蛋白質(zhì)芯片在過敏性疾病診斷中的應(yīng)用①

李青青 崔玉寶 （南京醫(yī)科大學(xué)附屬無錫人民醫(yī)院臨床研究中心，無錫 214023）

IgE 是過敏性疾病的主要效應(yīng)分子，大多數(shù)過敏性疾病患者血清中IgE 抗體增加，檢測患者血清中過敏原特異性IgE 是過敏原查找的重要方法［1-3］。過敏原芯片基于成熟的高通量檢測技術(shù)，將過敏原分子固定于載體，通過檢測抗原抗體反應(yīng)檢測人血清中的特異性IgE，其靈敏度優(yōu)于傳統(tǒng)的免疫學(xué)檢測［4］。過敏原芯片一次檢測就可測量出過敏原分子IgE 過敏反應(yīng)譜，方便快捷、高通量、高靈敏度、高特異度的特點(diǎn)使其快速發(fā)展，成為過敏性疾病診斷和治療的重要輔助工具。本文講述過敏原粗提取物用于過敏性疾病診斷中的不足，重組過敏原的發(fā)展和應(yīng)用促進(jìn)了組分分辨診斷概念進(jìn)入臨床，介紹了過敏原芯片的發(fā)展和應(yīng)用、過敏原芯片在過敏性疾病中的診斷和應(yīng)用，并對將來的發(fā)展趨勢進(jìn)行了展望。

1 過敏原芯片的開發(fā)

1.1 基因重組過敏原的發(fā)展及應(yīng)用 過敏原粗提取物來自天然過敏物，如塵螨、花粉、海鮮等，其中包含許多蛋白質(zhì)和其他分子，只有引起機(jī)體特異性IgE 升高的物質(zhì)稱為過敏原，非過敏原物質(zhì)可能會(huì)刺激機(jī)體產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，卻不會(huì)產(chǎn)生過敏反應(yīng)［5］。一直以來Ⅰ型過敏反應(yīng)IgE 的檢測都是使用過敏原粗提取物，該檢測方法可判斷過敏原來源，但無法確定具體是哪個(gè)過敏原分子［6］。

為減少過敏原提取物成分和質(zhì)量的變化，使產(chǎn)品達(dá)到安全、精準(zhǔn)和有效的較高水平，歐洲研究者提出了過敏原標(biāo)準(zhǔn)化原則，包括主要過敏原生產(chǎn)和免疫特性的比較［7］。過敏原粗提液實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化的難度較大，成本昂貴，且對于疾病的診斷存在以下不足：①不同批次中過敏原組分不同；②不同批次中過敏原含量不確定；③粗提物中某種組分的過敏原濃度可能較低，無法與IgE 結(jié)合；④粗提物中除過敏成分外，包含了非過敏成分影響診斷；⑤無法判斷哪種組分過敏，更無法判斷哪些過敏原交叉過敏［8-11］。天然提取和純化過敏原已被證實(shí)價(jià)格昂貴且技術(shù)難度大。

隨著重組DNA 技術(shù)的發(fā)展，具有天然過敏原相同免疫學(xué)特性的重組過敏原被開發(fā)出來［6，12］。在獲得第一個(gè)過敏原的DNA 序列后不久，有研究表明樺樹花粉和草粉的重組過敏原可代替天然過敏原成分進(jìn)行血清學(xué)IgE 診斷，其特異度和敏感度并不會(huì)降低［13-14］。雖然這超乎當(dāng)時(shí)很多人的認(rèn)知：當(dāng)時(shí)認(rèn)為過敏原分子具有不同表型，不可能找出適用于所有患者的同型過敏原［15-16］。隨著重組過敏原的快速發(fā)展，組分分辨診斷（component-resolved diagnostics，CRD）的概念隨之產(chǎn)生并進(jìn)入臨床。

組分分辨診斷的宗旨是在分子水平上明確過敏原，進(jìn)一步了解過敏反應(yīng)機(jī)制，為診斷和療效評估提供有力證據(jù)。如樺樹花粉過敏患者在食用某些水果和蔬菜后會(huì)出現(xiàn)口腔過敏癥狀，對這類患者而言，不同過敏原中可能含有導(dǎo)致交叉過敏的分子［17-18］。

