細(xì)胞衰老在青光眼中的作用研究進(jìn)展

丁劍鋒 綜述 李璐 審校

1無錫市第八人民醫(yī)院眼科，無錫 214000；2石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院眼科，石河子 832008

青光眼是多種因素引起的以視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(retinal ganglion cells，RGCs)丟失為病理改變的不可逆性致盲眼病，眼壓升高是青光眼視神經(jīng)損傷(glaucomatous optic neuropathy，GON)的主要因素。目前，全球青光眼發(fā)病率達(dá)2.86%，青光眼所致雙眼盲人數(shù)為1 120萬[1]；即使能通過藥物、激光、手術(shù)有效控制眼壓，青光眼視神經(jīng)損害持續(xù)進(jìn)展者仍不鮮見。因此，明確在機(jī)械壓力、血液動(dòng)力學(xué)異常、免疫炎癥、膠質(zhì)細(xì)胞活化等機(jī)制中RGCs的損傷進(jìn)程對青光眼的臨床防治尤為重要[2]。房水動(dòng)力學(xué)異常與高眼壓密切相關(guān)，房水外流通道結(jié)構(gòu)和功能異常參與青光眼的發(fā)生和發(fā)展。研究認(rèn)為，細(xì)胞僵硬度增大、線粒體功能障礙、蛋白酶體活性下降、胞內(nèi)信號(hào)通路異常等導(dǎo)致小梁網(wǎng)細(xì)胞和Schlemm管內(nèi)皮細(xì)胞衰老、通透性及機(jī)械傳感性降低是青光眼眼壓升高的直接危險(xiǎn)因素[3]。那么，進(jìn)一步闡明細(xì)胞衰老機(jī)制，從而有效抑制房水流出通道無疑是青光眼眼壓調(diào)控的新策略。細(xì)胞生理功能衰退、胞內(nèi)信號(hào)傳遞及物質(zhì)運(yùn)輸障礙、DNA損傷等導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯、細(xì)胞發(fā)生衰老，在神經(jīng)退行性疾病及心血管疾病中具有負(fù)面推動(dòng)作用。作為細(xì)胞死亡的前一階段，不同類型細(xì)胞發(fā)生衰老的機(jī)制有獨(dú)特性，也有共同性[4]。本文就細(xì)胞衰老特征、誘因、分子信號(hào)通路及其在青光眼中的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 細(xì)胞衰老特征與標(biāo)志物

細(xì)胞衰老發(fā)生于所有類型的細(xì)胞。有絲分裂細(xì)胞中由于DNA損傷反應(yīng)、細(xì)胞周期依賴蛋白激酶(cyclin-dependent kinase，CDK)抑制因子增加等表現(xiàn)出復(fù)制性衰老特征，具有再生能力的組織細(xì)胞減少、萎縮和損傷修復(fù)障礙[5]。RGCs等終末分化細(xì)胞中因合成、代謝障礙表現(xiàn)為非復(fù)制性細(xì)胞衰老，細(xì)胞特定功能，如神經(jīng)信號(hào)傳遞、能量轉(zhuǎn)換等生理功能喪失[6]。衰老細(xì)胞結(jié)構(gòu)上發(fā)生體積增大、核染色質(zhì)和線粒體減少、核凹陷等；功能上表現(xiàn)為細(xì)胞周期停滯、復(fù)制能力丟失、G0期神經(jīng)元細(xì)胞周期異常進(jìn)入等。目前，應(yīng)用的細(xì)胞衰老標(biāo)志包括衰老相關(guān)-β-半乳糖苷酶(senescence-associated β-galactosidase，SA-β-gal)活性升高、細(xì)胞周期調(diào)控因子高表達(dá)、端?？s短、衰老相關(guān)易染色質(zhì)聚集(senescence-associated heterochromatic foci，SAHF)和衰老相關(guān)分泌表型(senescence associated secretory phenotype，SASP)產(chǎn)生等[7-8]。

