黑脛病對不同品種煙草根際土壤細(xì)菌群落的影響

方 宇，蔡永占，韓小女，白 濤，劉冬梅，劉 舜，王瑞寶，郭永升，陳小龍，黃飛燕，余 磊，劉佳妮

(1.昆明學(xué)院/云南省都市特色農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究中心，云南昆明 650214；2.云南省煙草公司曲靖市公司，云南曲靖 655002；3.宣威市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，云南曲靖 655499；4.河南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司原料采購中心，河南鄭州 450000)

土壤微生物是土壤組成的重要成分，在土壤生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用，其在土壤中的分布特征和功能多樣性一定程度上能夠反映土壤質(zhì)量。有研究指出，土壤中微生物菌群結(jié)構(gòu)的失調(diào)將會極大增加作物感病概率[1]。植物土傳病害的發(fā)生受到諸多因素影響，其中土壤微生物通過產(chǎn)生具有促進(jìn)作物生長的植物生長激素以及具有抑制病原菌生長作用的抗病活性物質(zhì)，一定程度上提高植物抗病性，而根際是作物與微生物相互作用較為頻繁的區(qū)域，因此根際土壤微生物的結(jié)構(gòu)組成、多樣性以及微生物營養(yǎng)獲取方式等是植物土傳病害發(fā)生的重要影響因素。煙草黑脛病是由煙草疫霉侵染所致的土傳真菌性病害，在整個生育期中均能感病，其危害程度僅次于煙草病毒病，嚴(yán)重阻礙煙草產(chǎn)業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展。該病害主要以化學(xué)防治為主，但長期大量、不科學(xué)地使用化學(xué)藥劑勢必會造成一系列的負(fù)面影響，如病原菌抗性增強(qiáng)、農(nóng)藥殘留、環(huán)境污染等問題日漸突出；此外，化學(xué)農(nóng)藥在抑制病原菌生長的同時也使得土壤中大量有益微生物菌群的多樣性和豐富度降低，而抗病品種的選育與引進(jìn)因其抗病、經(jīng)濟(jì)、安全、有效等優(yōu)勢已成為防治煙草黑脛病的有效途徑。目前，我國抗黑脛病的品種有中煙9203、革新3號、單育3號、豫煙3號等，中抗品種有K326、K346、云87、云85等[2]，而云南省曲靖煙區(qū)主要以K326、云116、云87、云105等抗性品種為主。有研究表明，不同品種之間的根系分泌物、土壤酶活性也有所差異[3-4]，進(jìn)而影響根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)，而根際土壤微生物作為土壤-作物間養(yǎng)分轉(zhuǎn)換的重要調(diào)節(jié)者，對植株的抗病性及生長具有重要影響[5-6]。作物品種對根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響已在冬瓜、黃瓜、花生、苧麻等作物上得以證實(shí)[7-10]。王戈等以云85、K326、紅大等品種為材料，通過稀釋平板法和Biolog方法研究不同煙草品種根際土壤微生物數(shù)量和群落功能多樣性[11]；蔡秋華等采用相同方法對云87、K326、紅大不同生育期的根際微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，根際土壤中細(xì)菌、放線菌和微生物總量與品種抗性呈正相關(guān)，而真菌與抗性呈負(fù)相關(guān)[12]。前人研究大多采用傳統(tǒng)可培養(yǎng)的方法進(jìn)行，而土壤微生物大約只有1%可以通過傳統(tǒng)培養(yǎng)法進(jìn)行研究，絕大部分微生物不能被培養(yǎng)，因此采用傳統(tǒng)可培養(yǎng)方法研究土壤微生物多樣性具有一定的局限性，而使用高通量測序技術(shù)能夠從待測土壤中直接獲取各微生物DNA片段序列，并對其進(jìn)行測序分析，能夠比較直接、快速、準(zhǔn)確地對土壤樣品中的微生物種類與豐度進(jìn)行測定，為土壤微生物多樣性的研究提供更為便捷的方法，彌補(bǔ)其他土壤微生物分析方法的不足[13]。本研究采用高通量測序技術(shù)對云南煙區(qū)主栽煙草品種患黑脛病后的根際土壤微生物群落進(jìn)行研究，從土壤微生態(tài)角度探究不同抗性煙草品種根際土壤微生物群落與煙草黑脛病發(fā)生的關(guān)系，以期揭示不同品種根際土壤細(xì)菌在黑脛病發(fā)生的微生態(tài)理論機(jī)制，為煙草黑脛病的生物防治以及品種抗性機(jī)制研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

