利用關鍵性狀分子標記輔助選育食用木薯新品系

許豐收 趙笑 孫粉杏 嚴華兵 陳新 王文泉

摘??要：木薯是世界熱區(qū)重要的糧食作物，培育高β-胡蘿卜素、低生氰糖苷和口感軟糯的食用品系是木薯重要的育種目標之一。為了高效地從育種材料中篩選出優(yōu)良食用木薯品系，本研究基于生氰糖苷轉運基因MATE編碼區(qū)G→A突變導致氨基酸變化進而影響其跨膜結構穩(wěn)定的前人研究成果，開發(fā)了MATE-SNAP標記，并聯(lián)合使用β-胡蘿卜素PSY2-SNAP和糯質GBSSⅠ-SNAP標記從50份種質資源中篩選出攜帶1～2個目的等位基因的親本材料12份，根據(jù)花期在不同年份共配制雜交組合10個。通過對雜交種子進行育苗、移栽和初步考種，依據(jù)實生苗分枝特點，選擇直立不分枝或中高位分枝的株系134個，利用MATE/PSY2/GBSSⅠ-SNAP分子標記進行基因型鑒定，從中篩選出13個聚合了2～3個目的基因型的候選食用木薯品系。采用分光光度法對13個品系塊根薯肉的氰化物含量進行測定，發(fā)現(xiàn)對照SC9的氰化物含量為49.24?μg/g，新品系氰化物含量為38.82～76.51?μg/g；利用丙酮比色法對塊根薯肉的β-胡蘿卜素含量進行測定，發(fā)現(xiàn)對照SC9的β-胡蘿卜素含量為184.75?μg/hg，6個黃色薯肉新品系β-胡蘿卜素含量為101.58～154.10?μg/hg；利用雙波長分光光度法對2個GBSSⅠ-SNAP標記基因型為純合糯質GG的品系塊根進行支鏈淀粉含量測定，發(fā)現(xiàn)P13-1和V7-14的支鏈淀粉含量分別為82.46%和83.79%。對13個品系的塊根薯肉進行食味評分，發(fā)現(xiàn)A5-138、A2-213、P7-6、P9-6、V4-8和V4-19等5個品系的評分較高，是潛在的食用木薯新品種。綜上，利用分子標記輔助選擇可以快速和準確地從育種材料中篩選出目的品系，提高木薯品種改良效率。

關鍵詞：木薯；β-胡蘿卜素；生氰糖苷；分子標記中圖分類號：S533??????文獻標識碼：A

Screen?New?Edible?Cassava?Lines?Assisted?by?Molecular?Markers?of?Key?Traits

XU?Fengshou1，2，?ZHAO?Xiao2，3，?SUN?Fenxing2，4，?YAN?Huabing5，?CHEN?Xin2*，?WANG?Wenquan1

1.?College?of?Tropical?Crops，?Hainan?University，?Haikou，?Hainan?570228，?China;?2.?Institute?of?Tropical?Bioscience?and?Biotechnology，?Chinese?Academy?of?Tropical?Agricultural?Sciences?/?Key?Laboratory?for?Biology?and?Genetic?Resoures?of?Tropical?Crops?of?Hainan?Province，?Hainan?Institute?of?Tropical?Agricultural?Resources，?Haikou，?Hainan?571101，?China;?3.?College?of?Plant?Science?&?Technology，?Huazhong?Agricultural?University，?Wuhan，?Hubei?430070，?China;?4.?College?of?Life?Science，?Nanjing?Agricultural?University，?Nanjing，?Jiangsu?210095，?China;?5.?Cash?Crops?Research?Institute，?Guangxi?Academy?of?Agricultural?Sciences，?Nanning，?Guangxi?530007，?China

