結(jié)直腸癌組織中miR-876-5p、PAX6 mRNA表達(dá)變化及意義

徐杰，張樹朋，李照晉，邵建平

天津市第五中心醫(yī)院普外科，天津 300450

據(jù)全球癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，2020 年我國結(jié)直腸癌新發(fā)病例為55.5 萬例，死亡病例28.6 萬例［1］；預(yù)計2022年新發(fā)病例和死亡病例分別為59.2、30.9萬例［2］。盡管近年來結(jié)直腸癌的診治取得了一定進(jìn)展，但患者預(yù)后仍然較差，因此還需進(jìn)一步探索結(jié)直腸癌發(fā)病的分子機(jī)制。研究表明，非編碼RNA 參與結(jié)直腸癌進(jìn)展［3］。微小RNA（miRNA）是一種小分子非編碼RNA，miRNA-876-5p 是miRNA 家族的一個新成員。miR-876-5p 參與髓母細(xì)胞瘤、肝癌等惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展［4-5］。配對框基因6（PAX6）是一種多功能轉(zhuǎn)錄因子，能通過調(diào)節(jié)下游靶基因轉(zhuǎn)錄參與多種惡性腫瘤細(xì)胞增殖、分化、侵襲、凋亡［6-7］。本研究通過TargetScan 數(shù)據(jù)庫預(yù)測發(fā)現(xiàn)，miR-876-5p 與PAX6 存在結(jié)合位點(diǎn)，但關(guān)于結(jié)直腸癌組織中miR-876-5p、PAX6 表達(dá)變化及意義尚缺乏報道。基于此，本研究做了相關(guān)探討，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2018年1月—2019年10月本院收治的86例結(jié)直腸癌患者，均經(jīng)術(shù)后病理學(xué)檢查確診。其中男51 例，女35 例；≥60 歲41 例、＜60 歲45例；腫瘤部位：直腸55 例、結(jié)腸31 例；腫瘤最大徑≥5 cm 24 例、＜5 cm 62 例；分化程度：低分化35 例、中高分化51 例；TNM 分期［8］：Ⅰ期17 例Ⅱ期、21 例、Ⅲ期48 例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移35 例、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移31 例。納入標(biāo)準(zhǔn)：初診且入院前未接受任何抗腫瘤治療；TNM 分期Ⅰ～Ⅲ期；接受姑息性或根治性手術(shù)；患者或家屬簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并克羅恩病、潰瘍結(jié)腸炎等其他腸道疾??；合并全身性感染性疾病、自身免疫性疾病、其他部位惡性腫瘤；年齡＜18 歲；臨床資料不完整或不能接受隨訪；院內(nèi)死亡。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 miR-876-5p 與PAX6 的關(guān)系預(yù)測 用TargetScan 數(shù)據(jù)庫（https：//www. targetscan. org/）預(yù)測miR-876-5p與PAX6的關(guān)系。

1.3 結(jié)直腸癌組織和癌旁組織中miR-876-5p、PAX6 mRNA 表達(dá)檢測 采用RT-qPCR 法。術(shù)中留取部分癌組織和癌旁組織（距腫瘤邊緣＞2 cm）用液氮冷凍后研磨成粉末，TRIzol法提取組織總RNA，微量分光光度計驗(yàn)證純度、濃度合格后使用Takara 反轉(zhuǎn)錄試劑盒（上海翌圣生物科技股份有限公司）合成cDNA。參考SYBR?Premix Ex TaqTM試劑盒（廣州威佳科技有限公司）說明書進(jìn)行擴(kuò)增，引物設(shè)計和合成由上海生工生物工程股份有限公司完成。miR-876-5p 引物：上游 5′-ACACTCCAGCTGGGTTTGTGACCTGGTCCA-3′，下游5′-TGGTGTCGTGGAGTCGTGTCGTGGAGTC-3′；內(nèi)參U6引物：上游5′-CGCTTCGGCAGCACATATACTA-3′，下游5′-GCGAGCACAGAATTAATACGAC-3′；PAX6 引物：上游5′-TCTTTGCTTGGGAAATCCG-3′，下游5′-CTGCCCGTTCAACATCCTTAG-3′；內(nèi)參GAPDH 引物：上游5′-GGCACTGAGAAGCGGGGCCG-3′，下游5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′。 反應(yīng)條件：95 ℃ 90 s；95 ℃ 30 s，63 ℃ 30 s，72 ℃ 15 s，循環(huán)40次。用2-ΔΔCT法計算miR-876-5p、PAX6 mRNA 相對表達(dá)量。