試驗(yàn)位于云南省曲靖市宣威熱水煙草品種試驗(yàn)地，試驗(yàn)地土壤類型為紅壤，供試烤煙品種有云97(A)、紅花大金元(B)、K326(C)、云105(D)、云116(E)、云100(F)、云87(G)和云99(K)。2019年7月分別采集各品種的根際土壤，每品種選取3株具有典型煙草黑脛病癥狀的煙株，將植株連根拔起后去除植株根系主土壤，收集根系表面2 mm根際土壤，裝入無菌自封袋中帶回實(shí)驗(yàn)室去除根系及其他雜物，并分裝于50 mL離心管中，置于-80 ℃ 中冷凍保存，待用。

1.2 土壤DNA的提取與擴(kuò)增

采用十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)法對各品種煙株的根際土壤進(jìn)行DNA提取，并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的純度和濃度，用無菌水將DNA稀釋至1 ng/μL作為模板，選用特異性引物341F(CCTAYGGGRBGCASCAG)和806R(G G A C T A C N N G G G T A T C T A A T)對細(xì)菌進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再用2%瓊脂糖凝膠電泳對擴(kuò)增產(chǎn)物質(zhì)量進(jìn)行檢測，用Qiagen公司提供的膠回收試劑盒回收產(chǎn)物，用 TruSeq? DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建庫試劑盒進(jìn)行文庫構(gòu)建，再經(jīng)過Qubit和Q-PCR定量，合格后用NovaSeq6000進(jìn)行上機(jī)測序。

1.3 下機(jī)數(shù)據(jù)的質(zhì)控與分析

剔除下機(jī)數(shù)據(jù)中的標(biāo)簽及引物序列，使用軟件FLASH(Version 1.2.7)進(jìn)行序列拼接得到原始數(shù)據(jù)；參照軟件Qiime(Version 1.9.1)的Tags質(zhì)量控制流程對序列進(jìn)行過濾、去嵌合體序列得到有效序列，并計(jì)算文庫覆蓋率(Coverage)、Chao1指數(shù)、ACE指數(shù)、Shannon指數(shù)，對根際土壤微生物群落中的物種多樣性和豐富度進(jìn)行評價；利用軟件Uparse在97%相似性水平上進(jìn)行OTU聚類分析；利用Mothur方法和SILVA數(shù)據(jù)庫進(jìn)行物種注釋，使用Qiime軟件進(jìn)行主成分分析，并利用R語言進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤樣品測序深度驗(yàn)證

稀釋曲線可以用來驗(yàn)證本次測序的深度是否合理，稀釋曲線越平坦越代表此時測序量足以覆蓋土壤樣品的微生物種群，反映土壤樣品種微生物的真實(shí)情況。由圖1可知，隨著序列數(shù)量的增加，細(xì)菌稀釋曲線逐漸趨于平坦，曲線斜率不斷減少，但最終并未進(jìn)入到平臺期，表明隨著序列數(shù)的不斷增加不會過多地產(chǎn)生新的物種，表明此次測序結(jié)果能夠較為全面地反映各根際土壤樣品中細(xì)菌群落與結(jié)構(gòu)的真實(shí)情況，細(xì)菌群落置信區(qū)間較高，具有一定的研究意義。

2.2 細(xì)菌OTU豐度和α多樣性

為了解煙草黑脛病對不同煙草品種根際土壤細(xì)菌的OTU豐度和α多樣性指數(shù)的差異，分別對OTU豐度以及細(xì)菌群落的豐富度指數(shù)(ACE指數(shù)、Chao1指數(shù))和多樣性指數(shù)(Shannon指數(shù))進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表1。各樣品文庫的覆蓋率(coverage)均達(dá)到0.97以上，表明各土壤樣品中絕大多數(shù)序列均被檢出，能反映各根際土壤中微生物群落的真實(shí)分布情況，測序讀長能進(jìn)行后續(xù)分析。

