發(fā)酵型柑橘紅茶酒發(fā)酵工藝研究及揮發(fā)性成分分析

衛(wèi)春會，吳 堯，薛 康，黃科屹，鄧星成，鄧 杰,*

（1.四川輕化工大學(xué)釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點實驗室，四川 宜賓 644000；2.中國輕工業(yè)釀酒生物技術(shù)及智能制造重點實驗室，四川 宜賓 644000；3.成都海關(guān)技術(shù)中心，四川 成都 610041）

茶酒是以茶葉為主要原料，輔以水果或蔗糖等其他原料，經(jīng)微生物發(fā)酵得到的兼具茶香與酒香的新型酒精飲料。目前市場上的茶酒以配制酒為主，但對發(fā)酵型茶酒的研究從未間斷。劉琨毅等[1]通過單因素試驗和響應(yīng)面設(shè)計優(yōu)化了米香型烏龍茶酒的生產(chǎn)工藝條件，獲得亮黃透明、酒香與茶香和諧、滋味爽口的米香型烏龍茶酒，兼具米酒與烏龍茶的風(fēng)味特征，酒精度為11.9%vol，多酚類物質(zhì)含量為1.9 mg/mL。王琪等[2]以紅茶與糯米為主要原料，發(fā)酵得到一款糯米茶酒，酒體呈黃褐色，酒香與茶香和諧，酒體豐滿，不僅感官品質(zhì)優(yōu)良，還具有一定的保健價值。黃瑩捷等[3]以夏秋茶樹鮮葉與獼猴桃為原料，釀造得到一款獼猴桃茶酒，酒精度達9.03%vol，茶多酚和VC 含量分別為1 114.12 mg/L 和199.06 mg/L。此外還有石榴汁茶酒、葡萄茶酒、雪梨茶酒等，尚未有柑橘茶酒的相關(guān)研究。

柑橘與茶葉作為我國種植的傳統(tǒng)植物，擁有悠久的種植歷史，其中柑橘果實中含有許多生物活性物質(zhì)，如類黃酮、類胡蘿卜素、香豆素等，有抗癌、抗炎、抗菌等多種功效[4-10]；茶葉中含有大量茶多酚、咖啡堿、蛋白質(zhì)、茶黃素、茶紅素、茶褐素等，對人體的健康有一定的積極作用[11-13]。因此，本研究以柑橘與紅茶為發(fā)酵原料，通過單因素試驗與正交試驗優(yōu)化柑橘紅茶酒的發(fā)酵工藝，以期研制出兼具柑橘和紅茶風(fēng)味與營養(yǎng)的發(fā)酵型柑橘紅茶酒，充分利用我國茶葉和水果資源，開辟柑橘深加工新途徑，豐富酒產(chǎn)品的種類，具有廣闊的應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料與試劑

紅茶（政和功夫紅茶）、柑橘（砂糖橘）、白砂糖，均為市售；果酒活性干酵母，安琪酵母股份有限公司。試驗所用試劑均為分析純。

1.1.2 儀器與設(shè)備

MJ-25BM05C 榨汁機，廣東美的精品電器有限公司；WZS32 手持折光儀，上海儀電物光儀器有限公司；XMT-100C 恒溫培養(yǎng)箱，重慶市永生實驗儀器廠；DM3000 型正置生物顯微鏡，德國Leica 公司；A360 紫外可見分光光度計，翱藝儀器（上海）有限公司；7890A-5975B 氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國安捷倫公司。

1.2 方法

1.2.1 柑橘紅茶酒生產(chǎn)工藝流程

紅茶→浸提→過濾→冷卻→加入柑橘汁→調(diào)糖、調(diào)pH→接種→發(fā)酵→過濾→澄清→滅菌→成品茶酒

1.2.2 操作要點

1.2.2.1 紅茶汁的制備

稱取紅茶茶葉，以茶水質(zhì)量比1∶10 加入冷水清洗2～3 次，按照茶葉與水質(zhì)量比為1∶50 的比例添加熱水，密封，80 ℃浸提30 min 后，用四層紗布趁熱過濾。

