復(fù)方土茯苓顆粒對(duì)急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎兔的抗炎作用

李靜， 黃輝， 武鵬， 孫維峰

（中國(guó)人民解放軍南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院，廣東廣州 510010）

痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎是由于尿酸鹽沉積在軟骨、骨質(zhì)、滑囊、關(guān)節(jié)囊和其他組織中引起的炎性反應(yīng)[1]。目前，臨床上治療痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎急性期的藥物主要有秋水仙堿、非甾體抗炎藥、糖皮質(zhì)激素等[2]，然而，長(zhǎng)期服用極易引起肝腎功能受損、胃腸道反應(yīng)，且癥狀反復(fù)發(fā)作[3]。而中醫(yī)藥因其價(jià)廉、效專(zhuān)、副作用少等優(yōu)點(diǎn)受到廣泛青睞[4]。復(fù)方土茯苓顆粒為本研究組孫維峰教授經(jīng)驗(yàn)方研制而成的軍隊(duì)醫(yī)院非標(biāo)準(zhǔn)制劑，已獲得國(guó)家發(fā)明專(zhuān)利（專(zhuān)利號(hào)：ZL2007100323.3），該藥以利濕泄?jié)帷⒒奠铕鰹橹蝿t，在臨床上使用10 余年治療高尿酸血癥及痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎間歇期具有較好的療效[5-6]。為進(jìn)一步觀察復(fù)方土茯苓顆粒對(duì)痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的治療效果，為其臨床合理應(yīng)用提供參考，本研究以急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎兔模型為研究對(duì)象，觀察復(fù)方土茯苓顆粒的干預(yù)作用及機(jī)制，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 56 只普通級(jí)雄性新西蘭兔，4 ～5 周齡，體質(zhì)量1.83～2.3 kg，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：0023116，購(gòu)自青島康大生物科技有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（魯）2012-0005。飼養(yǎng)在廣東萊恩醫(yī)藥研究院有限公司實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，飼養(yǎng)環(huán)境為23 ℃、60%相對(duì)濕度、12 h 循環(huán)照明，自由進(jìn)食和飲水。實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)廣東萊恩醫(yī)藥研究院有限公司IACUC的同意和認(rèn)可。

1.2 藥物與試劑 復(fù)方土茯苓顆粒（中國(guó)人民解放軍南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院生產(chǎn)，批號(hào)：140601）；秋水仙堿片（西雙版納藥業(yè)有限責(zé)任公司生產(chǎn)，批號(hào)：150431）；痛風(fēng)舒膠囊（青海綠色藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：150101）。羧甲基纖維素鈉（CMC-Na，江蘇永華精細(xì)化學(xué)品有限公司，批號(hào)：20120220）；尿酸鈉（美國(guó)Sigma公司）；硫酸多黏菌素B[格雷西亞（成都）化學(xué)技術(shù)有限公司]；兔抗白細(xì)胞介素（IL）-1β、IL-8 酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA）試劑盒（大連泛邦化工技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司）。

1.3 儀器 XT-2000iv型血液分析儀（日本希森美康株式會(huì)社）；ASP300S 全自動(dòng)組織脫水機(jī)、EG1150H石蠟包埋機(jī)、RM2016切片機(jī)、HI1210攤片機(jī)、HI1220 烘片機(jī)、DM3000（ebp100-04-L 熒光）型生物顯微鏡、病理圖像分析系統(tǒng)DFC450+圖像采集軟件Leica Application Suite V4（德國(guó)Leica公司）；Elx808型酶標(biāo)儀（美國(guó)BioTek公司）。

1.4 藥物制備 尿酸鈉，用生理鹽水配制成2.5%尿酸鈉溶液。硫酸多黏菌素B，用生理鹽水配制成10 U/mL工作液。參考《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》[7]，復(fù)方土茯苓顆粒成人臨床擬用量為每次1.5 g，每天2次口服，即3 g·d-1·人-1，按體表面積折算兔的等效劑量為0.14 g 藥粉（2.45 g 生藥）/kg。根據(jù)上述依據(jù)設(shè)定復(fù)方土茯苓顆粒低、中、高組劑量分別為0.14、0.28、0.56 g/kg，按體表面積等效劑量折算法折算，約相當(dāng)于成人臨床日擬用量（3 g）的1、2、4倍。設(shè)陽(yáng)性對(duì)照藥物秋水仙堿劑量為0.093 mg/kg，按體表面積等效劑量折算法折算，約相當(dāng)于成人臨床預(yù)防日擬用量（1 mg·d-1·人-1）的2 倍。設(shè)陽(yáng)性對(duì)照藥物痛風(fēng)舒膠囊劑量為0.336 g/kg，按體表面積等效劑量折算法折算，約相當(dāng)于成人臨床日擬用量（3.6 g·d-1·人-1）的2倍。復(fù)方土茯苓低、中、高劑量組，秋水仙堿組，痛風(fēng)舒組，分別用0.5%CMC-Na溶液適配制成濃度分別為0.028、0.056、0.112 g/mL，0.018 6 mg/mL，0.067 2 g/mL的混懸液。