從表1可以看出，OTU豐度和α多樣性指數(shù)在部分品種間差異顯著(P<0.05)，各品種的OTU豐度表現(xiàn)為云99>云97>云116>K326>云105>云87>紅大>云100，其中云99與紅大、云100和云87差異顯著，而其他處理間無顯著差異。同時，從Venn圖(圖2)可以看出，各品種煙草根際土壤細(xì)菌共有的OTU數(shù)為1 198個，特有OTU數(shù)在不同品種間差異大，其中云87、云105、云99品種特有的OTU數(shù)較多，分別為185、177、167個，而云100特有OTU數(shù)僅有75個。豐富度指數(shù)中，ACE指數(shù)在3 129.17～3 559.25 之間，數(shù)值由高到底依次為云105>云116>云97>云87>K326>云99>云100>紅大，紅大與云97、K326、云105、云116和云87存在顯著差異；Chao1指數(shù)在3 053.40～3 591.46 之間，從高到低依次為云105>云116>云97>K326>云87>云100>云99>紅大，其中紅大、云100、云99顯著低于其他各處理。多樣性指數(shù)中的Shannon指數(shù)范圍在9.041～9.558之間，由高到低依次為云99>K326>云116>云105>紅大>云100>云97>云87，云99與云97、云87存在顯著差異。由上述分析可知，云105、云116、云97、K326品種煙草的根際土壤微生物豐富度較高，而在紅大品種中較低；而多樣性指數(shù)則在云99品種中較高，在云87中較低，表明不同煙草品種患黑脛病后其根際細(xì)菌的響應(yīng)程度有所差異，但從總趨勢來看對煙草黑脛病具有一定抗性的品種中，其細(xì)菌豐富度和多樣性要高于感病品種。

表1 不同樣品土壤細(xì)菌群落的多樣性指數(shù)

2.3 細(xì)菌群落組成與結(jié)構(gòu)分析

2.3.1 門水平上細(xì)菌群落組成 對患黑脛病后不同煙草品種的根際土壤細(xì)菌進(jìn)行測序，共獲得2 300個OTU，進(jìn)一步對其進(jìn)行注釋后共檢測到63個門、148個綱、335個目、457個科、781個屬、409個種。在門水平上，選取相對豐度排名前10的細(xì)菌門繪制門水平相對豐度圖(圖3)。由圖3可知，不同品種煙草根際土壤細(xì)菌群落中豐度相對較高的有變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、放線菌門(Actinobacteriota)、擬桿菌門(Bacteroidota)、酸桿菌門(Acidobacteriota)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)、泉古菌門(Crenarchaeota)、綠彎菌門(Chloroflflexi)、Myxococcota。不同處理間細(xì)菌門組成無明顯差異，但相對豐度組成差異明顯，其中變形菌門在不同處理中的相對豐度均較大，在云97、紅大、K326、云105、云116、云100、云87及云99中的相對豐度依次為27.87%、25.42%、27.44%、30.24%、32.43%、32.51%、34.75%和39.29%；厚壁菌門在紅大、K326、云105、云116中的相對豐度較大，均達(dá)到6%以上；放線菌門在云87中的相對豐度最低，僅有7.28%，而在云100中最高，達(dá)到17.90%，其他各品種中其相對豐度均在10.39%～15.43%之間；擬桿菌門、酸桿菌門、綠彎菌門以及Myxococcota門在各處理中均有分布，且相對豐度無明顯差異；芽單胞菌門在品種云87中相對豐度較高(7.83%)，而泉古菌門則在品種云97、紅大、K326、云105中的相對豐度較高，相對豐度依次為7.52%、2.57%、2.26%、4.27%。由此可見，不同品種煙草患黑脛病后其根際土壤細(xì)菌群落分布存在一定差異，變形菌門和放線菌門相對豐度較高，其次為酸桿菌門、厚壁菌門和擬桿菌門。

