NRP1調(diào)控M2型巨噬細(xì)胞極化介導(dǎo)電離輻射肺纖維化的作用研究①

佘 煒 魏 江 董丹丹 趙 原 顧 露⑤

（四川醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心，成都 610072）

電離輻射肺纖維化（radiation-induced pulmonary fibrosis，RIPF）是臨床放射介入醫(yī)學(xué)最常見的并發(fā)癥［1］；例如胸部腫瘤放療后往往伴隨肺纖維化發(fā)生，造成患者預(yù)后較差，甚至是導(dǎo)致患者非原發(fā)性疾病死亡的原因［2］。肺纖維化作為一種進(jìn)行性免疫相關(guān)疾病，其在早期可以逆轉(zhuǎn)，中后期則難以逆轉(zhuǎn)，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，尚不完全明確。有研究表明巨噬細(xì)胞極化在肺纖維化發(fā)生過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用，特別是M2 型巨噬細(xì)胞極化。研究指出輻射導(dǎo)致肺組織大量表達(dá)過氧化物（ROS），輻射中后期ROS 減少激活M2 型巨噬細(xì)胞，M2 型巨噬細(xì)胞通過分泌各種細(xì)胞因子激活肌成纖維細(xì)胞、促進(jìn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial mesenchymal transition，EMT）等，導(dǎo)致過多細(xì)胞外基質(zhì)和膠原蛋白沉積，造成損傷部位過度修復(fù)，形成放射性肺纖維化［3-4］。

神經(jīng)菌毛蛋白1（neurofibrin 1，NRP1）是最初在神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)被發(fā)現(xiàn)的一種多功能跨膜糖蛋白，已被證明在增強(qiáng)TGF-β1 信號傳導(dǎo)和促進(jìn)成纖維細(xì)胞發(fā)生EMT的過程中發(fā)揮重要作用［5-6］。但其與M2型巨噬細(xì)胞在RIPF中的作用如何尚未見報(bào)道，因此本研究擬通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)探討NRP1 與M2 型巨噬細(xì)胞在RIPF中作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 15 只10 周齡C57 雌性小鼠購自成都碩達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。該品系的雌性小鼠已被證實(shí)對射線敏感程度高，8～10 周齡該品系雌性小鼠常用于經(jīng)典放射性肺纖維化動(dòng)物模型建立。飼養(yǎng)于四川省人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，所有小 鼠均按照要求規(guī)范飼養(yǎng)和操作。小鼠隨機(jī)分為對照組、RIPF組和EG00229組，每組5只。

1.1.2 主要試劑與儀器 3%戊巴比妥（30 mg/kg，上海新亞藥業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字H31020240）；蘇木素（貨 號：H9627）、0.7% 鹽酸乙醇（貨號：361526）、PBS（貨號：11666789001）、伊紅（貨號：230251）、天青石藍(lán)液（貨號：1.09211）、天狼星紅飽和苦味酸（貨號：365548）購自Sigma；氨水（貨號：3245324）、乙醇（貨號：1244355）、二甲苯（貨號：4533243）、中性甲醛液（貨號：8765324）、甲醇（貨號：129824）、丙酮（貨號：2145676）、多聚甲醛（貨號：5435676）購自四川協(xié)力化學(xué)試劑公司；Weigert染液（批號：ab245882）、馬松液（批號：ab150669）、TNF-α 抗體（批號：ab181421）、IL-4 抗體（批號：ab178012）、TGF-β1抗體（批號：ab214031）購自Abcam；數(shù)字化醫(yī)用X 射線攝影系統(tǒng)（AXIOM ARISTOS VX PLUS，西門子）；qRT-PCR 儀（型號：Veriti，Thermo Fisher）。

1.2 方法

1.2.1 RIPF造模 3%戊巴比妥麻醉小鼠，RIPF組和EG00229 組小鼠放射科輻照總劑量6 Gy（該劑量可成功誘導(dǎo)小鼠肺纖維化且不會(huì)致死，本實(shí)驗(yàn)室研究過程均使用6 Gy 總劑量，模型具有穩(wěn)定性和連續(xù)性），放射劑量2 Gy/min，EG00229 組放射前7 d 每天給藥處理，濃度20 mg/kg［7］。輻射結(jié)束15 d 后處死小鼠，取肺組織，處死過程嚴(yán)格遵守小鼠無痛準(zhǔn)則。