1.1 SA-β-gal

SA-β-gal是目前公認(rèn)的、廣泛應(yīng)用的細(xì)胞衰老標(biāo)志物。病理損傷刺激下，pH 6.0衰老細(xì)胞SA-β-gal呈現(xiàn)高酶活性，SA-β-gal作用于神經(jīng)節(jié)苷脂、糖蛋白等底物并將其轉(zhuǎn)變成藍(lán)色，因染色簡單、重復(fù)性好、普通顯微鏡下即可檢測而廣泛應(yīng)用于細(xì)胞衰老研究[9]。Skowronska-Krawczyk等[10]在急性高眼壓模型鼠視網(wǎng)膜鋪片中應(yīng)用RGCs標(biāo)志物Brn3a與SA-β-gal共標(biāo)，發(fā)現(xiàn)高眼壓誘導(dǎo)RGCs衰老增加。但是，SA-β-gal染色存在一定局限性，在溶酶體活動(dòng)旺盛的巨噬細(xì)胞、DNA受損細(xì)胞中SA-β-gal可能出現(xiàn)假陽性[11]。

1.2 細(xì)胞周期調(diào)控因子

P16INK4a蛋白又名細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶抑制因子2A，由INK4a/ARF基因編碼，是常用的、可在體檢測細(xì)胞衰老的標(biāo)志物。通常，P16INK4a蛋白在正常組織中表達(dá)水平極低；炎癥、氧化應(yīng)激等刺激因素導(dǎo)致P16INK4a表達(dá)上調(diào)引起細(xì)胞衰老；因此，P16INK4a高表達(dá)也被視為細(xì)胞衰老的始動(dòng)因素[12-13]。

P21Cip1蛋白又名細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶抑制因子1A，是細(xì)胞衰老相關(guān)基因P53的下游因子，在小鼠神經(jīng)管、內(nèi)淋巴囊等非分裂細(xì)胞中檢測出P21Cip1與SA-β-gal的高表達(dá)[14]，在視網(wǎng)膜RGCs損傷中尚未見相關(guān)報(bào)道。

1.3 SAHF

SAHF是Narita等[15]在成纖維細(xì)胞中觀察到衰老細(xì)胞特有的現(xiàn)象。激光掃描共聚焦顯微鏡下，衰老細(xì)胞核中DNA點(diǎn)狀聚集；K9M-H3蛋白、HP1蛋白、HMGA蛋白和組蛋白H2A變異體等標(biāo)志性蛋白組成SAHF[15]，是細(xì)胞衰老的重要標(biāo)志之一。然而，SAHF也存在于部分DNA損傷的細(xì)胞中，標(biāo)記衰老細(xì)胞具有一定局限性。

1.4 SASP

SASP是衰老細(xì)胞分泌功能增強(qiáng)的重要特征，普遍存在于體內(nèi)不同形式衰老細(xì)胞中。衰老細(xì)胞增多、促炎因子、趨化因子、不可溶蛋白、多種蛋白酶等SASP過度累積表現(xiàn)出負(fù)性調(diào)節(jié)作用，參與腫瘤血管生成、慢性炎癥、年齡相關(guān)性疾病發(fā)生等。Coppé等[16]認(rèn)為不同因素刺激的不同細(xì)胞中SASP成分有區(qū)別，炎性因子白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-6/IL-8在SASP中表達(dá)較為普遍；而基質(zhì)金屬蛋白酶活化影響小梁網(wǎng)細(xì)胞外基質(zhì)代謝失衡，進(jìn)而引起房水外流阻力改變是青光眼發(fā)生的病理因素。作為反映細(xì)胞衰老的指標(biāo)，合理干預(yù)SASP可以為衰老相關(guān)糖尿病、阿爾茨海默癥、青光眼等疾病的防治提供新的思路。

