ceDNA、循環(huán)核小體、NET、IL-18、hs-CRP對老年靜脈血栓栓塞患者預(yù)后的預(yù)測價(jià)值

張?jiān)?，路彩霞，董素敏，孫美蘭

1 石家莊市人民醫(yī)院心血管內(nèi)科二病區(qū)，石家莊 050011；2 河北省滄州中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院急診科；3 河北省滄州中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院介入血管外科；4 石家莊市人民醫(yī)院建安病區(qū)

老年靜脈血栓栓塞（VTE）是指老年患者血液成分在心臟和靜脈血管腔內(nèi)形成的血凝塊，常由于機(jī)械、感染、免疫和血管自身病變造成血管內(nèi)皮功能損傷，并通過止血機(jī)制促使血栓形成［1］。隨疾病進(jìn)展，血栓栓子發(fā)生脫落后導(dǎo)致組織缺血性改變，嚴(yán)重者發(fā)生肺栓塞［2-3］。因此早期診斷對老年VTE 治療和預(yù)后有重要意義。循環(huán)核酸（cfDNA）是指在循環(huán)血液中游離于細(xì)胞外的DNA，其中包括游離的內(nèi)源性循環(huán)DNA 和外源性循環(huán)DNA（ceDNA）。ceDNA 廣泛存在于動(dòng)物及人體血液中，已成為多種疾病診斷和預(yù)后判斷的重要分子標(biāo)記物，其參與炎癥和血栓的形成與進(jìn)展［4-5］。核小體是染色質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)單位，通過內(nèi)源性凝血途徑促進(jìn)血管內(nèi)血液凝集，故推測核小體所誘導(dǎo)的凝血可能參與了VTE 的發(fā)生。中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)（NET）是由嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞和單核細(xì)胞在外在刺激作用下釋放的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，可以捕獲細(xì)菌、真菌等病原微生物，其水平升高可促進(jìn)炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致周圍組織損傷［6］。VTE 的發(fā)生常與慢性感染、免疫有關(guān)，IL-18、hs-CRP作為臨床常見的炎癥指標(biāo)，在VTE 發(fā)生時(shí)水平會(huì)發(fā)生相應(yīng)改變。但目前以上指標(biāo)在老年VTE 患者中的作用報(bào)道較少。故本研究探討ceDNA、循環(huán)核小體、NET和炎癥指標(biāo)對老年VTE 患者預(yù)后的預(yù)測價(jià)值，旨在為臨床診斷與治療提供參考。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2018 年1 月—2021 年1 月石家莊市人民醫(yī)院收治的老年VTE 患者100 例（VTE組）。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)對VTE 的診斷與治療指南［7］，臨床表現(xiàn)為患肢疼痛、腫脹和軟組織張力上升，實(shí)驗(yàn)室檢查D-2 聚體＞500 μg/L，經(jīng)多普勒超聲檢查確診。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并惡性腫瘤、自身免疫性疾病、血液系統(tǒng)疾??；臨床資料不完整。并同期選取行VTE 篩查的無VTE 老年人100 例（無VTE 組）。VTE 組男62 例、女38 例，年齡60～71（65.32 ± 2.37）歲，合并高血壓65 例、糖尿病39 例。無VTE 組男65例、女35例，年齡61～70（65.49 ± 2.21）歲，合并高血壓69例、糖尿病34例。兩組性別、年齡、基礎(chǔ)疾病比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者及家屬簽署知情同意書。

1.2 血液標(biāo)本采集 于入組后采集兩組空腹靜脈血5 mL，置于真空抗凝試管，混勻后采用德國Hettich MIKRO220/220R 離心機(jī)離心，3 000 r/min離心10 min，離心半徑為4 cm，分離血漿、血清。

1.3 ceDNA 檢測 采用激光誘導(dǎo)熒光技術(shù)。將檸檬酸鹽血漿在含有0.1%牛血清白蛋白（BSA）和5 mm EDTA 的磷酸鹽緩沖鹽水稀釋緩沖液中稀釋20 倍；將50 μL 稀釋的血漿與50 μL 含有熒光DNA嵌入染料的PBS 混合，在多板熒光計(jì)中記錄熒光。以無DNA 染料的PBS 混合樣品為背景，測定其自身熒光。

1.4 循環(huán)核小體檢測 采用激光誘導(dǎo)熒光技術(shù)。用5 μg抗DNA 組蛋白H2A/H2B 復(fù)合抗體包被微量滴定板，將板用2% BSA 和1%干粉在37 ℃封閉1 h，并用PBS-Tween（PBS-T）洗滌1 次；將在PBS 中稀釋10 倍的血漿樣品加入孔中，并在37 ℃溫育30 min，用PBS-T 洗滌孔3 次；加入含有1% Picogreen 的PBS，用多板熒光計(jì)記錄熒光。