1.2.2 HE 染色 肺組織石蠟包埋，切片脫蠟，蘇木素染色10 min，0.7%鹽酸乙醇分化5 s；PBS 洗片后氨水處理再水洗，伊紅染色5 min，水洗后乙醇、二甲苯處理，樹脂封片。

1.2.3 馬松染色 肺組織石蠟包埋脫蠟；Weigert染液染色5 min，酸性乙醇分化液分化15 s；洗片后用馬松液染色5 min；最后經(jīng)洗片、乙醇脫水后，二甲苯透明，樹脂封片。

1.2.4 天狼星紅染色 中性甲醛液固定組織，石蠟切片，常規(guī)脫蠟至水。加入天青石藍(lán)液染10 min。蒸餾水洗3 次。天狼星紅飽和苦味酸染30 min。無水乙醇分化和脫水。二甲苯透明，中性樹膠封固。染色結(jié)果膠原呈紅色，胞核呈綠色，其他呈黃色。

1.2.5 免疫熒光染色 將肺組織用預(yù)冷的甲醇和丙酮混合液（1∶1）固定，于1%TritonX-100/PBS 中透化。洗片擦干后于4 ℃冰箱中與精氨酸酶1（arginase 1，Arg1）、抵抗素樣分子α（resistin-like molecule alpha，F(xiàn)IZZ1）、幾丁質(zhì)酶3 樣蛋白1（chitinase-3-like protein 1，Ym1）、CD14（1∶1 000）抗體孵育過夜。次日以4%多聚甲醛固定4 h，與含15%蔗糖的PBS 共孵育4 h，去離子水清洗玻片，使用激光共聚焦掃描分析切片。

1.2.6 免疫組化 肺組織依次進(jìn)行石蠟切片脫蠟至水，抗原修復(fù)，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，血清封閉，加入NRP1，Ⅰ型膠原（Collagen-Ⅰ，Col-Ⅰ）和α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（alpha smooth muscle actin，α-SMA） 一抗，加入二抗，DAB 顯色，復(fù)染細(xì)胞核，脫水封片及切片掃描儀掃描分析。

1.2.7 qRT-PCR TRIzol 和氯仿用于提取RNA，使用RNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為性質(zhì)穩(wěn)定的cDNA。隨后qRT-PCR 檢測目的基因相對GAPDH的表達(dá)水平。反應(yīng)條件設(shè)定如下：95 ℃預(yù)變性 10 min；95 ℃變性10 s；60 ℃退火20 s，72 ℃延伸35 s。2-ΔΔCt法用于計(jì)算目的基因相對mRNA表達(dá)。引物序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.2.8 ELISA 各組小鼠血清離心取上清和細(xì)胞上清液，根據(jù)ELISA 試劑盒操作步驟加入TNF-α、IL-4、TGF-β1 抗體，反應(yīng)后洗板，加入酶標(biāo)二抗，反應(yīng)后再洗板，加入底物顯色。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS18.0 進(jìn)行分析，計(jì)量資料均以±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用F檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RIPF 小鼠肺組織中NRP1 表達(dá)升高促進(jìn)電離輻射肺損傷 與對照組相比，RIPF 組小鼠肺組織中NRP1 表達(dá)顯著升高，而EG00229 有效抑制NRP1 在肺組織中的表達(dá)（圖1A、1B）。與對照組相比，RIPF組小鼠經(jīng)X 射線輻射后肺組織損傷明顯，小支氣管黏膜部分損傷，伴有少量出血、滲出現(xiàn)象；肺泡間隔增寬，肺泡腔增大，部分肺泡斷裂、融合，腔內(nèi)有分泌物；EG00229顯著改善X射線導(dǎo)致的肺組織損傷，EG00229給藥組小鼠肺組織肺實(shí)質(zhì)及間質(zhì)有少量炎癥細(xì)胞浸潤，肺泡結(jié)構(gòu)較完整，腔內(nèi)分泌物減少，出血現(xiàn)象改善，炎癥細(xì)胞浸潤明顯減輕，氣管黏膜結(jié)構(gòu)完整（圖1C）。提示NRP1與電離輻射導(dǎo)致的肺組織損傷密切相關(guān)，且可能促進(jìn)組織損傷。