Abstract：?Cassava?is?an?important?food?crop?in?tropical?regions，?and?one?of?the?main?breeding?goals?is?to?cultivate?new?lines?with?high?β-carotene，?low?cyanogenic?glucoside?and?waxy?taste.?In?order?to?screen?promising?edible?lines?from?breeding?materials，?the?study?developed?a?MATE-SNAP?marker?based?on?a?mutation?of?G→A?in?the?coding?region?of?cyanogenic?glucoside?transporter?gene?MATE?which?resulted?to?amino?acid?change?and?affected?its?transmembrane?structure?stability.?Combining?with?the?β-carotene?PSY2-SNAP?and?waxy?quality?GBSSⅠ-SNAP?markers，?12?parent?lines，?carrying?1-2?target?alleles，?were?selected?from?50?cassava?germplasms，?and?totally?hybridized?10?cross-combinations?according?to?flowering?period?among?different?years.?Firstly，?134?erect?or?middle?branched?candidate?lines?were?screen?out?through?seedling，?transplanting?and?preliminary?field?trial.?Secondly，?13?edible?promising?lines?which?aggregated?2-3?target?alleles，?were?chosen?by?using?MATE/PSY2/GBSSⅠ-SNAP?markers?together.?The?content?of?of?cyanogenic?glucoside?in?root?flesh?was?determined?by?spectrophotometry，?the?value?of?SC9?was?49.24?μg/g，?and?those?of?13?promising?lines?were?in?the?range?of?38.82-76.51?μg/g;?the?content?of?β-carotene?in?root?flesh?was?determined?by?acetone?colorimetry，?the?value?of?SC9?was?184.75?μg/hg，?and?those?of?the?six?yellow-root?lines?were?within?the?limits?of?101.58-154.10?μg/hg;?the?content?of?amylopectin?in?root?flesh?was?determined?by?dual?wavelength?spectrophotometry，?the?values?of?P13-1?and?V7-14，?whose?alleles?were?GG?that?genotyped?by?GBSSⅠ-SNAP?marker，?was?82.46%?and?83.79%，?respectively.?Based?on?this，?5?lines，?A5-138，?A2-213，?P7-6，?V4-8?and?V4-19，?were?found?to?be?the?potential?new?edible?cassava?varieties?by?taste?grading.?In?conclusion，?marker-assisted?selection?can?quickly?and?accurately?screen?out?the?target?lines?from?breeding?materials?and?improve?the?efficiency?of?cassava?genetic?improvement.

Keywords：?cassava;?β-carotene;?cyanogenic?glucoside;?molecular?marker

DOI：?10.3969/j.issn.1000-2561.2023.12.005

木薯是重要的熱帶塊根作物，是全球第六大糧食作物。我國木薯種植主要集中在廣西、海南和廣東等熱帶省（區(qū)），作為變性淀粉和燃料乙醇的主要原料。木薯塊根淀粉含量一般在25%左右，是一種高能食物來源[1]。木薯自19世紀20年代傳入我國，至今已有200年的栽培歷史，由于其粗生、易植、高產(chǎn)和四季皆可收獲食用等特性，一直是貧困地區(qū)居民保障溫飽的糧食作物。為了改善口感方便食用，人們開發(fā)出了各種各樣的木薯食品和小吃，中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院木薯研究團隊通過歸納整理和創(chuàng)新，編撰了中英文雙語《中國木薯食譜》[2]。

近年來，我國木薯種植面積和產(chǎn)量持續(xù)下降，而需求卻持續(xù)增長，每年木薯進口量持續(xù)增加，2019年進口原淀粉和干片達到1700萬t（折合干片），是國內產(chǎn)量的6倍左右（據(jù)中國淀粉工業(yè)協(xié)會統(tǒng)計數(shù)據(jù)）。國際木薯淀粉和工業(yè)酒精市場維持低價位，導致木薯原料收購價持續(xù)走低，農(nóng)戶種植積極性缺乏。木薯塊根營養(yǎng)豐富，除富含淀粉外，鉀、鈣、鎂、鐵等礦質元素較豐富，還含有β-胡蘿卜素和維生素等，其營養(yǎng)價值比肩甘薯和馬鈴薯[3]。隨著大健康時代的到來，人們對膳食均衡需求不斷增強，加強木薯食用價值的開發(fā)和利用，培育食用木薯新品種，推動木薯食用化發(fā)展，將促進我國木薯產(chǎn)業(yè)高效益發(fā)展。