1.5 動(dòng)物分組、給藥與造模 將新西蘭兔隨機(jī)分為7組，分別為正常組、模型組、秋水仙堿組、痛風(fēng)舒組及復(fù)方土茯苓低、中、高劑量組，每組8 只。動(dòng)物劑量根據(jù)成人劑量以體表面積換算法換算，給藥容積為5 mL/kg。各給藥組按設(shè)定要求灌胃給藥，正常組、模型組給予灌胃等體積的0.5%CMC-Na溶液，每日1次，連續(xù)9 d。第9天給藥后1 h，除正常組外，其余各組進(jìn)行急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎造模，方法參考MeCarty 研究[8]：造模前用3%戊巴比妥鈉溶液麻醉兔，將兔左膝關(guān)節(jié)周?chē)撁⑾酒つw，輕彎左膝關(guān)節(jié)后向關(guān)節(jié)側(cè)方進(jìn)針，將2.5%尿酸鈉溶液0.4 mL（10 mg）和多黏菌素B 溶液0.1 mL（10 U/mL）注入關(guān)節(jié)腔，以對(duì)側(cè)關(guān)節(jié)囊鼓起為注入成功標(biāo)準(zhǔn)。每組分別在造模前（0 h）和造模后2、4、5 h，測(cè)量左膝關(guān)節(jié)同一部位的周長(zhǎng)，測(cè)量3次，取平均值。

1.6 觀察指標(biāo)與方法

1.6.1 關(guān)節(jié)液白細(xì)胞計(jì)數(shù)及IL-1β、IL-8 含量測(cè)定 以3%戊巴比妥鈉溶液麻醉放血處死動(dòng)物，切取膝關(guān)節(jié)（脛腓骨上1/3段至股骨下1/3骨段，去除關(guān)節(jié)周?chē)募∪獾扔步M織，保留完整的關(guān)節(jié)囊），用0.9%氯化鈉注射液1 mL 灌洗關(guān)節(jié)腔，收集關(guān)節(jié)液，離心取上清液分裝于EP 管中，部分用于進(jìn)行白細(xì)胞計(jì)數(shù)，其余上清液于-80 ℃保存。應(yīng)用血液分析儀測(cè)定白細(xì)胞數(shù)目。按ELISA 試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定IL-1β 和IL-8 水平，使用酶標(biāo)儀于450 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算IL-1β、IL-8含量。

1.6.2 HE 染色法觀察滑膜組織病理學(xué)變化 將滑膜組織以多聚甲醛溶液固定后，3%硝酸脫鈣8 d，用0.1%氨水中和1 h，梯度乙醇脫水；二甲苯透明，石蠟包埋；切片后，用蘇木素和伊紅對(duì)切片進(jìn)行染色；最后在顯微鏡下觀察并采圖。

1.7 統(tǒng)計(jì)方法 應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。各組采用Student-T檢驗(yàn)（配對(duì)T檢驗(yàn)）與給藥前進(jìn)行比較統(tǒng)計(jì)；各實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行組間比較之前先進(jìn)行組間方差分析（F檢驗(yàn)）。當(dāng)組間方差齊同時(shí)，組間比較采用Student-T檢驗(yàn)（非配對(duì)的T檢驗(yàn)）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；組間方差不齊時(shí)，采用校正的Student-T檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 復(fù)方土茯苓顆粒對(duì)急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎兔左膝關(guān)節(jié)腫脹度的影響 表1 結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組兔左膝關(guān)節(jié)腫脹度增加，造模后2 h腫脹度達(dá)到高峰（P＜0.05）；與模型組比較，各給藥組的左膝關(guān)節(jié)腫脹度得到不同程度減小，其中秋水仙堿組、痛風(fēng)舒組和復(fù)方土茯苓中、高劑量組造模后4 h膝關(guān)節(jié)腫脹程度明顯降低（P＜0.05）。表明復(fù)方土茯苓顆?？擅黠@緩解急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎兔膝關(guān)節(jié)腫脹。

表1 各組兔左膝關(guān)節(jié)腫脹度比較Table 1 Comparison of joint swelling in left knee among various groups of rabbits （，cm）