1.5 中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)（NET）檢測 采用激光誘導(dǎo)熒光技術(shù)。用1 μg 抗DNA 組蛋白H2A/H2B復(fù)合抗體包被微量滴定板，將板用2% BSA 和1%干粉在37 ℃封閉1 h。將血漿在含有2 mmol/L EDTA和0.1% BSA 的PBS 稀釋緩沖液中稀釋20 倍，將稀釋的血漿加入孔中并在37 ℃溫育1 h；清洗培養(yǎng)皿，在37 ℃下與1 μg/mL兔抗人MPO 抗體在0.1% BSA的PBS 中溫育15 min；洗滌后用0.1 μg/mL 辣根過氧化物酶（HRP）結(jié)合的山羊抗兔IgG 抗體在37 ℃下孵育15 min，檢測抗MPO 抗體；洗滌后，使用ABTS溶液檢測HRP 活性，從活化的嗜中性粒細(xì)胞中分離NET并用作陽性對照。

1.6 血清炎癥指標(biāo)檢測 采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測IL-18，儀器選擇小型VIPAS 全自動(dòng)熒光酶標(biāo)儀，試劑和試劑盒由武漢菲恩生物科技有限公司提供；采用乳膠增強(qiáng)免疫比濁法檢測hs-CRP。選擇VIDAS 型全自動(dòng)熒光免疫分析儀，試劑和試劑盒由四川邁克生物科技股份有限公司提供，嚴(yán)格按儀器與試劑說明書進(jìn)行操作。

1.7 預(yù)后隨訪 3個(gè)月后隨訪VTE組存活81例（存活組）、死亡19例（死亡組）。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0 統(tǒng)計(jì)軟件。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，兩組比較采用t檢驗(yàn)。用受試者工作特征（ROC）曲線分析各指標(biāo)對患者預(yù)后的預(yù)測價(jià)值，曲線下面積比較采用De-Long's test。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 VTE 組與無VTE 組ceDNA、循環(huán)核小體、NET、IL-18、hs-CRP 比較 VTE 組ceDNA、循環(huán)核小體、NET、IL-18、hs-CRP 高 于 無VTE 組（P均＜0.05），見表1。

表1 VTE組與無VTE組ceDNA、循環(huán)核小體、NET、IL-18、hs-CRP比較（±s）

表1 VTE組與無VTE組ceDNA、循環(huán)核小體、NET、IL-18、hs-CRP比較（±s）

組別VTE組無VTE組P n 100 100 ceDNA（FU）100.35 ± 10.28 62.17 ± 6.19＜0.05循環(huán)核小體（FU）24.44 ± 2.51 17.71 ± 1.85＜0.05 NET（OD值）0.06 ± 0.02 0.04 ± 0.01＜0.05 IL-18（ng/mL）145.39 ± 14.53 122.27 ± 12.29＜0.05 hs-CRP（mg/L）8.25 ± 1.34 3.14 ± 0.35＜0.05

2.2 存活組與死亡組ceDNA、循環(huán)核小體、NET、IL-18、hs-CRP 比較 死亡組ceDNA、循環(huán)核小體、NET、IL-18、hs-CRP 水平高于存活組（P均＜0.05），見表2。

表2 存活組與死亡組ceDNA、循環(huán)核小體、NET、IL-18、hs-CRP比較（±s）

表2 存活組與死亡組ceDNA、循環(huán)核小體、NET、IL-18、hs-CRP比較（±s）

組別死亡組存活組P n 19 81 ceDNA（FU）139.17 ± 11.32 91.23 ± 9.52＜0.05循環(huán)核小體（FU）28.34 ± 2.85 23.52 ± 2.16＜0.05 NET（OD）0.08 ± 0.02 0.05 ± 0.01＜0.05 IL-18（ng/mL）185.37 ± 15.34 135.69 ± 13.34＜0.05 hs-CRP（mg/L）10.14 ± 1.29 7.83 ± 0.66＜0.05

2.3 ceDNA、循環(huán)核小體、NET、IL-18、hs-CRP 對VTE 患者預(yù)后的預(yù)測價(jià)值 ceDNA、循環(huán)核小體、NET、IL-18、hs-CRP 單獨(dú)及聯(lián)合檢測預(yù)測VTE 患者預(yù)后的曲線下面積分別為0.731、0.674、0.707、0.658、0.665、0.847，聯(lián)合檢測預(yù)測價(jià)值更高（P均＜0.05），見表3。