木薯因其塊根中生氰糖苷含量的不同分為苦木薯和甜木薯，食用苦木薯會出現(xiàn)惡心、腹瀉等癥狀，嚴重時會對運動神經(jīng)產(chǎn)生傷害，引起konzo病。熱帶不發(fā)達地區(qū)人們以木薯塊根及其制品為主食，導致維生素A缺乏并產(chǎn)生相應疾病，如夜盲癥等[4]。常規(guī)木薯品種多為白色薯肉，β-胡蘿卜素含量低且生氰糖苷含量高于50?μg/g，因此，為了改善木薯的食用品質，降低塊根中生氰糖苷含量，提高塊根中的β-胡蘿卜素含量并改良薯肉的外觀色澤，木薯科研工作者做了大量工作，取得一些重要進展。生氰糖苷主要在木薯葉片中合成，再通過韌皮部轉運到塊根中。木薯葉片受到害蟲或動物吸/啃食后，位于液泡中的生氰糖苷與細胞壁或乳管中的β-葡萄糖苷酶互作，釋放出氰化氫（HCN）使害蟲和動物中毒，故生氰糖苷在木薯植株內具有一定的防御功能[5]。多家科研機構聯(lián)合測定了3354個巴西木薯品系，以及部分非洲種質多年多點的塊根生氰糖苷含量，通過關聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)2個主效位點，其中第16號染色體上的多種藥物和外運（MATE）蛋白可貢獻塊根中30%的生氰糖苷含量的變異。MATE蛋白編碼基因第4個外顯子G→A突變，使該位點編碼的氨基酸由丙氨酸變?yōu)樘K氨酸，進而導致蛋白跨膜結構不穩(wěn)定或構象發(fā)生改變，生氰糖苷跨膜轉運效率明顯下降或喪失[6]。在木薯塊根β-胡蘿卜素合成途徑中，八氫番茄紅素合成酶是參與β-胡蘿卜素合成的關鍵酶，木薯基因組中有3個編碼八氫番茄紅素合成酶的基因，分別命名為PSY1～3，其中PSY2基因編碼序列第572個堿基C→A的突變，導致編碼氨基酸由丙氨酸變成天冬氨酸，氨基酸的改變使PSY2的活性增至3倍以上，從而提高了塊根β-胡蘿卜素的含量，且該突變位點為木薯特有，在JGI數(shù)據(jù)庫的其他物種中尚未發(fā)現(xiàn)[7-8]。國際熱帶農(nóng)業(yè)研究中心（CIAT）通過自交在木薯品系AM206-5的S1代中發(fā)現(xiàn)1個糯性淀粉突變體，泰國木薯發(fā)展研究所（TTDI）進一步研究發(fā)現(xiàn)糯木薯品系的GBSSⅠ基因在第6個外顯子上有1個堿基C缺失，產(chǎn)生移碼突變導致酶活喪失[9]。低氰苷、高β-胡蘿卜素和糯性等性狀的形成機理的解析奠定了木薯食用品種選育的理論基礎。

利用前期根據(jù)β-胡蘿卜素合成基因PSY2、GBSSⅠ的單堿基變異開發(fā)的單核苷酸擴增多態(tài)性（SNAP）標記[9-10]，與本研究開發(fā)的MATE-SNAP標記（生氰糖苷轉運蛋白編碼基因）對國內主栽品種和引進優(yōu)良品種進行基因型鑒定，篩選一批親本配制不同雜交組合，并對雜交實生苗及其繁殖后代株系進行基因型和品質指標鑒定，選育聚合了高β-胡蘿卜素、低生氰糖苷或糯質性狀的食用木薯新品種/系。

1??材料與方法

1.1??材料

木薯雜交親本種植于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶生物技術研究所文昌試驗基地，采用分期播種（每個品系間隔30?d，共種植3次）的方法增加花期相遇的幾率。常規(guī)管理，氮肥減半，適當打頂以促進開花。親本信息見表1。

采用人工授粉套袋隔離的方式配制雜交組合，收獲雜交種子后利用育苗盆育苗，于出苗60?d左右移栽大田。次年初收獲單株，淘汰長勢差和塊根產(chǎn)量偏低的個體，根據(jù)種莖狀況每個單株栽種1～2行株系，年底考種測定產(chǎn)量和食用品質相關性狀。