圖1 RIPF 小鼠肺組織中NRP1 表達(dá)增高促進(jìn)電離輻射 肺損傷Fig.1 Increased expression of NRP1 in lung tissue of RIPF mice promotes ionization radiation lung injury

2.2 NRP1 促進(jìn)RIPF 小鼠肺組織炎癥因子表達(dá) ELISA 檢測三組小鼠肺泡灌洗液中TNF-α、IL-4、TGF-β1 表達(dá)，結(jié)果表明：與對照組相比，RIPF 組小鼠肺泡灌洗液中TNF-α、IL-4、TGF-β1 表達(dá)顯著提高，而EG00229給藥處理后可有效抑制RIPF小鼠肺泡灌洗液中TNF-α、IL-4、TGF-β1的表達(dá)。（圖2）。

圖2 三組小鼠肺泡灌洗液中TNF-α、IL-4、TGF-β1表達(dá)Fig.2 Expressions of TNF-α， IL-4 and TGF-β1 in alveolar lavage fluid of mice in three groups

2.3 NRP1 促進(jìn)RIPF 小鼠肺組織ECM 沉積 天狼星紅和馬松染色檢測三組小鼠ECM 表達(dá)，結(jié)果表明：與對照組相比，RIPF 組小鼠肺組織中ECM 表達(dá)顯著增多，而EG00229可有效抑制ECM 在肺組織中的表達(dá)（圖3）。

圖3 馬松和天狼星紅染色觀察三組小鼠肺組織中ECM 沉積情況Fig.3 Masson and Sirius red staining to observe deposition of ECM in lung tissues of mice in three groups

免疫組化檢測Col-Ⅰ和α-SMA表達(dá)，結(jié)果表明：與對照組相比，RIPF組小鼠肺組織中Col-Ⅰ和α-SMA表達(dá)顯著增多，而EG00229 可有效抑制Col-Ⅰ和 α-SMA在肺組織中的表達(dá)（圖4）。

圖4 免疫組化觀察三組小鼠肺組織中Col-Ⅰ和α-SMA表達(dá)Fig.4 IHC observation of expressions of Col-Ⅰ and α-SMA in lung tissues of mice in three groups

2.4 NRP1促進(jìn)RIPF小鼠肺組織CD14表達(dá) 免疫熒光檢測三組小鼠CD14 表達(dá)，結(jié)果表明：與對照組相比，RIPF 組小鼠肺組織中CD14 陽性細(xì)胞率顯著提高，而EG00229 可有效抑制肺組織中細(xì)胞CD14陽性率（圖5）。

圖5 三組小鼠肺組織中CD14表達(dá)Fig.5 Expression of CD14 in lung tissues of mice in three groups

2.5 NRP1促進(jìn)RIPF小鼠肺組織M2型巨噬細(xì)胞極化 免疫熒光檢測三組小鼠M2 型巨噬細(xì)胞極化標(biāo)志物Arg1、FIZZ1、Ym1 蛋白表達(dá)水平，結(jié)果表明：與對照組相比，RIPF 組小鼠肺組織中細(xì)胞Arg1、FIZZ1、Ym1 陽性率顯著提高，而EG00229 可有效抑制肺組織中細(xì)胞Arg1、FIZZ1、Ym1陽性率（圖6）。

圖6 三組小鼠肺組織中Arg1、FIZZ1、Ym1表達(dá)Fig.6 Expressions of Arg1， FIZZ1 and Ym1 in lung tissues of mice in three groups

3 討論

電離輻射是臨床醫(yī)學(xué)介入和放射科對胸部腫瘤患者進(jìn)行的常規(guī)治療方法，但其面臨著胸部輻射導(dǎo)致的肺組織損傷纖維化并發(fā)癥［8］。有研究證實(shí)，RIPF 是導(dǎo)致腫瘤患者預(yù)后不良的重要因素［9］，目前RIPF 的發(fā)生機(jī)制不完全明確，且尚無特異有效的治療藥物，因此RIPF 的發(fā)生機(jī)制、關(guān)鍵靶點(diǎn)和藥物研發(fā)是放射醫(yī)學(xué)的研究熱點(diǎn)。