1.4 預(yù)后分析 患者出院后通過門診或電話隨訪3年，隨訪至2022年10月或患者死亡，計算3年累積生存率。根據(jù)結(jié)直腸癌組織中miR-876-5p、PAX6 mRNA表達(dá)水平將患者分為miR-876-5p高表達(dá)組（≥0.59，n=42）、miR-876-5p 低表達(dá)組（＜0.59，n=44），PAX6 mRNA 高表達(dá)組（≥0.98，n=47）、PAX6 mRNA低表達(dá)組（＜0.98，n=39）。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS28.0 統(tǒng)計軟件。符合正態(tài)分布的計量資料以±s表示，兩組比較采用t檢驗(yàn)；計數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)；結(jié)直腸癌組織中miR-876-5p 與PAX6 mRNA 表達(dá)的相關(guān)分析用Pearson 相關(guān)法；繪制結(jié)直腸癌患者生存曲線，組間生存率比較用Log-rank 檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)直腸癌組織與癌旁組織中miR-876-5p、PAX6 mRNA表達(dá)比較 結(jié)直腸癌組織中miR-876-5p相對表達(dá)量低于癌旁組織，PAX6 mRNA相對表達(dá)量高于癌旁組織（P均＜0.05）。見表1。

表1 結(jié)直腸癌組織與癌旁組織中miR-876-5p、PAX6 mRNA表達(dá)比較（±s）

表1 結(jié)直腸癌組織與癌旁組織中miR-876-5p、PAX6 mRNA表達(dá)比較（±s）

組織癌組織癌旁組織P n 86 86 miR-876-5p 0.59 ± 0.11 0.98 ± 0.17＜0.05 PAX6 mRNA 0.98 ± 0.15 0.52 ± 0.08＜0.05

2.2 結(jié)直腸癌組織中miR-876-5p 與PAX6 mRNA表達(dá)的相關(guān)性 經(jīng)在線網(wǎng)站https：//www. targetscan. org/預(yù)測，miR-876-5p 與PAX6 的3'-非翻譯區(qū)691-697 存在結(jié)合位點(diǎn)。Pearson 相關(guān)分析顯示，結(jié)直腸癌組織中miR-876-5p 表達(dá)與PAX6 mRNA 表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.754，P＜0.05）。

2.3 結(jié)直腸癌組織中miR-876-5p、PAX6 mRNA 表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系 結(jié)直腸癌組織中miR-876-5p、PAX6 mRNA 表達(dá)與腫瘤分化程度、TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（P均＜0.05），與性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤最大徑無關(guān)（P均＞0.05）。見表2。

表2 結(jié)直腸癌組織中miR-876-5p、PAX6 mRNA表達(dá)與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系（±s）

表2 結(jié)直腸癌組織中miR-876-5p、PAX6 mRNA表達(dá)與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系（±s）

臨床病理參數(shù)性別 男 女年齡 ≥60歲 ＜60歲腫瘤部位 直腸 結(jié)腸腫瘤最大徑 ≥5 cm ＜5 cm分化程度 低分化 中高分化TNM分期 Ⅰ～Ⅱ期 Ⅲ期淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 有 無n 51 35 41 45 55 31 24 62 35 51 38 48 35 51 miR-876-5pimages/BZ_13_674_338_698_384.png±s 0.58 ± 0.11 0.60 ± 0.10 0.57 ± 0.11 0.60 ± 0.10 0.58 ± 0.11 0.61 ± 0.10 0.55 ± 0.10 0.60 ± 0.11 0.56 ± 0.10 0.61 ± 0.10 0.62 ± 0.11 0.56 ± 0.10 0.55 ± 0.09 0.62 ± 0.10 P＞0.05＞0.05＞0.05＞0.05＜0.05＜0.05＜0.05 PAX6 mRNAimages/BZ_13_674_338_698_384.png±s 0.98 ± 0.15 0.97 ± 0.15 0.99 ± 0.13 0.97 ± 0.16 1.00 ± 0.14 0.95 ± 0.15 1.02 ± 0.12 0.96 ± 0.15 1.02 ± 0.14 0.95 ± 0.15 0.93 ± 0.14 1.01 ± 0.14 1.03 ± 0.14 0.94 ± 0.14 P＞0.05＞0.05＞0.05＞0.05＜0.05＜0.05＜0.05

2.4 結(jié)直腸癌組織中miR-876-5p、PAX6 mRNA 表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系 86例結(jié)直腸癌患者隨訪6～36個月，失訪6 例，死亡18 例，3 年累積生存率為79.07%（68/86）。miR-876-5p 高表達(dá)組3 年累積生存率90.48%（38/42）高 于miR-876-5p 低 表 達(dá) 組 的68.18%（30/44）；PAX6 mRNA 高表達(dá)組3 年累積生存率70.21%（33/47）低于PAX6 mRNA 低表達(dá)組的89.74%（36/39），比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）。