2 細(xì)胞衰老誘因

Hernandez-Segura等[6]研究發(fā)現(xiàn)，面臨外界應(yīng)激壓力時(shí)，細(xì)胞正常生理功能和增生能力衰退，進(jìn)而脫離細(xì)胞周期表現(xiàn)為細(xì)胞衰老。已有研究證實(shí)，紫外線照射、電離輻射、DNA損傷等引起細(xì)胞端?？s短、DNA片段缺失、SAHF聚集，是導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯、細(xì)胞衰老的誘因。致癌基因c-Myc、H-Ras等激活刺激絲裂原活化、產(chǎn)生異常增生信號(hào)，進(jìn)而參與P53、P16信號(hào)通路，誘導(dǎo)細(xì)胞衰老發(fā)生[12，15]?！把踝杂苫鶎W(xué)說”認(rèn)為，活性氧(reactive oxygen species，ROS)過量產(chǎn)生導(dǎo)致線粒體膜流動(dòng)性減少、ATP合成減少，胞內(nèi)衰老信號(hào)通路激活，細(xì)胞發(fā)生線粒體依賴的復(fù)制性衰老[17]。

3 細(xì)胞衰老經(jīng)典信號(hào)通路

3.1 P16INK4a/Rb途徑

P16INK4a/Rb途徑是細(xì)胞發(fā)生衰老的主要途徑。細(xì)胞受到氧化應(yīng)激、炎癥刺激、電離輻射等損傷引起P16INK4a高表達(dá)，競爭性結(jié)合CDK4/6進(jìn)而抑制底物Rb磷酸化，下游轉(zhuǎn)錄因子E2F無法被激活使細(xì)胞停滯于G1期(圖1)，引發(fā)細(xì)胞衰老并表現(xiàn)出SAHF、細(xì)胞僵硬度增大、線粒體功能障礙等特征。研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄因子JunB、JMJD3、HBP1、SP1、TEAD3/4等能正性調(diào)控P16INK4a，而ZBP-89、YB1、BMi-1等轉(zhuǎn)錄因子則具有負(fù)性調(diào)控作用[18-20]；如何抑制P16INK4a過表達(dá)、減緩端粒縮短是目前延緩細(xì)胞衰老、增強(qiáng)組織損傷修復(fù)能力的重要靶點(diǎn)。

圖1 細(xì)胞衰老P16INK4a/Rb和P19ARF/P53/P21Cip1途徑觸發(fā)細(xì)胞周期阻滯示意圖[14] ROS、DNA損傷等刺激信號(hào)激活細(xì)胞衰老途徑P16INK4a/Rb、P19ARF/P53/P21Cip1，衰老細(xì)胞中內(nèi)源性抑制物P21、P16等被激活，引起細(xì)胞周期阻滯

3.2 P19ARF/P53/P21Cip1途徑

P19ARF/P53/P21Cip1和P16INK4a/Rb衰老信號(hào)通路既相互獨(dú)立，又相互作用，共同參與人類細(xì)胞衰老的調(diào)控(圖1)。生理?xiàng)l件下，INK4a/ARF基因編碼P19ARF結(jié)合并抑制泛素蛋白連接酶人雙微體2蛋白(human double minute 2，HDM2)過表達(dá)，進(jìn)而抑制P53活化。病理?xiàng)l件下，P19ARF蛋白高表達(dá)抑制HDM2活性、激活P53，誘導(dǎo)下游因子P21CiP1表達(dá)，進(jìn)而抑制CDK4/6參與的Rb磷酸化激活，細(xì)胞周期停滯于G1期，發(fā)生細(xì)胞衰老[21-22]。作為細(xì)胞死亡前一階段，細(xì)胞衰老標(biāo)志物和機(jī)制研究可以為疾病的早期臨床防治提供新的思路。