2.3.2 屬水平上細(xì)菌群落組成 由圖4可知，在屬水平上不同品種的根際土壤細(xì)菌相對豐度差異較大，通過準(zhǔn)確注釋的已知菌屬，其相對豐度占比依次為乳桿菌屬(Lactobacillus)(0.21%～6.45%)、鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)(4.10%～13.79%)、不動桿菌屬(Acinetobacter)(0.001%～2.570%)、芽單胞菌屬(Gemmatimonas)(0.64%～6.21%)、寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonas)(0.038%～1.670%)、梭菌屬(Clostridium_sensu_stricto_1)(0.04%～1.79%)、副球菌屬(Paracoccus)(0.02%～1.50%)、Romboutsia(0.07%～1.44%)、Bryobacter(1.01%～2.90%)、棒桿菌屬(Corynebacterium)(0.00～1.04%)、Ramlibacter(0.31%～2.11%)、節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)(0.85%～2.02%)、擬桿菌屬(Bacteroides)(0.02%～0.96%)、Escherichia-Shigella(0.01%～0.91%)、布勞特氏菌屬(Blautia)(0.08%～0.65%)、瘤胃球菌屬(Ruminococcus)(0.02%～0.67%)、Haliangium(0.67%～1.50%)、杜氏桿菌屬(Dubosiella)(0.008%～0.620%)。其中，鞘氨醇單胞菌屬在各品種中均表現(xiàn)出較高的豐度，平均為6.76%，且在云87中相對豐度最高，達(dá)到13.79%，為各品種的優(yōu)勢細(xì)菌屬；乳桿菌屬主要集中分布在紅大、K326、云105、云116品種中，其相對豐度分別為6.45%、2.35%、3.51%、4.82%；不動桿菌屬、寡養(yǎng)單胞菌屬、梭菌屬、副球菌屬、棒桿菌屬僅在品種云99中出現(xiàn)明顯分布，其相對豐度分別為2.57%、1.66%、1.79%、1.50%、1.04%；擬桿菌屬在各品種中的相對豐度較低，僅在品種云105中分布較為明顯，豐度為0.96%；布勞特氏菌屬僅在紅大、云105中相對豐度較高，同時杜氏桿菌屬在紅大中的相對豐度明顯高于其他煙草品種。同時，從圖4可以看出，紅大、云87、云99的已知菌屬相對豐度明顯高于其他處理，而云97、云100的相對豐度較低，且云87、云97、云100的菌群種類明顯少于其他處理，這與多樣性指數(shù)分析的結(jié)果一致。綜合各處理數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，鞘氨醇單胞菌屬、乳桿菌屬、芽單胞菌屬、Bryobacter為不同品種煙草根際土壤細(xì)菌的優(yōu)勢菌屬。

由圖5可知，不同處理樣品在屬水平上經(jīng)聚類后主要分為兩大類群，第1類群包括云97、紅大、K326、云105、云116、云100，且云97、紅大樣品距離更近，進(jìn)一步聚成一類；第2類群包括云87、云99這2個土壤樣品。在各土壤樣品中相對豐度較高的屬有鞘氨醇單胞菌屬、乳桿菌屬、芽單胞菌屬、Bryobacter、MND1、節(jié)桿菌屬、Haliangium、RB41、Skermanella、Bradyrhizobium屬、Gaiella、鞘脂菌屬Sphingobium、Ramlibacter、Lysobacter、土壤紅桿菌屬Solirubrobacter等，這15個菌屬的平均相對豐度之和占根際土壤細(xì)菌總豐度的23%以上，是根際土壤細(xì)菌的主要優(yōu)勢菌屬。各樣品細(xì)菌群落大致分為6簇，擬桿菌屬、Escherichia-Shigella、RB41和Skermanella屬聚成一組；乳桿菌屬、Romboutsia、鞘脂菌屬、朱氏桿菌屬Chujaibacter聚成一組；Lysobacter、Clostridium_sensu_stricto_1等6個菌屬聚成一組；Bryobacter、芽單胞菌屬等8個菌屬聚成一組；Haliangium、MND1、Gaiella等8個屬聚成一組；Pseudolabrys、Bradyrhizobium等5個屬聚成一組。不同樣品屬級聚類結(jié)果顯示，不同品種煙草患黑脛病后其根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和相對豐度存在顯著差異，羅河桿菌屬Rhodanobacter、戴氏菌屬Dyella的高豐度主要存在于云116中，無色小桿菌屬Achromobacter、類諾卡氏菌屬Nocardioides高豐度主要存在于云100中，擬桿菌屬和Escherichia-Shigella高豐度主要存在于品種云105 中，朱氏桿菌和Pseudolabrys分別在品種K326和云97中富集較為明顯，而RB41、乳桿菌屬和Romboutsia高豐度富集在紅大品種中，在品種云87中主要富集了芽單胞菌屬、JG30a-KF-32等8種菌屬，品種云99中主要富集了Clostridium_sensu_stricto_1、寡養(yǎng)單胞菌屬、副球菌屬等6種菌屬。