1.2.2.2 柑橘汁的制備

將砂糖橘去皮榨汁，添加80 mg/L 焦亞硫酸鉀護色殺菌，4 ℃冷藏備用。

1.2.2.3 調(diào)整成分

按柑橘汁與紅茶汁質(zhì)量比1∶15 的比例配制待發(fā)酵液，添加白砂糖調(diào)整發(fā)酵液初始糖度，添加酒石酸調(diào)整pH。

1.2.2.4 酵母的活化

稱取1%果酒活性干酵母，加至4%的葡萄糖水溶液中，于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～2 h，直至有大量氣泡產(chǎn)生，鏡檢觀察酵母活化程度，待其生長良好后終止培養(yǎng)。

1.2.2.5 酵母的擴大培養(yǎng)

取適量的柑橘紅茶汁，調(diào)整糖度為10%，調(diào)pH值為4.5～5.0，按8%接種量對活化后的酵母進行擴大培養(yǎng)，在28～30 ℃下培養(yǎng)8 h，定時取樣用顯微鏡觀察酵母生長繁殖狀況，確定其繁殖旺盛（酵母總數(shù)達107～108CFU/mL）且無雜菌污染時終止培養(yǎng)，獲得一級種子發(fā)酵液。然后將一級種子液按照以上方法，在相同的條件下擴培12 h，獲得二級種子液。

1.2.2.6 接種、發(fā)酵

將二級種子液按一定比例加入到發(fā)酵液中，搖勻，在28 ℃條件下靜置發(fā)酵7 d。

1.2.2.7 過濾

用8 層紗布將柑橘果渣和紅茶渣等沉淀物濾掉。

1.2.2.8 澄清

將茶酒置于密閉容器中，在4 ℃條件下冷藏5 d，將果酒上清液轉(zhuǎn)移到新的容器中。

1.2.2.9 滅菌

采用巴氏滅菌法，加熱至酒體中心溫度達到65～70 ℃，保持20 min 進行滅菌。

1.2.3 紅茶酒、柑橘酒生產(chǎn)工藝

紅茶酒生產(chǎn)工藝參照鄒聰麗[14]的操作方法；柑橘酒生產(chǎn)工藝參照康明麗等[15]的操作方法。

1.2.4 柑橘紅茶酒發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗

采用單因素輪換法，基礎(chǔ)發(fā)酵條件為：柑橘汁與紅茶汁質(zhì)量比1∶15，初始糖度20%，接種量8%，初始pH 值4.5，發(fā)酵溫度28 ℃，發(fā)酵時間7 d。基于基礎(chǔ)條件，依次考察柑橘汁與紅茶汁質(zhì)量比（1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25）、初始糖度（16%、18%、20%、22%、24%）、初始pH 值（3.0、3.5、4.0、4.5、5.0）、酵母接種量（6%、7%、8%、9%、10%）、發(fā)酵溫度（22、24、26、28、30 ℃）及發(fā)酵時間（6、7、8、9、10 d）對柑橘紅茶酒的酒精度、殘?zhí)呛考案泄僭u分的影響。

1.2.5 柑橘紅茶酒發(fā)酵條件正交試驗優(yōu)化

在單因素試驗基礎(chǔ)上，設(shè)計L9(34)正交試驗，研究初始糖度、接種量、發(fā)酵溫度對酒精發(fā)酵的影響，以發(fā)酵所得茶酒的酒精度、殘?zhí)橇考案泄僭u分為依據(jù)，確定最佳發(fā)酵條件。正交試驗因素水平如表1 所示。

表1 柑橘紅茶酒發(fā)酵條件優(yōu)化的正交試驗因素水平表Table1 Factors and levels table of orthogonal test

1.2.6 理化指標(biāo)檢驗方法

總糖、總酸含量、酒精度：參照《釀酒分析與檢測》[16]中的方法進行測定；茶多酚含量：參照謝雨尋等[17]的方法進行測定。

1.2.7 柑橘紅茶酒、紅茶酒、柑橘酒風(fēng)味物質(zhì)GC-MS檢測方法

參考康明麗等[15]的方法并稍作修改。

氣相色譜條件：DB-WAX 毛細(xì)管色譜柱，規(guī)格為60 mm×250 μm×0.25 μm；手動無分流進樣，進樣口溫度為230 ℃；程序升溫：40 ℃保持1 min，然后5 ℃/min升溫到180 ℃，保持1 min，再8 ℃/min 升溫到230 ℃，保持7 min；載氣：高純度氦氣，流速為1 mL/min。