4 青光眼相關(guān)的細(xì)胞衰老

4.1 青光眼房水引流通路中細(xì)胞衰老研究

病理性眼壓升高與原發(fā)性開角型青光眼(primary open-angle glaucoma，POAG)發(fā)生和進(jìn)展密切相關(guān)。眼壓穩(wěn)定有賴于房水生成與流出的動(dòng)態(tài)平衡，睫狀突房水生成、房水流出通道阻力以及上鞏膜靜脈壓的變化均能影響眼壓穩(wěn)定[23]。其中，房水流出通道阻力研究是關(guān)注熱點(diǎn)，也是目前POAG微創(chuàng)手術(shù)開展的理論基礎(chǔ)；然而何種分子機(jī)制參與房水流出通道阻力增加至今尚待闡明。生理狀態(tài)下，大部分房水經(jīng)葡萄膜小梁網(wǎng)、角鞏膜小梁和鄰管組織、Schlemm管內(nèi)壁內(nèi)皮細(xì)胞微孔進(jìn)入Schlemm管腔，經(jīng)過集合管開口流入集合管、房水靜脈，最終經(jīng)表層鞏膜靜脈代謝。形態(tài)學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)，房角附近纖維顆粒物質(zhì)沉積、小梁網(wǎng)細(xì)胞分泌的細(xì)胞外基質(zhì)聚集、小梁細(xì)胞SA-β-gal染色陽性呈現(xiàn)衰老表型等因素導(dǎo)致篩網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)破壞、房水流出阻力增加[24-26]。隨年齡增長，頻域光相干斷層掃描檢測到Schlemm管徑和面積減小[27]；此外，Schlemm管內(nèi)皮細(xì)胞衰老呈現(xiàn)出數(shù)量和空泡形成減少，也是導(dǎo)致房水外流阻力增大的不可忽視因素[26]。

目前，對小梁網(wǎng)結(jié)構(gòu)和細(xì)胞功能的研究主要借助于分離人眼小梁細(xì)胞、傳代培養(yǎng)豬小梁細(xì)胞等，實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)Ⅵ型膠原蛋白、纖連蛋白、糖蛋白、糖胺多糖等增加促進(jìn)小梁網(wǎng)成纖維細(xì)胞內(nèi)衰老標(biāo)志物SA-β-gal活性增強(qiáng)、有絲分裂減少、細(xì)胞形態(tài)上皮化、細(xì)胞僵硬度增加，提示小梁網(wǎng)細(xì)胞衰老與房水流出阻力增加有關(guān)[28-29]。電子顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，紫外線照射、氧化損傷、機(jī)械損傷等引起小梁網(wǎng)細(xì)胞線粒體中ROS含量增多、ATP合成水平下降和功能障礙[29-30]。研究證實(shí)，微小RNA(microRNA，miR)-204異常調(diào)控影響線粒體蛋白表達(dá)，參與線粒體依賴的復(fù)制性細(xì)胞衰老發(fā)生[30]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激損傷、miR-106拮抗劑能誘導(dǎo)人小梁細(xì)胞和成纖維細(xì)胞中P53高表達(dá)，進(jìn)而引起細(xì)胞衰老。轉(zhuǎn)染P53小干擾RNA或miR-106激動(dòng)劑可以有效抑制P53下游因子P21的表達(dá)，減少細(xì)胞衰老，提示P53/P21Cip1途徑參與介導(dǎo)小梁網(wǎng)細(xì)胞衰老、房水外流阻力增加[31]。miR-29b表達(dá)減少和房水中成纖維細(xì)胞生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子、胰島素樣生長因子在缺血缺氧、炎癥刺激因素下激活，引起小梁細(xì)胞外基質(zhì)合成增加、分泌卷曲相關(guān)蛋白1表達(dá)上調(diào)，導(dǎo)致細(xì)胞衰老、僵硬度增加、小梁網(wǎng)通透性破壞，進(jìn)而引起房水外流受阻增加[32-33]。青光眼被認(rèn)為是與衰老相關(guān)的疾病，蛋白酶體活性下降、P2Y受體激活引起小梁網(wǎng)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度增加、自噬功能障礙影響細(xì)胞機(jī)械傳感性受損等也與小梁網(wǎng)功能衰退有關(guān)[34]，但是否存在P16INK4a/Rb途徑活化、SAHF聚集等尚需深入研究。