表3 ceDNA、循環(huán)核小體、NET、IL-18、hs-CRP對VTE患者預(yù)后的預(yù)測價(jià)值

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，血栓形成與機(jī)體固有免疫系統(tǒng)關(guān)系密切，其中中性粒細(xì)胞可釋放NET 促進(jìn)血栓形成，ceDNA 表達(dá)水平可在一定程度上反映血栓內(nèi)NET的形成［8］。因此ceDNA逐漸引起學(xué)者關(guān)注。

ceDNA 具有雙螺旋結(jié)構(gòu)，可單獨(dú)游離于血液中，也可以復(fù)合體形式存在，其作用是進(jìn)入人體細(xì)胞并傳遞遺傳信息。研究顯示，肺血栓患者線粒體DNA 水平、核DNA（nDNA）和ceDNA 水平顯著高于健康人群，但恢復(fù)期ceDNA 水平與健康人群無明顯差異［9］。核小體核心是由H2A、H2B、H3 和H4 各兩分子組成的8 聚體，長度大約為146 bp 的DNA 負(fù)超螺旋所構(gòu)成。當(dāng)細(xì)胞死亡時(shí)，Caspases 蛋白酶被激活，核酸內(nèi)切酶與核小體連接區(qū)結(jié)合并將染色質(zhì)分解為多聚寡核苷酸與單核小體，參與循環(huán)的核小體就稱為循環(huán)核小體。既往研究顯示，當(dāng)機(jī)體發(fā)生炎癥反應(yīng)時(shí)，免疫系統(tǒng)受到刺激，細(xì)胞死亡率升高，循環(huán)核小體清除減少［10］。NET是一種由顆粒衍生蛋白修飾的DNA 支架組成的胞外網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，包含多種活性物質(zhì)，而細(xì)菌、病毒、真菌及癌細(xì)胞等因素可通過復(fù)雜的活化模式誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞形成NET。已有研究顯示，NET 相關(guān)蛋白已顯示出誘導(dǎo)內(nèi)皮毒性和增加血栓形成的能力，尤其是循環(huán)中NET cfDNA 組蛋白在炎性作用下被NET 釋放，加劇炎性損害，造成惡性循環(huán)［11］。IL-18 是具有多種生物活性的炎癥因子，參與免疫調(diào)節(jié)與炎癥反應(yīng)，其作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，并促使細(xì)胞凋亡信號活化，導(dǎo)致細(xì)胞生長與功能異常，激活血管內(nèi)皮細(xì)胞核因子-κB（NF-κB）進(jìn)而誘導(dǎo)內(nèi)皮因子死亡。NF-κB頻繁激活可調(diào)節(jié)機(jī)體多種炎癥因子水平，促進(jìn)炎癥進(jìn)展，引起細(xì)胞損傷［12］，引發(fā)靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞的生理功能障礙，促進(jìn)血栓進(jìn)展。hs-CRP 是具有高敏感性的炎癥指標(biāo)，在機(jī)體受到損傷時(shí)顯著升高，誘導(dǎo)單核細(xì)胞合成組織因子，激活外源性凝血途徑，促使VTE形成。

本研究發(fā)現(xiàn)，VTE 組ceDNA、循環(huán)核小體、NET 、IL-18、hs-CRP高于無VTE組。推測原因可能是由于VTE 患者內(nèi)皮細(xì)胞的生理功能發(fā)生障礙，使血液中ceDNA含量增加，誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞形成NET，加劇了內(nèi)皮細(xì)胞炎性損害，釋放大量炎癥因子（IL-18、hs-CRP等），且激活血管內(nèi)皮細(xì)胞中相關(guān)信號通路，引起內(nèi)皮細(xì)胞損傷，進(jìn)一步促進(jìn)血栓的發(fā)展。本研究隨訪3個(gè)月，存活組ceDNA、循環(huán)核小體、NET、IL-18、hs-CRP水平高于死亡組。提示ceDNA、循環(huán)核小體、NET、IL-18、hs-CRP對VTE患者的預(yù)后具有預(yù)測價(jià)值。且ROC分析可見，ceDNA預(yù)測VTE患者預(yù)后的曲線下面積高于循環(huán)核小體、NET、IL-18、hs-CRP。研究顯示，ceDNA 是老年VTE 患者死亡的獨(dú)立預(yù)測因子［13］，這與本研究中部分觀點(diǎn)一致；且研究結(jié)果顯示以上指標(biāo)聯(lián)合檢測對VTE 患者預(yù)后有較高的預(yù)測價(jià)值。提示ceDNA 有望成為預(yù)測VTE 預(yù)后的分子標(biāo)志物，但單一檢測易造成誤檢與漏檢，故可與其他指標(biāo)聯(lián)合檢測以提高預(yù)測效能。

綜上所述，臨床可通過聯(lián)合檢測ceDNA、循環(huán)核小體、NET、IL-18 和hs-CRP 預(yù)測VTE 預(yù)后，并通過控制炎癥及細(xì)胞內(nèi)皮損傷改善患者預(yù)后。