新選048（XX048）及其28個自交S1代株系（XXS1-1～28）種植于廣西農(nóng)業(yè)科學研究院科研基地，常規(guī)管理。

1.2??方法

1.2.1??DNA抽提??采集木薯植株頂部幼嫩葉片，低溫研磨成粉狀，參照植物基因組DNA提取試劑盒（成都福際生物技術有限公司）的流程提取DNA，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測質量，并用NanoDrop紫外分光光度計（Thermo，?USA）檢測DNA濃度，稀釋至50?ng/μL，于–20?℃冰箱保存，備用。

1.2.2??SNAP引物設計??從美國能源部生物信息網(wǎng)站（www.phytozome.com）下載MATE基因的完整序列，找到G→A突變位點，根據(jù)SNAP技術引物設計原則，利用NCBI網(wǎng)站（www.ncbi.nlm.?nih.gov/）中的Primer?BLAST程序進行引物設計，并將反向引物3'端倒數(shù)第3個堿基依據(jù)SNAP引物設計的原則將Ａ錯配為T，以保證引物對能夠特異地區(qū)分2個不同的等位基因。本研究用到的引物序列見表2。

1.2.3??PCR擴增和產(chǎn)物多態(tài)性檢測??通過對基因組DNA用量和PCR擴增退火溫度、延伸時間及循環(huán)數(shù)的調整和優(yōu)化，確定MATE-SNAP引物組合的PCR擴增體系參數(shù)：100?ng?DNA，2×PCR?master?mixture?（Vazyme，?CHN）?10?μL，每條引物0.5?μL，加雙蒸水至總體積20?μL；PCR反應條件為：94?℃?3?min；94?℃?30?s，60.5?℃?30?s，72?℃?1?min，32個循環(huán)；72?℃?5?min。PSY2/GBSSⅠ-SNAP引物組合的PCR擴增體系參數(shù)參照文獻[9-10]。所有PCR產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠上進行電泳，并用Tanon?4000凝膠成像系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）進行拍照。每個PCR反應至少重復2次，以確保試驗結果的一致性和準確性。

1.2.4??塊根薯肉顏色評估、類胡蘿卜素、氰化物含量和支鏈淀粉比率測定??薯肉顏色評估：田間收獲塊根時，每個株系選取3個來自不同單株的塊根，橫切后記錄塊根顏色并留存蒸煮前后的照片。

β-胡蘿卜素含量采用丙酮提取比色法測定[11]。木薯塊根氰化物采用苦味酸顯色法測定[12]（海南省苦味酸屬于管制藥品，現(xiàn)階段無法購買，因此后期采用分光光度法）；木薯塊根氰化物采用分光光度法測定[13-14]。木薯塊根淀粉支鏈淀粉含量采用雙波長分光光度法測定[15]。所有樣品設3次試驗重復，計算平均值和標準差。

1.2.5??塊根蒸煮后食味評分??參照《熱帶作物品種區(qū)域試驗技術規(guī)程?木薯》（NY/T?2446—2013）[16]進行食味評價，略有改動。木薯塊根收獲當天，洗凈并去掉薯皮，選擇2～3條中段薯塊，切成0.5?cm厚度的薯片20片左右，蒸煮30?min。安排10名人員品嘗，并對蒸熟薯片從香度、苦度、甜度、粉度、粘度和纖維感分別進行打分，最后計算每個株系的綜合評分。

2??結果與分析

2.1??MATE-SMAP標記的引物設計及其準確性分析

根據(jù)MATE蛋白編碼基因第4個外顯子的G→A突變，參考PSY2-SNAP標記引物的設計原理，本研究也設計了一組SNAP引物（表2）。在優(yōu)化PCR反應體系后，對新選048及其28個自交F1代株系進行MATE基因G→A突變位點的基因型鑒定，通過電泳圖（圖1）可以發(fā)現(xiàn)，新選048在該位點是雜合AG，28個自交S1代株系在該位點存在分離，其中AA型16個、AG型9個和GG型3個，群體的偏分離趨向AA型（可能是群體太小的緣故）。采用苦味酸顯色法對新選048和28個自交S1代植株塊根薯肉氰化物含量進行檢測，發(fā)現(xiàn)氰化物含量在自交S1代群體中存在變異，且AA型株系的薯肉氰化物含量均小于50?μg/g，GG型和AG型株系薯肉偏向于高氰化物含量（表3）。