表1 各組兔左膝關(guān)節(jié)腫脹度比較Table 1 Comparison of joint swelling in left knee among various groups of rabbits （，cm）

注：①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較

組別正常組模型組秋水仙堿組痛風(fēng)舒組復(fù)方土茯苓低劑量組復(fù)方土茯苓中劑量組復(fù)方土茯苓高劑量組造模后5 h 9.48±0.08 9.96±0.13①9.80±0.11 9.81±0.08 9.82±0.13 9.82±0.08 9.78±0.08兔數(shù)/只8888888造模前（0 h）9.52±0.13 9.44±0.05 9.48±0.04 9.48±0.08 9.50±0.09 9.46±0.08 9.50±0.08造模后2 h 9.46±0.05 10.19±0.15①9.86±0.11②9.98±0.19 10.03±0.20 10.00±0.17 9.90±0.16②造模后4 h 9.48±0.04 10.07±0.11①9.80±0.17②9.82±0.11②9.90±0.12 9.84±0.09②9.80±0.09②

2.2 復(fù)方土茯苓顆粒對(duì)急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎兔關(guān)節(jié)炎癥的影響

2.2.1 各組兔關(guān)節(jié)液白細(xì)胞計(jì)數(shù)比較 圖1 結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組關(guān)節(jié)液白細(xì)胞計(jì)數(shù)顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，各給藥組關(guān)節(jié)液白細(xì)胞計(jì)數(shù)未見(jiàn)顯著性差異（P＞0.05），但各給藥組白細(xì)胞計(jì)數(shù)均有降低的趨勢(shì)，以復(fù)方土茯苓高劑量組降低效果最明顯。

圖1 各組兔關(guān)節(jié)液白細(xì)胞計(jì)數(shù)比較Figure 1 Comparison of white blood cell count in joint fluid among various groups of rabbits（）

2.2.2 各組兔關(guān)節(jié)液炎癥因子IL-1β、IL-8 水平比較 圖2結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組兔關(guān)節(jié)液中IL-1β、IL-8 水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，各給藥組兔關(guān)節(jié)液中IL-1β、IL-8水平明顯降低，其中，復(fù)方土茯苓高劑量組、秋水仙堿組、痛風(fēng)舒組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。提示復(fù)方土茯苓顆?？娠@著抑制急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎兔膝關(guān)節(jié)液中炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生。

圖2 各組兔關(guān)節(jié)液炎癥因子IL-1β、IL-8水平比較（）Figure 2 Comparison of the levels of inflammatory cytokines IL-1β and IL-8 in the joint fluid among various groups of rabbits（）

2.3 復(fù)方土茯苓顆粒對(duì)急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎兔滑膜組織病理學(xué)形態(tài)的影響 圖3結(jié)果顯示：正常組滑膜細(xì)胞呈扁平上皮樣，滑膜細(xì)胞層下未見(jiàn)炎細(xì)胞浸潤(rùn)，深層纖維組織未見(jiàn)明顯異常；模型組可見(jiàn)大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，并向深層組織蔓延，主要為淋巴細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞；秋水仙堿組及復(fù)方土茯苓中劑量組可見(jiàn)局部有一些炎細(xì)胞浸潤(rùn)，少量向深層組織蔓延；痛風(fēng)舒組可見(jiàn)大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，少量向深層組織蔓延；復(fù)方土茯苓低劑量組可見(jiàn)大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，并向深層組織蔓延；復(fù)方土茯苓高劑量組可見(jiàn)少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，未向深層組織蔓延?？梢?jiàn)，秋水仙堿組、痛風(fēng)舒組及復(fù)方土茯苓高劑量組滑膜組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和增生較模型組均有不同程度的減輕，其中，復(fù)方土茯苓高劑量組改善效果最明顯。

圖3 各組兔滑膜組織病理學(xué)形態(tài)比較（HE染色，×100）Figure 3 Comparison of synovial histopathological morphology among various groups of rabbits（HE staining，×100）

