兩種新型冠狀病毒免疫學(xué)檢測方法的應(yīng)用評價①

鄭仲華 黃鑫鑫 張 歡 鄒麗容 胡 瑤 李振翠 郭前方 劉美真 梁麗君 李柏生

（廣東省疾病預(yù)防控制中心，廣東新發(fā)突發(fā)傳染病防治工作站，廣州 511430）

2019年12月以來，湖北省武漢市部分醫(yī)院陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了多例不明原因的肺炎病例，并在隨后的1 個多月內(nèi)蔓延至全國［1］。引起此次疫情的病原體隨后被命名為新型冠狀病毒，屬于套式病毒目冠狀病毒科冠狀病毒屬，是一種具有不規(guī)則形狀的線性單股正鏈RNA病毒，直徑60～220 nm。根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育樹，冠狀病毒可分為α、β、γ 和δ 4 種，SARS-CoV-2 是可分為A、B、C和D等4種亞群的β屬冠狀病毒［2］。

目前應(yīng)對新型冠狀病毒疫情的最有效方法是“早發(fā)現(xiàn)、早隔離、早診斷、早治療”［3］。2020 年3 月 3 日，國家衛(wèi)生健康委發(fā)布了《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第七版）》，第一次將新冠抗體檢測納入臨床輔助診斷標(biāo)準(zhǔn)，同時國家藥監(jiān)局也應(yīng)急審批了廣州萬孚（膠體金試紙條）、英諾特（唐山）、博奧塞斯（重慶）和廈門萬泰（化學(xué)發(fā)光法）等多家企業(yè)的新冠抗體檢測試劑盒注冊申請［4］。本研究選取膠體金法和化學(xué)發(fā)光法分別檢測新冠抗體，通過與病毒中和試驗(yàn)檢測中和抗體滴度進(jìn)行比較，從靈敏度、特異度和Kappa值等方面進(jìn)行評價，并比較新冠抗體檢測方法的優(yōu)缺點(diǎn)，為國內(nèi)新冠肺炎疫情常態(tài)化防控（尤其是大規(guī)模人群免疫后血清抗體監(jiān)測），選取合適的抗體檢測方法提供參考。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 一般資料 根據(jù)《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第八版）》標(biāo)準(zhǔn)將2021年2月7日至2021年2月25日由廣東省內(nèi)各地市上送至廣東省疾病預(yù)防控制中心的92 例樣本分為確診病例組（67 例）和健康對照組（25例）。

1.1.2 SARS-CoV-2 病毒株 來源于2020 年1 月 1 例有武漢旅行史的疑似新型冠狀病毒肺炎患者由廣東省疾病預(yù)防控制中心病原微生物檢驗(yàn)所分的離肺泡灌洗液，實(shí)驗(yàn)室編號為20SF014［5］。

1.1.3 試劑和儀器 新型冠狀病毒IgM/IgG 抗體檢測試劑盒（膠體金法，醫(yī)療器械注冊證編號/產(chǎn)品技術(shù)要求編號：國械注準(zhǔn)20203400177，生產(chǎn)許可證號：冀食藥監(jiān)械生產(chǎn)許20150033號）購自英諾特（唐山）生物技術(shù)有限公司；化學(xué)發(fā)光免疫分析儀 Axceed 260 購自博奧賽斯（天津）生物科技有限公司；胎牛血清和MEM 培養(yǎng)基購自美國Gibco 公司；倒置顯微鏡購自日本Nikon 株式會社；二級生物安全柜購自美國賽默飛世爾科技公司；Moxi Z 便攜式自動細(xì)胞計(jì)數(shù)儀購自美國Orflo 公司；含5%CO2的37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱購自德國BINDER 公司；Eppendorf 5804R高速冷凍離心機(jī)購自德國Eppendorf公司。

1.2 方法

1.2.1 樣本收集與處理 采集所有研究對象靜脈血5 ml，置于含分離膠的黃頭真空采血管內(nèi)，室溫下靜置20 min，3 000 r/min、4 ℃離心10 min 后，將血清分裝至3 個EP 管，200 μl/管，56 ℃金屬浴30 min 滅活，分別利用化學(xué)發(fā)光免疫分析儀、SARS-CoV-2 IgG/IgM 抗體檢測試劑盒（膠體金法）和微量病毒中和抗體試驗(yàn)檢測SARS-CoV-2 臨床確診患者血清中的抗體水平。

1.2.2 膠體金法測定 按照新型冠狀病毒IgM/IgG抗體檢測試劑盒說明書，采用免疫捕獲法原理檢測新型冠狀病毒IgM 抗體和IgG 抗體。打開檢測卡的鋁箔袋包裝，取出檢測卡平鋪，然后分別取10 μl 待測血清（或血漿）加至IgM 抗體和IgG 抗體檢測試劑的圓形樣本孔，再分別加80 μl（或兩滴）樣本稀釋液，室溫放置15 min觀察結(jié)果。IgM抗體和IgG抗體檢測試劑判讀窗口T 線和C 線位置出現(xiàn)清晰的紫紅色條帶，判讀為新型冠狀病毒IgM 抗體和IgG 抗體陽性；若僅在C線位置出現(xiàn)清晰的紫紅色條帶，判讀為新型冠狀病毒抗體陰性；若判讀窗口C 線無紫紅條帶為試驗(yàn)無效，需重新檢測。