1.2 過敏原芯片的開發(fā)與發(fā)展 為了更好地利用重組過敏原蛋白進(jìn)行過敏性疾病的診斷，需要建立一個(gè)測試平臺，可方便快捷、直觀地繪制出過敏患者特異性IgE 反應(yīng)譜。見圖1?；谛酒夹g(shù)的發(fā)展，其被用于過敏原檢測芯片的開發(fā)，過敏原芯片上的分子保留完整的三級結(jié)構(gòu)，可檢測和定量分析血清特異性IgE 功能［19-20］。1999 年蛋白質(zhì)芯片被推出［21］；2002 年MANFRED MüLLER 等開發(fā)出了第一款用于過敏性疾病診斷的過敏原芯片，應(yīng)用微陣列技術(shù)將90多種過敏原分子共價(jià)結(jié)合于固相載體，研究發(fā)現(xiàn)只需要極少數(shù)血清即可檢測出IgE 反應(yīng)性，這個(gè)突破性的發(fā)現(xiàn)改變了過敏性疾病診斷，此后過敏原芯片開始成為過敏性疾病診斷的重要輔助工具［20］。過敏原芯片是利用微陣列點(diǎn)樣機(jī)將重組蛋白點(diǎn)樣至固有載體，載體可以是玻璃材質(zhì)的載玻片，也可以是纖維素膜。加入少量血清進(jìn)行反應(yīng)，使用全自動(dòng)化掃描儀檢測熒光強(qiáng)度來判斷特異性IgE含量，實(shí)驗(yàn)流程參考文獻(xiàn)［22］。

圖1 過敏原芯片檢測血清特異性IgE流程Fig.1 Principle of allergen microarray detection of serum specific IgE

迄今為止，市場上使用最廣泛的過敏原芯片是ImmunoCAP ISAC（112 種過敏原）和MeDALL allergen-Chip（176 種過敏原），MeDALL allergen-Chip 由歐盟基金資助（European Union-funded），用于研究歐洲過敏和哮喘兒童血清特異性IgE和IgG反應(yīng)，相較于ImmunoCAP ISAC 芯片增加了重要過敏原的數(shù)量，并提高了敏感度［23］。MADx Allergen Explorer ALEX 芯片上包含157 種過敏原提取物和125 種組分，共計(jì)282個(gè)過敏原［24］。

2 過敏原芯片在診斷中的應(yīng)用

2.1 吸入性過敏原檢測 ImmunoCAP ISAC（112種過敏原）檢測461例有哮喘、鼻炎、結(jié)膜炎、氣道高反應(yīng)性等過敏史的兒童血清，數(shù)據(jù)表明塵螨、花粉和寵物過敏原與哮喘高度相關(guān)，芯片對吸入性過敏原診斷是可靠的［25］。ISAC-CRD89（VBC-Genomics， Phadia，Sweden）芯 片 和Advia-Centaur 法 檢 測 對 120例花粉過敏患者血清進(jìn)行特異性IgE 檢測，比較兩種方法的Kappa、Spearman rho、Wilcoxon，發(fā)現(xiàn)除Par j 1 外均具有高度相關(guān)性，組分分辨診斷在30%的診斷結(jié)果中起到了補(bǔ)充修正作用［26］。Immuno-CAP 和過敏原芯片（ISAC?version CRD-50，VBC- GENOMICS，Vienna， Austria）兩種方法檢測過敏性鼻結(jié)膜炎患者血清中塵螨、貓皮屑、樺樹、草和艾蒿花粉的特異性IgE，受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic curve，ROC）結(jié)果顯示芯片可以替代ImmunoCAP 檢測塵螨、貓皮屑、樺樹、草特異性IgE，在檢測貓皮屑、樺樹花粉、草的敏感度與ImmunoCAP 相當(dāng)，在檢測塵螨和艾蒿花粉時(shí)敏感度稍低［27］。有研究檢測123例過敏患者血清塵螨總IgE、Der p 1、Der p 2、Der p 10 的特異性IgE 和患者血清中的IgG4，同時(shí)使用ImmunoCAP ISAC（103 種過敏原）檢測24 例患者的血清，檢測閾值為0.3 ISU/ml，定性結(jié)果與ImmunoCAP完全一致，在Der p 1和Der p特異性IgE 檢測結(jié)果中兩者結(jié)果具有較好的相關(guān)性，在檢測Der p 10 的特異性IgE 時(shí)，5 份血清用ISAC 法無法檢測到低于0.41 kU/L 的免疫球蛋白，在這一方面ISAC 的敏感度較ImmunoCAP 低，但總體而言芯片在檢測塵螨過敏原特異性IgE 方面可以替代ImmunoCAP［28］。