小梁網(wǎng)和Schlemm管是房水外流阻力產(chǎn)生的主要部位。正常情況下，75%的阻力來自于Schlemm管0～14 μm處。Schlemm管內(nèi)壁內(nèi)皮細(xì)胞基底膜不完整、管腔長度縮短、塌陷引起房水外流受阻；并且，Schlemm管內(nèi)皮細(xì)胞功能衰退呈現(xiàn)出機(jī)械傳感性、通透性和濾過率下降等，被認(rèn)為與POAG患者Schlemm管房水外流阻力增加關(guān)系密切[35-36]。研究者曾采用手術(shù)縫線置入Schlemm管獲取人眼Schlemm管內(nèi)皮細(xì)胞，并以CD31分離純化，由于培養(yǎng)傳代困難，目前研究僅限于間接探討Schlemm管內(nèi)皮細(xì)胞屏障功能和分子機(jī)制[37]。此外，有研究在猴、鼠等青光眼動(dòng)物模型中觀察到Schlemm管內(nèi)皮細(xì)胞骨架蛋白、黏蛋白及緊密連接蛋白表達(dá)上調(diào)；內(nèi)皮型一氧化氮合酶活性降低導(dǎo)致NO表達(dá)減少等機(jī)制參與Schlemm管細(xì)胞衰老發(fā)生[38]。近年來，有研究者關(guān)注到Schlemm管細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)在青光眼損傷刺激因素作用下的變化，Schlemm管細(xì)胞骨架變化是否與Schlemm管內(nèi)皮細(xì)胞衰老有關(guān)，目前尚未見報(bào)道[39]。鑒于Schlemm管內(nèi)皮細(xì)胞分離困難，Schlemm管內(nèi)皮細(xì)胞衰老在青光眼房水動(dòng)力異常中的作用尚需深入研究，如何早期發(fā)現(xiàn)房水流出通道阻力異常是青光眼早期防治亟待解決的核心問題。

4.2 GON中細(xì)胞衰老的研究

RGCs損傷是視功能不可逆喪失的根本原因。病理性眼壓升高是始動(dòng)因素，隨后炎癥、氧化應(yīng)激、免疫介導(dǎo)的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞活化、谷氨酸受體NMDA釋放、ROS沉積、熱休克蛋白及自噬相關(guān)蛋白OPTN激活等共同參與GON[40]?，F(xiàn)階段，有效控制眼壓聯(lián)合神經(jīng)營養(yǎng)因子、擴(kuò)血管藥物支持治療等手段的綜合應(yīng)用，旨在最大程度地延緩視功能損傷、維持患者生存質(zhì)量；因此，探索RGCs損傷機(jī)制，從而更早、更有效地保護(hù)RGCs是青光眼研究者關(guān)注的熱點(diǎn)問題。