質(zhì)譜條件：EI 電離源，電子能量70 eV，質(zhì)量掃描范圍20～500 u，離子源溫度230 ℃，四級桿溫度150 ℃，接口溫度230 ℃，溶劑延遲3 min。

數(shù)據(jù)處理：通過GC-MS 分析檢測得出柑橘紅茶酒風(fēng)味物質(zhì)的總離子流圖，采用數(shù)據(jù)分析軟件進行譜庫（NIST8.0）檢索及相關(guān)文獻分析，對相應(yīng)的風(fēng)味物質(zhì)成分進行鑒定。

1.2.8 柑橘紅茶酒感官評價方法

柑橘紅茶酒感官評價方法如表2 所示。將柑橘紅茶酒酒樣置于通風(fēng)良好的房間，由15 位受過專業(yè)培訓(xùn)的感官評定小組成員分別對柑橘紅茶酒酒樣進行感官品質(zhì)評價[18-19]。

表2 柑橘紅茶酒感官品質(zhì)評價標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory quality evaluation criteria of citrus black tea wine

2 結(jié)果與分析

2.1 柑橘紅茶酒生產(chǎn)工藝單因素試驗結(jié)果

2.1.1 柑橘汁與紅茶汁質(zhì)量比對柑橘紅茶酒感官品質(zhì)的影響

柑橘汁與紅茶汁的配比直接影響柑橘紅茶酒的口感與香味。由表3 可知：當(dāng)柑橘汁與紅茶汁質(zhì)量比為1∶5 時，酒體柑橘味過濃，茶香被柑橘香掩蓋，無法展現(xiàn)紅茶特有的香味；質(zhì)量比為1∶10 時，酒體呈淡黃色，以柑橘香為主，茶香較弱，整體欠佳；當(dāng)質(zhì)量比為1∶20、1∶25 時，酒體呈黃褐色，柑橘味較弱，柑橘風(fēng)味被紅茶味掩蓋，酒體協(xié)調(diào)性較差；當(dāng)質(zhì)量比為1∶15時，感官評分最高，成品酒顏色為黃褐色，柑橘味與紅茶味協(xié)調(diào)，既有柑橘的果香，又有紅茶的清香。因此綜合考慮，最終選定柑橘汁與紅茶汁質(zhì)量比1∶15 為最佳配比。

表3 不同柑橘汁與紅茶汁配比的柑橘紅茶酒感官評定結(jié)果Table 3 Sensory evaluation results of different orange juice and black tea ratios

2.1.2 柑橘紅茶酒初始糖度的確定

由圖1 可知，柑橘紅茶發(fā)酵液初始糖度直接影響到柑橘紅茶酒酒精度的高低與殘?zhí)橇?，初始糖度?6%～24%時，酒精度與殘?zhí)橇侩S著初始糖度的增加而升高。當(dāng)初始糖度為16%時，成品酒酒精度只有8.4%vol，酒精度低，酒香不足，酒體單薄、不豐滿；當(dāng)初始糖度為22%時，酒精度為10.2%vol，并且感官評分最高，為83.06 分，此時酒體較為濃厚，酒香、果香、茶香純凈且協(xié)調(diào)，入口綿軟、圓潤；當(dāng)初始糖度繼續(xù)增高時，酒精度的變化不明顯，但是其口感卻因殘?zhí)橇康脑黾佣兊锰鹉?。因此綜合考慮，選取初始糖度20%、22%、24%進行正交試驗。

圖1 初始糖度對柑橘紅茶酒酒精度、殘?zhí)橇考案泄僭u分的影響Fig. 1 Effect of initial sugar contents on the alcohol,residual sugar contents,and sensory scores of citrus black tea wine