3 討論

研究表明，表觀遺傳學(xué)在結(jié)直腸癌中扮演重要角色［9］。miRNA 是表觀遺傳學(xué)的一個新的研究熱點(diǎn)，能通過與mRNA 的3'-非翻譯區(qū)互補(bǔ)或配對引發(fā)mRNA 降解或轉(zhuǎn)錄后沉默，進(jìn)而調(diào)控結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展［10-11］。miR-876-5p 定位于人9 號染色體短臂21.1 處，最初研究發(fā)現(xiàn)miR-876-5p 能通過Toll 樣受體4/核因子-κB 信號通路參與炎癥級聯(lián)反應(yīng)；近年研究發(fā)現(xiàn)miR-876-5p 定還參與腫瘤過程，如miR-876-5p 能靶向G 蛋白亞基γ12 激活磷脂酰肌醇 3-激酶/蛋白激酶B 信號通路抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移［12］；同時能靶向G 蛋白偶聯(lián)受體激酶5 抑制三陰性乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移［13］。本研究結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌組織中miR-876-5p 表達(dá)降低，其機(jī)制可能是miR-876-5p 啟動子被甲基化導(dǎo)致表達(dá)沉默有關(guān)［12-13］。本研究結(jié)果還顯示，結(jié)直腸癌組織中miR-876-5p 表達(dá)與分化程度、TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，進(jìn)一步說明miR-876-5p 低表達(dá)參與結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展，其機(jī)制可能與miR-876-5p 能靶向RAS 蛋白激活樣因子2（RASAL2）有關(guān)。RASAL2 是一種RAS-GTP 酶激活蛋白，能通過誘導(dǎo)結(jié)直腸癌上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化促進(jìn)其發(fā)生發(fā)展［14］。REN 等［15］實(shí)驗(yàn)顯示，miR-876-5p 能靶向RASAL2 抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖和侵襲。

結(jié)直腸癌是多因素參與的復(fù)雜過程，其過程中伴隨多個基因的異常表達(dá)［16-17］。PAX6 是一種核轉(zhuǎn)錄因子，具備同源結(jié)構(gòu)域和配對結(jié)構(gòu)域兩個DNA 結(jié)合域，能通過識別和結(jié)合特點(diǎn)的DNA 序列盒，激活或抑制鈣黏蛋白、B 細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2、細(xì)胞周期蛋白D1、p21、p27等下游靶基因調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、侵襲、遷移和凋亡［18］?；赑AX6 對多種基因的調(diào)控作用，有大量研究報道了其與腫瘤的關(guān)系，如PAX6 能靶向抑制同源域轉(zhuǎn)錄因子1 增強(qiáng)胃癌細(xì)胞增殖和侵襲能力［19］；能靶向上調(diào)N-鈣黏蛋白、波形蛋白促進(jìn)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤增殖和侵襲［20］。本研究結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌組織中PAX6 mRNA 表達(dá)降低，其機(jī)制可能與PAX6 的啟動子被結(jié)直腸癌中原癌基因激活轉(zhuǎn)錄而大量表達(dá)有關(guān)［19-20］。本研究結(jié)果還顯示，結(jié)直腸癌組織中PAX6 mRNA 表達(dá)與分化程度、TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，進(jìn)一步說明PAX6 mRNA 高表達(dá)參與結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展，其機(jī)制可能與激活或抑制下游靶基因有關(guān)。如PAX6能上調(diào)N-鈣黏蛋白表達(dá)和抑制E-鈣黏蛋白表達(dá)，增強(qiáng)結(jié)直腸癌細(xì)胞活力，促進(jìn)其增殖和轉(zhuǎn)移［21］。通過TargetScan數(shù)據(jù)庫預(yù)測發(fā)現(xiàn)，miR-876-5p 與PAX6 存在結(jié)合位點(diǎn)，相關(guān)性分析也發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌組織中miR-876-5p與PAX6 mRNA 表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，提示二者可能共同參與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展。李程等［22］研究也報道，上調(diào)miR-876-5p 表達(dá)能靶向下調(diào)PAX6 表達(dá)，抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和促進(jìn)其凋亡。進(jìn)一步驗(yàn)證了本研究結(jié)果。為探究miR-876-5p、PAX6 與結(jié)直腸癌患者預(yù)后的關(guān)系，本研究通過隨訪發(fā)現(xiàn)，miR-876-5p 高表達(dá)和PAX6 mRNA 低表達(dá)的結(jié)直腸癌患者3 年累積生存率更高，提示miR-876-5p、PAX6 mRNA表達(dá)還與結(jié)直腸癌患者預(yù)后有關(guān)，有望成為結(jié)腸癌患者預(yù)后潛在指標(biāo)。

綜上所述，結(jié)直腸癌組織中miR-876-5p 高表達(dá)和PAX6 mRNA 低表達(dá)與病理參數(shù)和預(yù)后相關(guān)，二者可能共同參與結(jié)直腸癌進(jìn)展。但本研究樣本量較少且為臨床研究，還需進(jìn)一步大樣本研究證實(shí)，并深入研究miR-876-5p、PAX6參與結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制。