RIPF 作為一種免疫相關(guān)疾病，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前尚不完全清楚［10］。有研究表明，免疫因素在RIPF發(fā)生過程中發(fā)揮十分重要的作用，如炎癥因子TNF-α、IL-4、TGF-β1的釋放持續(xù)性刺激肺受損部位，會(huì)導(dǎo)致受損部分炎癥微環(huán)境形成，激活肺成纖維母細(xì)胞并大量分泌ECM［11］；巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的異常激活，尤其是M2 型巨噬細(xì)胞激活，研究證明輻射中后期可激活M2 型巨噬細(xì)胞，M2 型巨噬細(xì)胞通過分泌各種細(xì)胞因子激活肌成纖維細(xì)胞，促進(jìn)EMT 等，導(dǎo)致過多細(xì)胞外基質(zhì)和膠原蛋白沉積，造成損傷部位過度修復(fù)，形成RIPF［12-14］。

NRP1 是最初在神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)發(fā)現(xiàn)的一種多功能的跨膜糖蛋白，已被證明與TGF-β1 信號傳導(dǎo)通路和EMT 的激活密切相關(guān)，而TGF-β1 和EMT 是導(dǎo)致RIPF 的重要原因［6，15-17］，但有關(guān)NRP1 與M2 型巨噬細(xì)胞在RIPF中的作用關(guān)系研究尚未見報(bào)道，因此本研究通過RIPF 動(dòng)物模型初步探討NRP1 與M2 型巨噬細(xì)胞在RIPF中的作用。

本研究發(fā)現(xiàn)NRP1 在RIPF 小鼠肺組織中顯著高表達(dá)，隨后通過NRP1 特異性抑制劑EG00229 預(yù)先給藥處理小鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著NRP1 表達(dá)被抑制，RIPF 小鼠肺組織損傷明顯緩解，提示NRP1 與RIPF的發(fā)生密切相關(guān)。觀察抑制NRP1 表達(dá)對RIPF 發(fā)生過程中炎癥因子TNF-α、IL-4、TGF-β1 表達(dá)的影響，結(jié)果表明抑制NRP1表達(dá)后，TNF-α、IL-4、TGF-β1表達(dá)顯著降低，提示NRP1 可影響TNF-α、IL-4、 TGF-β1等炎癥因子表達(dá)，對緩解肺組織損傷至關(guān)重要。Col-Ⅰ和α-SMA 是組織纖維化標(biāo)志蛋白，是ECM 的重要組織成分，也是造成組織纖維化的關(guān)鍵蛋白［18-19］。本研究發(fā)現(xiàn)抑制NRP1 表達(dá)后Col-Ⅰ和 α-SMA 的表達(dá)被明顯抑制，對緩解肺組織纖維化具有重要影響。

炎癥因子的釋放和ECM 的沉積往往提示巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的激活［20］。CD14 是巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞激活的標(biāo)志。巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞在電離輻射中被顯著激活是電離輻射造成肺組織損傷纖維化的重要因素。因此本研究進(jìn)一步檢測了兩種細(xì)胞CD14 陽性率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)電離輻射導(dǎo)致細(xì)胞CD14 陽性率明顯升高，而抑制NRP1 表達(dá)后細(xì)胞CD14 陽性率隨之降低，提示NRP1 能夠調(diào)控巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的激活。研究已經(jīng)證實(shí)M2 型巨噬細(xì)胞激活發(fā)揮促纖維化作用，本研究為檢測NRP1 與M2 型巨噬細(xì)胞關(guān)系如何，抑制NRP1 后，檢測了M2 型巨噬細(xì)胞激活標(biāo)志蛋白Arg1、FIZZ1、Ym1 的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Arg1、FIZZ1、Ym1 表達(dá)隨NRP1的抑制顯著降低。說明NRP1對M2型巨噬細(xì)胞在RIPF中的激活具有正向調(diào)控作用，但其具體機(jī)制尚不明確，將是下一步研究的重點(diǎn)。

綜上所述，本研究明確了NRP1 在RIPF 體內(nèi)模型中表達(dá)顯著上調(diào)，抑制其表達(dá)后RIPF免疫相關(guān)炎癥因子、巨噬細(xì)胞和ECM 的激活被抑制，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)NRP1 可能通過抑制免疫相關(guān)細(xì)胞M2 型巨噬細(xì)胞發(fā)揮促纖維化作用。以上結(jié)果初步表明了NRP1在RIPF的發(fā)生中發(fā)揮的作用，為下一步的研究奠定基礎(chǔ)。