2.1.3 初始pH 值的確定

發(fā)酵液酸堿度的高低對酵母菌的生長和代謝具有一定的影響，當(dāng)pH 值低于3 時，酵母生長緩慢，生長繁殖受到抑制；當(dāng)pH 值高于5 時，酵母代謝產(chǎn)酒能力降低，同時容易造成發(fā)酵罐感染雜菌[20]。由圖2可以看出，當(dāng)發(fā)酵初始pH 值為3.5 時，產(chǎn)品酒精度只有8.7%vol，酒體不夠濃厚，酸味大，酒液略顯粗糙。當(dāng)初始pH 值為5 時，酒精產(chǎn)量下降，酒味寡淡、雜味重且后味短；發(fā)酵液初始pH 值為4.0 與4.5 時，酵母菌生長與代謝較佳，在初始pH 值為4.0 時酒精度最高，但當(dāng)初始pH 值為4.5 時，感官評分最高，酒體入口綿甜，后味宜暢，茶香、柑橘果香濃郁。綜合上述分析，選擇初始pH 值為4.5 進行發(fā)酵。

圖2 初始pH 值對柑橘紅茶酒酒精度、殘?zhí)橇考案泄僭u分的影響Fig. 2 Effect of initial pH values on the alcohol,residual sugar contents,and sensory scores of citrus black tea wine

2.1.4 酵母接種量的確定

酵母接種量會影響酵母的發(fā)酵速率和呼吸產(chǎn)能。酵母接種量過高會導(dǎo)致酵母代謝產(chǎn)物增多，同時也會導(dǎo)致前期發(fā)酵過快，酵母出現(xiàn)早衰現(xiàn)象；接種量過低則會導(dǎo)致發(fā)酵緩慢，增大發(fā)酵液染菌的風(fēng)險[21]。如圖3 所示，酒精度與感官評分隨酵母接種量的增加呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，感官評分在接種量7%時達到最大，在接種量8%時酒精產(chǎn)量最大。隨著酵母接種量繼續(xù)加大，酒精度降低，其原因可能是由于接種量過大，酵母在發(fā)酵前期生長繁殖過快，消耗了大量的糖類物質(zhì)，并出現(xiàn)早衰的現(xiàn)象，導(dǎo)致后期產(chǎn)酒量降低，同時隨著接種量的增加，柑橘紅茶酒的酵母味也隨之明顯，口感欠佳。綜上分析，選取接種量6%、7%、8%進行正交試驗。

圖3 接種量對柑橘紅茶酒酒精度、殘?zhí)橇考案泄僭u分的影響Fig. 3 Effect of inoculation amounts on the alcohol,residual sugar contents,and sensory scores of citrus black tea wine

2.1.5 發(fā)酵溫度的確定

由圖4 可知，發(fā)酵溫度對柑橘紅茶酒產(chǎn)品的酒精度、風(fēng)味與色澤都存在一定的影響。當(dāng)發(fā)酵溫度為22 ℃時，酵母生長代謝較為緩慢，發(fā)酵產(chǎn)酒較低，到發(fā)酵結(jié)束時酒精度僅為8.3%vol，殘?zhí)呛枯^高，此時酒香較弱，酒體寡淡；當(dāng)溫度為30 ℃時，雖然酒精度較為理想，但是柑橘茶酒顏色暗沉，苦澀味較重；當(dāng)發(fā)酵溫度為24、26、28 ℃時，酒精度均高于9%vol，此時發(fā)酵的柑橘紅茶酒酒體豐滿，口感醇厚，酸甜適中，顏色透亮紅潤，果香、茶香協(xié)調(diào)。因此綜合考慮，選取發(fā)酵溫度24、26、28 ℃進行正交試驗。

圖4 發(fā)酵溫度對柑橘紅茶酒酒精度、殘?zhí)橇考案泄僭u分的影響Fig. 4 Effect of fermentation temperatures on the alcohol,residual sugar contents,and sensory scores of citrus black tea wine

