCT的且持續(xù)釋藥時間達到24 h，有效延長了藥物的作用時間；保持了載體MS3原有的粒徑均一的單分散球形形貌，有利于提高藥物轉運傳遞劑量的準確性與重現(xiàn)性。