2.4 細(xì)菌群落組成的層級聚類及PCoA分析

為明確患黑脛病后不同煙草品種根際土壤之間微生物結(jié)構(gòu)組成差異，對不同處理根際土壤進(jìn)行β多樣性分析。基于Weighted Unifrac距離算法在OTU水平上對各根際土壤真菌群落進(jìn)行樣本層級聚類，結(jié)果如圖6所示。云97、云100、云87這3個品種中的所有樣品均能聚成各自分支，表明云97、云100、云87的3個樣品中組內(nèi)樣品差異較小，細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成相似，而紅大、K326、云105、云116、云99品種中的3個樣品未能聚成一支，說明該品種各樣品間的根際細(xì)菌結(jié)構(gòu)存在一定差異。

為進(jìn)一步說明不同品種根際土壤中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的樣品差異，在OTU水平上對各品種樣品進(jìn)行PCoA分析(圖7)，PC1和PC2對各樣品的差異性貢獻(xiàn)率分別為36.02%和24.72%，兩者總計(jì)可解釋全部根際土壤樣品的60.74%，所有樣品主要聚集在第二、第三象限，部分樣品分布于第一象限，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，在PC2的作用下，將云97、紅大、K326、云105樣品區(qū)分在PC2的正值區(qū)域，而將云116、云100、云87、云99區(qū)分在PC2的負(fù)值區(qū)域；其中，云97、云100、云87、云99中的3個樣品均能聚集在一起，表明組內(nèi)各樣品差異較小，而云116、云100、云99品種間距離較近，表明3個品種根際土壤細(xì)菌結(jié)構(gòu)組成相似，這與層級聚類結(jié)果一致。另外，紅大和云105品種中的3個樣品距離較遠(yuǎn)，表明組內(nèi)差異較大。不同品種中3個樣品有的密集聚集，有的較分散，說明各品種樣品間的主坐標(biāo)差異較為顯著，不同品種的根際土壤細(xì)菌結(jié)構(gòu)發(fā)生了顯著變化，可能因?yàn)槭艿搅似贩N和黑脛病侵染。

3 討論

烤煙作為云南省重要的經(jīng)濟(jì)類作物，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中發(fā)揮著重要作用。近年來，由于土地資源匱乏，土地流轉(zhuǎn)困難等原因?qū)е聼煵葸B作問題突出，煙草黑脛病發(fā)生日趨嚴(yán)重，給當(dāng)?shù)氐慕?jīng)濟(jì)造成了巨大的損失，同時引起土壤質(zhì)量的持續(xù)惡化[14-15]。隨著煙草產(chǎn)業(yè)朝著健康可持續(xù)方向發(fā)展要求的提出，化學(xué)防治方法已經(jīng)不能完全滿足目前的發(fā)展需求，而抗病品種的選育與引進(jìn)因其具有抗病、經(jīng)濟(jì)、安全、有效等優(yōu)勢而成為防治煙草黑脛病的有效途徑。長期以來，抗病品種極大地改善了煙草的生長發(fā)育，降低了病害的發(fā)生，顯著提高了煙葉品質(zhì)和經(jīng)濟(jì)效益。前人的大量研究主要集中在品種抗性、煙葉品質(zhì)、適應(yīng)性等方面，而關(guān)于不同品種對烤煙植株根際微生物的研究較少[16-18]。而土壤微生物是土壤中最為活躍的生物體，是連接土壤與作物之間的重要紐帶，對土壤肥力的形成、作物的營養(yǎng)吸收、抗逆性的提高以及維持土壤平衡等方面具有重要的作用，在一定程度上能夠反映土壤環(huán)境的變化，對植物的生長發(fā)育、病害的發(fā)生和土壤修復(fù)等方面產(chǎn)生重要影響[19-20]。