2.1.6 發(fā)酵時間的確定

由圖5 可知，隨著發(fā)酵時間的增加，酒精度呈先增加后趨于平緩的趨勢，殘?zhí)橇縿t呈現(xiàn)先減少后趨于平緩的趨勢。經(jīng)過分析可知前兩天為前酵期，在這期間酵母菌通過利用營養(yǎng)物質(zhì)大量生長繁殖，3～7 d 為主酵期，這個階段酵母菌將發(fā)酵液中的糖轉(zhuǎn)化為酒精。發(fā)酵5 d 后酒精度趨于穩(wěn)定，此時酒體醇厚，略有苦澀味；發(fā)酵第7 天時酒精度達到10.19%vol，此時酒體協(xié)調(diào)，口感柔和，感官評分最高。通過研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵時間過短則發(fā)酵不完全，對柑橘紅茶酒的風(fēng)味有較大影響，而發(fā)酵時間過長，酒體的澀味與酵母味又較為明顯，這可能與后期酵母的自溶現(xiàn)象有關(guān)，并且發(fā)酵周期過長，柑橘紅茶酒遭受外界微生物污染的機會也越大。綜合考慮，發(fā)酵時間定為7 d 較為理想。

圖5 發(fā)酵時間對柑橘紅茶酒酒精度及殘?zhí)橇康挠绊慒ig. 5 Effect of fermentation time on the alcohol and residual sugar contents of citrus black tea wine

圖6 不同發(fā)酵時間柑橘紅茶酒感官評分Fig. 6 Sensory scores of citrus black tea wine at different fermentation time

2.2 柑橘紅茶酒發(fā)酵工藝正交試驗結(jié)果

由表4 正交試驗結(jié)果可知，極差由大到小為RA＞RB＞RC，即影響柑橘紅茶酒發(fā)酵的因素主次順序為：初始糖度＞接種量＞發(fā)酵溫度。通過表5 的方差分析可知，因素A（初始糖度）對柑橘紅茶酒發(fā)酵的影響極顯著（P＜0.01）；因素B（接種量）對柑橘紅茶酒發(fā)酵的影響顯著（P＜0.05）；因素C（發(fā)酵溫度）對柑橘紅茶酒發(fā)酵的影響不顯著。綜合得出柑橘紅茶酒發(fā)酵最佳工藝組合為A3B2C1，即初始糖度24%，接種量7%，發(fā)酵溫度24 ℃。

表4 柑橘紅茶酒發(fā)酵正交試驗結(jié)果Table 4 Orthogonal test results of citrus black tea wine fermentation

表5 柑橘紅茶酒發(fā)酵正交試驗因素方差分析表Table 5 Variance analysis of orthogonal test factors of citrus black tea wine fermentation

2.3 柑橘紅茶酒發(fā)酵工藝的驗證試驗結(jié)果

通過單因素試驗與正交試驗，得到柑橘紅茶酒的最佳發(fā)酵工藝條件為：柑橘汁與紅茶汁質(zhì)量比1∶15，初始糖度24%，初始pH 值4.5，酵母接種量7%，發(fā)酵溫度24 ℃，發(fā)酵時間7 d。按照最佳的發(fā)酵工藝條件進行驗證，并檢測相應(yīng)的指標(biāo)，結(jié)果見表6。在最佳發(fā)酵工藝條件下得到的最終產(chǎn)品酒體清澈透明，顏色為黃褐色，酒香宜人，有淡淡的柑橘香和紅茶的花香與蜜香，酒體協(xié)調(diào)，入口醇和，余味甘爽。

表6 柑橘紅茶酒的品質(zhì)指標(biāo)檢測結(jié)果Table 6 The detection results of citrus black tea wine qualities