1.2.3 化學(xué)發(fā)光法測定 按照化學(xué)發(fā)光免疫分析儀 Axceed 260 說明書，先稀釋樣本，取15 μl 樣本血清和735 μl樣本稀釋液，使用旋渦混勻器混勻5 s后備用，IgM和IgG項(xiàng)目共用稀釋后的樣品。稀釋后的樣本上機(jī)檢測，首次出結(jié)果時間為47 min。結(jié)果解讀：S/CO=樣本發(fā)光值/cut-off 值（S 代表標(biāo)本的OD值，CO即臨界值，是判斷檢測結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)）。S/CO＜1為陰性；S/CO≥1為陽性。建議盡快調(diào)查該患者的接觸史、發(fā)熱史、治療史，3～5 d 后再抽血復(fù)測IgM 和IgG抗體；S/CO介于0.7～1.0為灰區(qū)結(jié)果，建議3～5 d后再抽血復(fù)測。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS24.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。通過靈敏度、特異度、陰陽預(yù)測值、Kappa 值等篩檢評價指標(biāo)對膠體金法和化學(xué)發(fā)光法兩種抗體檢測方法進(jìn)行評價。

2 結(jié)果

2.1 病毒中和試驗(yàn)結(jié)果 92 份樣本的微量病毒中和試驗(yàn)∶新冠抗體滴度≥1∶4 者占比為72.83%（67/92），其中抗體最高滴度為1∶1 024，占比為3.26%（3/92），見表1。

表1 膠體金法和化學(xué)發(fā)光法檢測血清的結(jié)果（構(gòu)成比）分布［例（%）］Tab.1 Distribution of results （constituent ratio） of serum detected by colloidal gold method and chemiluminescence method ［n（%）］

2.2 膠體金法檢測結(jié)果 92 份樣本中，新冠抗體陽性結(jié)果占比為52.17%（50/92），其中弱陽性結(jié)果占比為12.50%（6/48），見表2。

表2 膠體金法結(jié)果Tab.2 Results of colloidal gold method

2.3 化學(xué)發(fā)光法檢測結(jié)果 92 份樣本中，新冠抗體陽性結(jié)果占比為82.61%（76/92），其中IgM 陽性者占總陽性結(jié)果的44.74%（34/76），IgG 陽性者占總陽性結(jié)果的92.11%（70/76）；陰性占17.39%（16/92），見表3。

表3 化學(xué)發(fā)光法結(jié)果Tab.3 Results of chemiluminescence method

2.4 膠體金和化學(xué)發(fā)光法檢測結(jié)果比較 當(dāng)以微量病毒中和抗體試驗(yàn)的結(jié)果作為本研究的實(shí)驗(yàn)室診斷金標(biāo)準(zhǔn)，膠體金法靈敏度小于化學(xué)發(fā)光法，但特異度大于化學(xué)發(fā)光法；兩種檢測方法的Kappa 值分別為0.525和0.721；膠體金法檢測新冠抗體的陰性預(yù)測值不如化學(xué)發(fā)光法，但陽性預(yù)測值較高，見表4。

表4 膠體金和化學(xué)發(fā)光法的檢測結(jié)果比較Tab.4 Comparison of detection results between colloidal gold kit and automatic chemiluminescence analyzer

3 討論

SARS-CoV-2 引起的新型冠狀病毒肺炎疫情已經(jīng)在世界范圍內(nèi)流行。截至2021年4月13日24時，國內(nèi)累計(jì)治愈出院病例85 513 例，累計(jì)死亡病例 4 636 例，累計(jì)報(bào)告確診病例90 447 例［6］。同時，世界衛(wèi)生組織（WHO）統(tǒng)計(jì)，全球范圍累計(jì)確診病例136 996 364例，累計(jì)死亡病例2 951 832例［7］。