2.2??親本選擇、雜交組合配制和實生苗子代選優(yōu)

為了配制雜交組合，選育薯肉高β-胡蘿卜素、低生氰糖苷或糯性淀粉的食用木薯新品系，本研究利用3組MATE/PSY2/GBSSⅠ-SNAP標記對近50個候選親本的基因型進行鑒定，并從中篩選出12個親本品種（表1）。利用這12個親本于2016—?2018年分別進行人工授粉雜交，其中2016年V系列，2017年P系列，2018年A系列，總計10個組合。通過對雜交種子進行育苗、移栽和初步考種，根據(jù)實生苗分枝特點，選擇直立不分枝或中高位分枝（1次分枝部位一般高于1.5?m）的子代株系進行基因型篩選。每個組合選擇4～44個候選株系，總計134個株系（表4）。

2.3??育種株系的基因型鑒定和優(yōu)良品系篩選

為了對育種株系食用品質相關基因的基因型進行鑒定，選擇聚合塊根高β-胡蘿卜素、低生氰糖苷和糯質等位基因的優(yōu)良株系，同樣利用3組MATE/PSY2/GBSSⅠ-SNAP標記對134個株系進行基因型鑒定，從中篩選出13個目的品系（圖2，表5），其中高β-胡蘿卜素AC基因型品系6個，

低生氰糖苷純合AA基因型品系12個，糯質GG基因型品系7個；聚合高β-胡蘿卜素AC基因型和低生氰糖苷AA基因型品系6個；聚合低生氰糖苷AA基因型和糯質GG基因型品系6個；聚合高β-胡蘿卜素AC基因型、低生氰糖苷AA基因型和糯質GG基因型品系1個（P7-6）。

2.4??優(yōu)良品系塊根氰化物、β-胡蘿卜素、支鏈淀粉含量測定和食味評分

在確定13個優(yōu)良品系和3個對照品系基因型的基礎上，于2021年底收獲木薯塊根，去掉薯皮后對薯肉進行氰化物和β-胡蘿卜素含量測定（表5）。15個低生氰糖苷AA基因型品系塊根的氰化物含量為（38.82±0.57）～（77.37±2.14）μg/g，平均氰化物含量為59.86?μg/g，其中A5-079和V1-6的氰化物含量低于食用木薯主栽品種SC9。β-胡蘿卜素含量為（45.72±6.67）～（198.15±15.64）μg/hg，其中基因型為AA的ZMC723含量最高，為（198.15±?15.64）?μg/hg；基因型為AC的品系中SC9含量最高，泰引1號和A5-138次之，平均含量為145.93?μg/hg；基因型為CC的品系中A5-079含量最高，為（118.63±4.70）μg/hg，平均含量為79.94?μg/hg。除A5-079外，塊根β-胡蘿卜素含量大于100.0?μg/hg的其他品系薯肉顏色基本為淡黃色和黃色。

從糯質基因型為GG的品系中選取P13-1和V7-14進行支鏈淀粉含量測定，發(fā)現(xiàn)其支鏈淀粉含量分別為82.46%±0.42%和83.79%±1.40%，高于木薯淀粉支鏈淀粉平均含量75.55%±1.81%[17]。

進而，以食用木薯主推品種SC9、引進食用品種泰引1號和高β-胡蘿卜素品系ZMC723為對照，對13個優(yōu)良品系的薯肉食味進行評分（表5，圖3）。綜合來看，13個參試品系/種的綜合評分均超過80.0，其中A5-138的評分最高，為93.8，略低于對照SC9（94.3）；品系/種A2-213、P7-6、P9-6、V4-8和V4-19的評分均超過90.0，是潛在的食用木薯新品系。