本研究結(jié)果顯示，不同品種間α多樣性指數(shù)存在一定差異，其中ACE指數(shù)與Chao1指數(shù)的變化趨勢無明顯差異，均在云105中最高，在紅大中最低，且云105的ACE指數(shù)、Chao1指數(shù)是紅大的1.14、1.18倍；而Shannon指數(shù)在云99中最高，為9.558，在云87中數(shù)值最低，僅有9.041；此外，不同品種間的細(xì)菌群落OTU數(shù)也有所差異，在云99中OTU數(shù)最多，在紅大和云100中數(shù)目較低，總體趨勢具體表現(xiàn)為對煙草黑脛病具有一定抗性的品種中，其細(xì)菌豐富度和多樣性要高于感病品種，這與陳康麗等在研究不同冬瓜品種對疫病抗性的同時并分析了其根際土壤微生物數(shù)量，發(fā)現(xiàn)不同冬瓜品種的根際土壤微生物量與品種抗性之間存在顯著正相關(guān)的結(jié)論[7]類似。同時蔡秋華等以對青枯病和黑脛病不同抗性品種為材料，研究了其根際土壤微生物數(shù)量也得出了一致的結(jié)論[12]。不同品種間根際土壤微生物的差異可能與其根系分泌物密切相關(guān)，大量研究表明，煙草根系分泌物的組成與含量因品種不同而呈現(xiàn)出一定的差異，在抗黑脛病品種中主要以酸類、酯類和丁香酚等物質(zhì)為主，而在感病品種中則以4-叔丁基苯酚和2，4-二叔丁基苯酚為主[2]。在作物生長過程中，根系分泌物與根際微生物之間的相互作用是一個重要的過程，根系分泌物及其各級代謝產(chǎn)物對根際微生物的組成與結(jié)構(gòu)產(chǎn)生重要的影響[21]。這可能是引起不同品種根際土壤微生物豐富度與多樣性產(chǎn)生差異的重要原因，且根際土壤細(xì)菌多樣性、豐富度越高，微生物競爭愈激烈，進(jìn)而有利于抑制病原微生物繁殖，減少病害發(fā)生。