2.4 柑橘紅茶酒、柑橘酒、紅茶酒揮發(fā)性風(fēng)味成分分析

紅茶屬于發(fā)酵茶，茶樹的品種、地理環(huán)境與加工工藝等等都會對紅茶酒的品質(zhì)與香味造成影響，如金駿眉、川紅等主要香氣成分為芳樟醇、水楊酸甲酯、香葉醇、苯乙醇等，使得紅茶具有不同程度的花香與蜜香[21-23]；云南滇紅的主要香氣成分為苯乙醛、芳樟醇與水楊酸甲酯等，呈現(xiàn)出花香與蜜香；祁門紅茶主要香味物質(zhì)為苯甲醛、香葉醇等，呈現(xiàn)出花香與蜜香[24-25]。由表7 可知，利用GC-MS 法在柑橘酒、紅茶酒與柑橘紅茶酒中共分離出49 種香味物質(zhì)，且3 種酒樣中的揮發(fā)性物質(zhì)大致相似，主要是醇類、酯類及少量的酸類與醛類。醇類有異丁醇、2-乙基己醇、3-甲基-2-丁醇、2,3-丁二醇、正丁醇、異戊醇、苯甲醇、苯乙醇等；酯類有乙酸乙酯、乙酸異戊酯、正己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、9-癸烯酸乙酯、乙酸苯乙酯、十二酸乙酯、己酸異戊酯等；酸類有乙酸、丙酸、異丁酸、3-羥基-甲酯丁酸、己酸、正戊酸、辛酸等。上述3類物質(zhì)相對含量占揮發(fā)性香氣成分的90%以上。柑橘紅茶酒中的香味物質(zhì)的種類及含量較柑橘酒、紅茶酒更加豐富，在紅茶酒與柑橘紅茶酒中未檢出如芳樟醇、水楊酸甲酯等茶酒中的特征風(fēng)味物質(zhì)，但檢出苯乙醇、苯甲醛與十二酸乙酯等具有花香的特征風(fēng)味物質(zhì)，并且與紅茶酒相比有一定的提升，在柑橘紅茶酒中異戊醇與苯乙醇的相對含量較高，異戊醇相對含量為47.46%，苯乙醇相對含量為19.12%，較好地保留了紅茶與柑橘中的特征風(fēng)味成分[26-28]。天然的異戊醇主要以酯的形式存在于部分植物中，具有蘋果白蘭地香氣，苯乙醇具有新鮮面包香、清甜的玫瑰花香。酯類中乙酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯與乙酸苯乙酯的相對含量較高，乙酸乙酯具有果香味，辛酸乙酯具有類似菠蘿的香氣，癸酸乙酯類似于葡萄的香氣，乙酸苯乙酯帶有甜味、具有玫瑰花香氣且?guī)в锌煽傻南阄禰29]。酸類物質(zhì)對酒體的香氣起到了促進作用，乙酸、丙酸、辛酸等酸類物質(zhì)的存在使得柑橘紅茶酒香味優(yōu)雅，酒體協(xié)調(diào)。

表7 柑橘紅茶酒、柑橘酒、紅茶酒中香味成分的GC-MS 分析結(jié)果Table 7 GC-MS analysis results of aroma components in citrus black tea wine,citrus wine and black tea wine

續(xù)表7 柑橘紅茶酒、柑橘酒、紅茶酒中香味成分的GC-MS 分析結(jié)果Continue table 7 GC-MS analysis results of aroma components in citrus black tea wine,citrus wine and black tea wine

3 結(jié)論

本試驗采用微生物液態(tài)發(fā)酵的方法將柑橘與紅茶有機結(jié)合，通過單因素及正交試驗優(yōu)化，得到柑橘紅茶酒最佳發(fā)酵工藝條件為：柑橘汁與紅茶汁質(zhì)量比1∶15，初始糖度24%，初始pH 值4.5，酵母接種量7%，發(fā)酵溫度24 ℃，發(fā)酵時間7 d。采用該工藝制作的柑橘紅茶酒酒體澄清透亮，口感豐富、醇厚，酸甜適中，果香、茶香宜人，酒體協(xié)調(diào)。經(jīng)GC-MS 檢測，發(fā)酵型柑橘紅茶酒中共檢測出30 種香味物質(zhì)，主體香氣成分有苯乙醇、異戊醇、辛酸乙酯、癸酸乙酯、異丁醇、乙酸乙酯、十二酸乙酯等，是影響發(fā)酵型柑橘紅茶酒品質(zhì)、風(fēng)味與特征的主要物質(zhì)。當(dāng)前，有關(guān)茶酒的特征風(fēng)味成分研究較少，不同檢測方法及條件之間差異較大，有些物質(zhì)甚至無法檢出，未來有待對茶酒的風(fēng)味物質(zhì)檢測方法與條件進行進一步研究。