3 討論

尿酸鈉致兔急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎是經(jīng)典的痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型。兔是解熱、抗炎試驗(yàn)首選動(dòng)物，白色兔的炎癥反應(yīng)較為劇烈，因此，本研究選用新西蘭兔。因藥理劑量的雌激素有抗炎與免疫的抑制作用，故選擇雄性動(dòng)物進(jìn)行試驗(yàn)[9]。有研究[10]顯示，痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎是中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥，中性粒細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞粘連是急性痛風(fēng)產(chǎn)生的本質(zhì)。體內(nèi)尿酸鈉晶體作用于血小板、中性粒細(xì)胞、滑膜細(xì)胞、單核細(xì)胞，刺激細(xì)胞釋放多種炎癥介質(zhì)引起痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生，其中IL-1β、IL-8 作為炎癥趨化因子和激活因子在痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起重要作用[11]。本研究通過(guò)建立兔痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型主要是考察炎癥反應(yīng)情況，取兔關(guān)節(jié)腔灌洗液檢測(cè)白細(xì)胞和炎癥因子IL-1β、IL-8等炎癥因子指標(biāo)，并觀察滑膜組織病理情況。因有必要排除由于內(nèi)毒素等因素引起的炎癥所造成的炎癥因子升高，而多粘菌素B是針對(duì)革蘭陰性菌的窄譜抗生素，主要用于局部給藥，如燒傷創(chuàng)面等，其全身吸收性差，口服不吸收，局部用藥對(duì)動(dòng)物影響較小，因此，本研究選用多粘菌素B作為輔助抗生素添加[9]。

復(fù)方土茯苓顆粒是本院孫維峰教授根據(jù)嶺南地區(qū)高尿酸血癥患者的病機(jī)特點(diǎn)及臨床治療經(jīng)驗(yàn)研制出的中藥制劑。方中土茯苓為君藥，健脾除濕，泄?jié)峤舛?，通利關(guān)節(jié)；萆薢助君藥分清泄?jié)?、祛風(fēng)濕，為方中臣藥；佐使藥王不留行活血通絡(luò)利水，山慈菇能清熱解毒、消癰散結(jié)，牛膝活血通經(jīng)、利尿通淋，引萆薢、土茯苓等藥到達(dá)下焦，從而瀉體內(nèi)痰濕瘀血等濁邪于體外。全方共奏利濕泄?jié)?、化痰祛瘀之功。該方降尿酸的療效已得到臨床及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的證實(shí)[12-15]。本課題組前期現(xiàn)究在細(xì)胞水平發(fā)現(xiàn)，復(fù)方土茯苓顆粒含藥血清可通過(guò)上調(diào)大鼠滑膜細(xì)胞miR-146a 的表達(dá)，抑制IL-1β/IL-6，從而緩解炎癥反應(yīng)[16]。為進(jìn)一步探討復(fù)方土茯苓顆粒的抗炎作用，本課題組構(gòu)建了尿酸鈉誘導(dǎo)的急性兔痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型，觀察其對(duì)炎癥反應(yīng)的影響。

本研究結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組兔左膝關(guān)節(jié)明顯腫脹，關(guān)節(jié)液白細(xì)胞計(jì)數(shù)顯著升高，關(guān)節(jié)液IL-1β、IL-8水平顯著升高，滑膜組織病理學(xué)結(jié)果可見(jiàn)，膝關(guān)節(jié)囊內(nèi)滑膜表面及滑膜細(xì)胞下層炎細(xì)胞分布密集，主要為淋巴細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞，并向深層纖維組織蔓延的趨勢(shì)，表明痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎兔模型構(gòu)建成功。經(jīng)過(guò)預(yù)防性給藥后，秋水仙堿組和復(fù)方土茯苓高劑量組膝關(guān)節(jié)腫脹程度較模型組明顯降低（P＜0.05），復(fù)方土茯苓中、高劑量組關(guān)節(jié)液白細(xì)胞計(jì)數(shù)與模型組比較有降低趨勢(shì)，復(fù)方土茯苓高劑量組、秋水仙堿組、痛風(fēng)舒組兔關(guān)節(jié)液中IL-1β、IL-8水平較模型組明顯降低（P＜0.05），秋水仙堿組、痛風(fēng)舒組及復(fù)方土茯苓中、高劑量組滑膜組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和增生較模型組均有不同程度的減輕，其中，復(fù)方土茯苓高劑量組改善效果最明顯。表明復(fù)方土茯苓可一定程度地抑制痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎兔的炎癥反應(yīng)，以高劑量效果最佳。在減低膝關(guān)節(jié)腫脹度方面，復(fù)方土茯苓顆粒的療效與秋水仙堿相當(dāng)，在抑制炎癥因子、減輕滑膜炎癥方面，復(fù)方土茯苓顆粒的療效與秋水仙堿和痛風(fēng)舒膠囊均相當(dāng)，而在減少關(guān)節(jié)液白細(xì)胞聚集方面，復(fù)方土茯苓顆粒的療效優(yōu)于秋水仙堿和痛風(fēng)舒膠囊。

綜上所述，復(fù)方土茯苓顆粒有一定的抗急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎作用，可明顯減輕急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎兔關(guān)節(jié)腫脹，降低關(guān)節(jié)液白細(xì)胞數(shù)量及IL-1β、IL-8水平，改善滑膜炎癥，以高劑量效果為最佳。