根際土壤微生物主要分布在植物根系周圍，對作物的生長、病害的發(fā)生具有重要作用，根際土壤微生物在土壤中的群落結(jié)構(gòu)和組成易受到耕作方式、施肥方式以及作物種類和品種等多種因素的影響[22]。其他作物的不同品種對根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響前人已有研究，劉洪等以對甜菜根腐病具有不同抗性的甜菜品種為材料研究了不同品種甜菜根際微生物群落組成，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同品種間根際微生物群落結(jié)構(gòu)存在一定差異，在抗性品種中主要聚集了假單胞菌屬、節(jié)桿菌屬、芽孢桿菌屬等有益細(xì)菌，而在感病品種中則主要聚集了以尖孢鐮刀菌為主的多數(shù)病原菌[23]；趙衛(wèi)松等研究了抗、感棉花黃萎病品種的根際土壤細(xì)菌發(fā)現(xiàn)，在花鈴期不同階段抗、感病品種間微生物群落組成存在顯著差異，門水平上感病品種中放線菌門、芽單胞菌門、綠彎菌門、擬桿菌門等的平均相對豐度低于抗病品種，屬水平上鞘氨醇單胞菌屬、芽單胞菌屬、芽球菌屬等也低于抗病品種[24]。本研究在OTU水平上對不同煙草品種患病煙株根際土壤進(jìn)行層級聚類分析和PCoA分析發(fā)現(xiàn)，不同品種根際土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)存在顯著差異，這也進(jìn)一步證實(shí)了煙草品種的不同會引起根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的改變。在門分類水平上，各品種根際土壤微生物的菌門組成相似，主要有變形菌門、厚壁菌門、放線菌門、擬桿菌門、酸桿菌門、芽單胞菌門、泉古菌門、綠彎菌門等，變形菌門和放線菌門相對豐度較高，其次為酸桿菌門、厚壁菌門和擬桿菌門，這與向立剛等得出的上述菌門為煙株根際土壤細(xì)菌主要菌門的結(jié)果[25]一致。不同煙草品種根際微生物的差異主要體現(xiàn)在各菌門的平均相對豐度上，其中變形菌門在各品種中均有分布，且相對豐度較大，是各品種根際土壤的最優(yōu)勢菌門，但在紅大中的相對豐度較低；而擬桿菌門、酸桿菌門、綠彎菌門和Myxococcota在各品種根際土壤中均有分布，且相對豐度無顯著差異，除此外其余各菌門在各品種中均表現(xiàn)出一定差異。變形菌門是廣泛存在于土壤中的一種細(xì)菌菌門，且大多數(shù)為革蘭氏陰性菌，主要參與了土壤固氮，本研究中各處理變形菌門的相對豐度均較高，而在感病品種紅大中的相對豐度較其他品種要低，變形菌門相對豐度低將會影響作物養(yǎng)分的吸收，抑制作物的生長，增加感病幾率，這可能是該品種易感黑脛病的原因之一[26]。屬水平上，鞘氨醇單胞菌屬在各品種根際土壤中均呈現(xiàn)明顯富集，且抗性病品種中的相對豐度高于感病品種，云87中相對豐度顯著高于其他品種。有研究表明，鞘氨醇單胞菌屬在提高作物耐鉻方面具有重要作用，能夠顯著影響植物與抗重金屬脅迫相關(guān)酶的活性[27]。也有研究表明，鞘氨醇單胞菌屬能夠在植物根際附近分泌糖類物質(zhì)，促進(jìn)植物生長，但該菌的具體功能還有待進(jìn)一步分析[28]。乳桿菌屬為優(yōu)勢菌屬，其相對豐度在各品種中基本呈現(xiàn)出抗病>感病的規(guī)律，乳桿菌屬隸屬于厚壁菌門，該屬中多數(shù)細(xì)菌對土壤、水體等環(huán)境中的重金屬具有一定的吸附作用，近年來關(guān)于其在重金屬污染治理方面的研究較多，賈原博等從內(nèi)蒙古包頭重金屬污染地區(qū)的土樣中分離得到了清酒乳桿菌、植物乳桿菌等13株對重金屬鉛具有較強(qiáng)修復(fù)功能的細(xì)菌[29-30]，這類菌屬的富集有利于緩解重金屬對于煙株的危害，在一定程度促進(jìn)植株生長。鞘氨醇單胞菌屬和乳桿菌屬的大量富集可能與試驗(yàn)地塊土壤重金屬污染有關(guān)，這與云南土壤重金屬污染現(xiàn)狀相契合。此外，抗性不同的品種根際土壤細(xì)菌群落分布存在較大差異，芽單胞菌屬、朱氏桿菌、Pseudolabrys、羅河桿菌屬、戴氏菌屬、寡養(yǎng)單胞菌屬、副球菌屬等在抗性品種中特異性聚集，芽單胞菌屬和副球菌屬在緩解重金屬和抗生素復(fù)合污染等方面發(fā)揮著重要作用，能夠有效改善耕作土壤環(huán)境，促進(jìn)作物生長，增加作物抗逆性[31-32]；寡養(yǎng)單胞菌屬中部分菌種能夠在根際土壤中分泌相關(guān)抗真菌類物質(zhì)，合成抗病相關(guān)胞外酶，提高植株抗病性，同時還能夠分泌植物生長激素，促進(jìn)作物生長[33]。而RB41、乳桿菌屬、Romboutsia、無色小桿菌屬、類諾卡氏菌屬在云100和紅大感黑脛病品種中出現(xiàn)聚集，但這些菌屬在感病品種中聚集的具體原因還有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本研究利用Illumina MiSeq高通量測序技術(shù)對云南省不同抗性水平煙草品種的根際土壤細(xì)菌進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，不同抗性品種根際細(xì)菌多樣性和豐富度具體表現(xiàn)為對煙草黑脛病具有一定抗性的品種中，其細(xì)菌豐富度和多樣性要高于感病品種；而在細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)上，各品種主要優(yōu)勢菌組成無顯著差異，但菌屬在各品種根際土壤中的相對豐度差異顯著，芽單胞菌屬、朱氏桿菌、Pseudolabrys、羅河桿菌屬、戴氏菌屬、寡養(yǎng)單胞菌屬、副球菌屬、RB41、乳桿菌屬、Romboutsia、無色小桿菌屬、類諾卡氏菌屬在抗/感病品種根際土壤中差異較大。