目前SARS-CoV-2 病原學(xué)檢測方法主要包括病毒核酸檢測和血清抗體檢測，核酸檢測作為新冠病毒確診的金標(biāo)準(zhǔn)，主要采用RT-PCR 方法檢測鼻咽拭子、痰液等呼吸道樣本中的病毒RNA，但此方法的檢測結(jié)果易受病程、標(biāo)本采集和存儲、檢測過程等因素影響，且對實(shí)驗(yàn)室條件也有較高要求，應(yīng)當(dāng)至少按照二級生物安全、三級防護(hù)條件從事相關(guān)核酸檢測工作［8-10］。因此，新冠抗體檢測手段可以很好地作為輔助性診斷方法，且能夠同時檢測特異性IgM 和IgG 抗體：檢測IgM 抗體有助于早期診斷新型冠狀病毒感染；檢測IgG 抗體有助于檢測出是否是既往感染或免疫后產(chǎn)生的抗體。疫苗是人類抵抗傳染病最為有效的手段，截至2020年11月12日，有164 種新冠疫苗正在開發(fā)，國內(nèi)已有多款新冠疫苗被批準(zhǔn)用于緊急使用，隨著疫苗大規(guī)模在人群中接種，導(dǎo)致抗體檢測方法均無法有效區(qū)分是既往感染還是免疫產(chǎn)生的抗體［8］。因此，國家新冠肺炎疫情防控方案規(guī)定抗體檢測需結(jié)合流行病學(xué)史、臨床表現(xiàn)和基礎(chǔ)疾病等情況進(jìn)行綜合判斷［9］。

本研究表明，若以微量病毒中和抗體試驗(yàn)結(jié)果為抗體檢測金標(biāo)準(zhǔn)時，化學(xué)發(fā)光法的靈敏度、Kappa值均高于膠體金法，提示化學(xué)發(fā)光法在檢測同一組樣本時較膠體金法更好［11］。與童偉等［4］對兩種免疫學(xué)檢測方法的應(yīng)用評價結(jié)果不同。初步懷疑是因?yàn)槟z體金法檢測對弱陽性結(jié)果靠肉眼判斷結(jié)果不穩(wěn)定，易受實(shí)驗(yàn)者個人因素影響，導(dǎo)致靈敏度波動；由于新型冠狀病毒導(dǎo)致的疫情較為嚴(yán)重，根據(jù)試劑盒說明書，在試劑盒開發(fā)時更大程度地提高診斷靈敏度，避免因漏檢造成嚴(yán)重后果。通過試劑盒截?cái)嘀担磁R界值，是判斷檢測結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)）的設(shè)定提高靈敏度，不同區(qū)域的截?cái)嘀涤幸欢ǔ潭炔町悾赡軙霈F(xiàn)因截?cái)嘀挡町悓?dǎo)致的假陽性；同時患者血清樣本中可能存在內(nèi)源性干擾物質(zhì)導(dǎo)致假陽性。

微量病毒中和抗體試驗(yàn)應(yīng)在三級生物安全條件下進(jìn)行，雖然結(jié)果準(zhǔn)確可信，但也存在試驗(yàn)過程人為判斷細(xì)胞病變以及耗時耗力的缺點(diǎn)［10］。本研究結(jié)果表明，相較于中和試驗(yàn)，膠體金法與化學(xué)發(fā)光法在抗體檢測方面各有其優(yōu)缺點(diǎn)。膠體金法的靈敏度和Kappa值一般，但其檢測過程方便快捷，尤其是對實(shí)驗(yàn)室條件無嚴(yán)格要求，且用時較短，非常適合于基層相關(guān)檢測部門進(jìn)行快速的大規(guī)模人群檢測?；瘜W(xué)發(fā)光法的靈敏度和Kappa 值較高，結(jié)果相對穩(wěn)定可靠且用時較短；但自動化設(shè)備價格較昂貴，操作也相對復(fù)雜，因此，在新冠抗體復(fù)檢或少量監(jiān)測樣本時，具有較高使用價值。

因本研究收集到的樣本數(shù)量有限，對SARSCoV-2 兩種免疫學(xué)檢測方法的應(yīng)用評價還不夠全面，需要進(jìn)一步收集更多樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行研究以完善相關(guān)評價機(jī)制。參考試劑盒說明書，膠體金法和化學(xué)發(fā)光法均只能定性檢測，無法檢測保護(hù)性抗體含量。鑒于我國正在進(jìn)行大規(guī)模人群注射新冠疫苗，如若無法找到可替代的定量抗體檢測方法，將無法有效判定抗體的保護(hù)效果，因此，中和抗體試驗(yàn)仍將被長期用于保護(hù)性抗體監(jiān)測。部分疫苗（如羊布魯氏菌病疫苗）免疫一段時間后，利用試管凝集試驗(yàn)（SAT）和虎紅平板凝集試驗(yàn)（RBT）基本無法檢測到凝集抗體，但ELISA法的抗體陽性率依然可觀［11］。因此，本研究為新冠疫苗免疫后抗體水平的監(jiān)測提供了一種新的思考方向，是否可于免疫后利用多種監(jiān)測手段對新冠抗體水平進(jìn)行監(jiān)測，尤其是利用高靈敏度的檢測方法，而后再利用中和試驗(yàn)進(jìn)行保護(hù)性抗體監(jiān)測。當(dāng)然，本課題組希望利用大數(shù)據(jù)樣本抗體監(jiān)測找到更好、更快、更方便的抗體檢測方法，用于替代復(fù)雜的病毒中和抗體試驗(yàn)。