3??討論

3.1??MATE-SNAP標記是一個具有育種價值的分子標記

本研究根據(jù)前人發(fā)現(xiàn)的生氰糖苷轉運蛋白MATE基因的關鍵突變位點開發(fā)了SNAP分子標記[6]，并利用一個小規(guī)模的自交群體驗證其可靠性，發(fā)現(xiàn)突變位點為AA基因型的木薯品系塊根生氰糖苷含量低。隨后，利用MATE-SNAP標記對育種材料進行篩選，發(fā)現(xiàn)MATE-SNAP基因型為AA的品種/系塊根平均生氰糖苷含量為59.86?μg/g，略高于食用木薯主栽品種SC9（49.24?μg/g），其中A05-079和V1-6品系低于SC9。因此，MATE-SNAP標記有助于育種工作者從中間材料中篩選出低生氰糖苷品系，縮小檢測范圍，提高選育效率。

3.2??木薯生氰糖苷合成和轉運機制復雜，亟需深入研究發(fā)掘更多關鍵基因

木薯中的生氰糖苷主要有亞麻苦苷和百脈根苷，主要分布在葉片、莖稈和塊根中，特定條件下被分解生成氫氰酸，具有一定的毒性，長期食用生氰糖苷含量高的木薯薯肉，會引起氰中毒[18]。木薯塊根生氰糖苷主要來源于葉片合成轉運和塊根的自身合成[19]。本研究開發(fā)的MATE-SNAP標記是基于生氰糖苷轉運蛋白基因MATE編碼區(qū)的單堿基變異，在一定程度上有助于篩選出生氰糖苷從葉片向塊根轉運能力弱的木薯種質，但如果涉及其他生氰糖苷轉運蛋白或塊根自身的生氰糖苷合成，則無法企及。本研究中的12個優(yōu)良食用木薯品系雖然均為低生氰糖苷AA基因型，但其塊根氰化物含量卻存在差異，而且V7-16（AG基因型）的塊根生氰糖苷含量與AA基因型相差不大，預示還有其他基因可以影響和調控木薯塊根生氰糖苷的轉運和合成。利用基因編輯技術敲除木薯生氰糖苷合成起始的關鍵基因MeCYP7D1和MeCYP79D2，發(fā)現(xiàn)單獨敲除MeCYP79D2可以顯著減少氰化物的含量[20]，而且轉錄因子MebHLH72/114可以同時調控木薯葉片中MeCYP7D1/D2和MeCYP71E的轉錄活性[21]。另外，在杏樹和百脈根中的研究發(fā)現(xiàn)，bHLH類轉錄因子可以通過調控PdCYP79D16、PdCYP71AN24和LjCYP79D3的轉錄活性來影響生氰糖苷在特定組織器官內的合成效率[22-23]。因此，加強木薯生氰糖苷合成和轉運調控機制研究，發(fā)掘更多關鍵基因和突變位點，為培育地上部生氰糖苷合成正常但生氰糖苷向木薯塊根轉運，且塊根自身生氰糖苷合成效率低的木薯新品系，提供理論指導和基因資源。

3.3??關鍵性狀調控分子標記的使用可以加速木薯新品種的選育

我國的木薯產(chǎn)業(yè)發(fā)展正處于瓶頸期，大力推動木薯食用化發(fā)展，培育食用木薯新品種，是維持木薯產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要舉措之一。本研究利用低生氰糖苷MATE、高β-胡蘿卜素PSY2[10]和糯質GBSSⅠ-SNAP[9]標記對木薯種質資源進行基因型篩選，選擇合適親本材料進行雜交組合配制，并利用分子標記選擇聚合2～3個目的等位基因的實生苗株系或品系，再結合相關品質指標的測定和食味評分快速從134個候選株系中篩選出13個優(yōu)良品系，其中5個品系食味評分較高，是潛在的食用木薯新品種。此外，由于這些優(yōu)良品系的食用品質基因型已知，可以據(jù)此制定雜交計劃或通過自交進一步定向改良，選育塊根生氰糖苷含量更低、β-胡蘿卜素含量增加和口感更加軟糯的新品系，從而提高木薯品種改良效率。

參考文獻

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