2.2 食物過敏原檢測 ImmunoCAP ISAC 112 芯片對韓國41例有核桃過敏病史的兒童進(jìn)行檢測，其中32 例兒童臨床診斷為核桃過敏，31 例患者血清有Jug r 1特異性IgE，揭示了核桃過敏原中的主要過敏原為Jug r 1，文章繪制了Jug r 1 特異性IgE、核桃特異性IgE和核桃粗提物特異性IgE間的ROC，并計(jì)算曲線下面積（AUC）。診斷幼兒核桃過敏和幼兒是否對核桃耐受，檢測Jug r 1-sIgE（AUC=0.788）優(yōu)于檢測WN-sIgE（AUC=0.563）［29］。開發(fā)和設(shè)計(jì)一款時(shí)間分辨熒光（time-resolved fluorometric，TRF）芯片，上面包含牛奶、蛋清、大米、大豆、花生和小麥6種過敏原提取物，該芯片檢測人血中IgE用量極少，是CAP/RAST FEIA 方法的1/15，但檢測結(jié)果相關(guān)性較高［30］。同樣可以制作過敏原多肽芯片，將牛奶中的酪蛋白αs1、酪蛋白s2、酪蛋白b、酪蛋白κ 和乳球蛋白b 的一級序列在芯片上分成多個(gè)多肽點(diǎn)，檢測人血清中的特異性IgE 來判斷抗原表位所在位置［31］?；ㄉ^敏原的抗原表位可采用相同方法檢測［32］。

總之，過敏原芯片在疾病診斷方面具有明顯優(yōu)勢，相對于傳統(tǒng)過敏性疾病診斷方法，過敏原芯片基于組分分辨診斷概念，使用少量血清檢測同一患者對多種過敏原單組分的IgE 結(jié)合率，可明確多種過敏原間的交叉反應(yīng)和共致敏情況，判斷出某種過敏原是否為主要過敏原，檢測結(jié)果同ImmunoCAP 金標(biāo)準(zhǔn)具有很好的相關(guān)性，直觀地了解每位患者的IgE 反應(yīng)譜，為過敏性疾病診斷和后續(xù)特異性免疫治療方案制定提供了有力證據(jù)。

3 過敏原芯片對特異性免疫治療效果的 評估作用

3.1 過敏原芯片評估特異性免疫治療效果原理 特異性免疫性治療是唯一一種可以根除過敏性疾病的方法，通過注射或舌下含服等方式不停地給機(jī)體注入過敏原或過敏原修飾物，改變過敏反應(yīng)進(jìn)程、誘導(dǎo)過敏原保護(hù)性抗體，使機(jī)體逐漸適應(yīng)過敏原而減少過敏時(shí)的反應(yīng)［33-34］。特異性免疫治療可治療過敏性疾病的重要原因是誘導(dǎo)保護(hù)性抗體IgG 產(chǎn)生［35-37］。過敏原特異性IgG 可競爭性阻斷過敏原與IgE 結(jié)合，使機(jī)體免疫機(jī)制發(fā)生改變，過敏反應(yīng)減輕［38-40］。有研究表明母親體內(nèi)高濃度的IgG 可保護(hù)嬰兒在出生后的4～5 年不對過敏原產(chǎn)生特異性IgE抗體［41-42］?；颊哐逯械奶禺愋訧gG 變化可評估特異性免疫治療的效果［43］。

特異性免疫治療的關(guān)鍵是確定真正過敏原和監(jiān)測治療效果以便隨時(shí)調(diào)整治療方案，前文已經(jīng)介紹了芯片確定過敏原的優(yōu)勢，過敏原芯片同樣可監(jiān)測免疫治療效果，能夠檢測特異性IgG。如何在實(shí)際臨床中監(jiān)測這種現(xiàn)象？選擇含有大量過敏原的ImmunoCAP 一類的檢測技術(shù)并不能模擬體內(nèi)特異性IgG 阻止IgE 結(jié)合過敏原，只有在ImmunoCAP ISAC和MeDALL chip這類芯片上才能實(shí)現(xiàn)［44-46］。