視網(wǎng)膜是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的外延，RGCs被認(rèn)為是終末分化細(xì)胞，始終處于細(xì)胞周期G0期；隨著中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病研究的不斷深入，病理情況下神經(jīng)元會(huì)再次進(jìn)入細(xì)胞周期，細(xì)胞周期再激活表明神經(jīng)元走向衰老、死亡[14]。青光眼是與阿爾茨海默病、帕金森病在發(fā)病機(jī)制中有相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病，處于G0期的RGCs是否存在異常進(jìn)入細(xì)胞周期的情況以及RGCs結(jié)局如何尚待進(jìn)一步研究。對于RGCs衰老的研究最早始于1986年，Katz等[41]檢測到小鼠衰老過程中視網(wǎng)膜外核層、內(nèi)核層、RGCs層細(xì)胞密度顯著減少。近年來，有研究者在發(fā)育小鼠研究中發(fā)現(xiàn)視網(wǎng)膜雙極細(xì)胞衰老，同時(shí)也觀察到RGCs中SA-β-gal活性升高[42]；Skowronska-Krawczyk等[10]在急性高眼壓誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜缺血-再灌注損傷動(dòng)物模型中檢測到RGCs衰老，并闡明青光眼風(fēng)險(xiǎn)基因SIX6介導(dǎo)P16INK4a高表達(dá)引起RGCs衰老的分子機(jī)制。國內(nèi)也有研究證實(shí)，急性高眼壓模型鼠中TBK1能促進(jìn)P16INK4a表達(dá)上調(diào)，與RGCs衰老有關(guān)，并且發(fā)現(xiàn)細(xì)胞周期S期標(biāo)志物CyclinA高表達(dá)，這些研究結(jié)果提示青光眼高眼壓損傷作用下神經(jīng)細(xì)胞周期異常參與RGCs衰老進(jìn)程[43]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，OPTNE50K變異導(dǎo)致線粒體自噬和功能障礙，進(jìn)而參與POAG患者RGCs衰老、膠質(zhì)細(xì)胞活化[44]。RGCs衰老作為青光眼視功能損傷早期階段，P19ARF/P53/P21Cip1信號(hào)通路是否參與缺血缺氧、氧化應(yīng)激、炎癥等刺激因素誘發(fā)的RGCs早期損傷還需進(jìn)一步研究；如何早期在體識(shí)別RGCs衰老也是青光眼視功能損傷早期防治研究的方向。

修復(fù)受損神經(jīng)、改善神經(jīng)信號(hào)傳遞、早期防治RGCs衰老是延緩青光眼視功能損傷的新策略。Rocha等[45]發(fā)現(xiàn)達(dá)沙替尼可以清除衰老RGCs、抑制SASP，從而保護(hù)RGCs和延緩視功能損傷、減輕GON。Huang等[46]研究發(fā)現(xiàn)，CYP2J2能夠抑制青光眼高眼壓損傷引起的血管內(nèi)皮細(xì)胞衰老標(biāo)志物P16、P53高表達(dá)，對視網(wǎng)膜血管和RGCs有保護(hù)作用。此外，有實(shí)驗(yàn)證實(shí)，維生素B3可以提高視網(wǎng)膜煙酰胺腺嘌呤二核苷酸水平、調(diào)控線粒體功能，從而延緩青光眼RGCs衰老；艾地苯醌、亞甲藍(lán)可以抑制青光眼氧化應(yīng)激損傷因素下細(xì)胞色素C釋放、RGCs中SA-β-gal活性升高[47-48]。培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞替換神經(jīng)系統(tǒng)中衰老細(xì)胞仍處于探索階段，如何干預(yù)靶基因、藥物治療如何向臨床轉(zhuǎn)化是延緩視功能損傷、青光眼早期防治的重點(diǎn)。

綜上所述，青光眼發(fā)生和發(fā)展是多種致病因素、多種機(jī)制共同作用的結(jié)果。細(xì)胞衰老是細(xì)胞死亡的前一階段，在青光眼發(fā)生和視功能損傷中的作用機(jī)制研究集中在2個(gè)方面：小梁網(wǎng)及Schlemm管內(nèi)皮細(xì)胞衰老、通透性下降，房水流出阻力增加參與青光眼發(fā)生；識(shí)別和干預(yù)RGCs衰老是青光眼視功能早期防治的新策略。在體、精準(zhǔn)檢測出細(xì)胞衰老并實(shí)現(xiàn)細(xì)胞衰老干預(yù)的臨床轉(zhuǎn)化是青光眼研究新的切入點(diǎn)，也是青光眼視功能保護(hù)工作中迫在眉睫的核心問題。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突