3.2 過敏原芯片評估特異性免疫治療效果的應(yīng)用 使用含有178 種過敏原的MeDALL chip，對其中15種塵螨過敏原（Der p 1、Der f 1、Der p 2、Der f 2、Der p 4、Der p 5、Der p 7、Der p 10、Der p 11、Der p 14、Der p 15、Der p 18、Der p 21、Der p 23、Der p 37）進(jìn)行研究，結(jié)果顯示免疫治療劑Alutard SQ 510可使機(jī)體產(chǎn)生針對Der p 1、Der p 2 的保護(hù)性免疫球蛋白，對Der p 1、Der p 2 患者的療效較好［47］。使用BM32 草花粉過敏疫苗治療2 年后，患者血清中IgG4反應(yīng)增加，第2 年比第1 年的反應(yīng)強(qiáng)烈，而第2 年的臨床療效高于第1年。以上研究表明過敏原芯片檢測不僅可以幫助查找過敏原，還可用于治療過程中監(jiān)測血清IgG判斷治療效果［48］。增加24例草花粉過敏的過敏性鼻結(jié)膜炎患者的皮下免疫治療藥物，并檢測加藥前后的草花粉過敏原特異性IgE和IgG，ISAC檢測免疫治療加藥后特異性IgE 明顯下降，而IgG4在治療12 周后從0 ISU 增加至0.83 ISU，在ImmunoCAP 測量的加藥階段，針對主要過敏原Phl p 1 和Phl p 5的特異性IgE水平從平均23.0 kU/L增至48.8 kU/L，ISAC 可用于監(jiān)測過敏原特異性免疫療法誘導(dǎo)的非IgE抗體的阻斷效果［49］。

4 過敏原芯片的展望

過敏原芯片已被證實(shí)是過敏性疾病診斷的輔助工具，但因其昂貴的價(jià)格，未被廣泛應(yīng)用于臨床，可以采取手段降低檢測成本。過敏原芯片的材料主要有兩種：玻璃和硝酸纖維素膜。ImmunoCAP ISAC 芯片使用玻璃材料，MADx Allergen Explorer ALEX芯片使用硝酸纖維素膜［20，50］。有研究表明，使用硅及表面材質(zhì)可以替代玻璃，且優(yōu)化過的硅基材料會(huì)產(chǎn)生更強(qiáng)的熒光，使過敏原芯片敏感性更高［51-52］。在硅芯片上檢測牛奶和雞蛋的過敏原蛋白特異性IgE 和IgG4，硅芯片上的熒光強(qiáng)度與ISAC 的半定量結(jié)果相比，大多數(shù)相關(guān)系數(shù)＞0.7，硅芯片測得雞蛋特異性IgE 的與ImmunoCAP 結(jié)果相關(guān)性好，靈敏度低至0.35 kUA/L。對血清中特異性IgG4抗體的檢測只能在低濃度下進(jìn)行，但與ImmunoCAP 結(jié)果呈正相關(guān)［53］。以Bet v 1過敏原為例，將人單克隆嵌合IgE 抗體從208 ISU/ml 按倍比稀釋到0.025 ISU/ml，檢測玻璃材質(zhì)和硅材質(zhì)芯片上的IgE 反應(yīng)率，結(jié)果顯示在52～0.025 ISU/ml 范圍內(nèi)，硅芯片上的IgE 反應(yīng)熒光強(qiáng)度比ISAC 高5 倍，硅芯片甚至允許測量濃度為0.025 ISU/ml的特異性IgE，而在國際上芯片的檢測cut-off 值為0.3 ISU/ml，某些研究檢測下限值是0.1 ISU/ml，硅材質(zhì)芯片明顯在靈敏度方面勝出?；蛘呤褂媒M合芯片進(jìn)行過敏原診斷，根據(jù)臨床情況選擇單個(gè)的硅芯片組合出不同的過敏原芯片，這種設(shè)計(jì)可大大減少成本［54］。

5 結(jié)論

組分分辨診斷在過敏性疾病診斷中發(fā)揮重要作用，明確過敏原單組分可對過敏性疾病的診斷和療效評估提供有力證據(jù)。過敏原芯片技術(shù)在20 年內(nèi)快速發(fā)展，許多研究者對芯片進(jìn)行了大量研究，研究表現(xiàn)了過敏原芯片高通量、方便、快捷、樣本量小的優(yōu)勢，非常適用于兒科過敏患者，對于過敏性疾病的診斷和療效評估方面表現(xiàn)出來極大優(yōu)勢，成為體外檢測特異性IgE 抗體的重要工具?，F(xiàn)有市售芯片均為國外產(chǎn)品，國內(nèi)體外診斷行業(yè)迫切需要開發(fā)國產(chǎn)化過敏原芯片。