煙草中木質(zhì)素調(diào)控研究進(jìn)展*

王 晉，張建鐸，許 永，張承明，李 晶，劉 欣，陳建華，孔光輝，吳玉萍，李雪梅，劉恩芬,楊光宇**

(1.云南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，云南 昆明 650106；2.云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，云南 昆明 650031;3.云南中煙再造煙葉有限責(zé)任公司，云南 昆明 650106)

木質(zhì)素是植物體內(nèi)的酚類大分子聚合物，是次生細(xì)胞壁的主要成分。在自然界界中,木質(zhì)素含量?jī)H次于纖維素，可用于化工原料和生物質(zhì)燃料，同時(shí)，對(duì)于造紙制漿、畜牧飼草也有著重要影響[1-5]。

木質(zhì)素在煙草中廣泛存在，具有重要的生物功能，如：增強(qiáng)植株的物理機(jī)械性能，改善莖稈強(qiáng)度[6]；有利于水分和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的輸送，改善植株的水分保持能力[7-10]；防御病原體、線蟲(chóng)等生物侵害，以及干旱、低溫等非生物脅迫；等等[11-14]。卷煙燃燒過(guò)程中，木質(zhì)素容易產(chǎn)生木質(zhì)氣、雜氣等，引起喉刺澀口等，而木質(zhì)素燃燒熱裂解產(chǎn)生的苯酚、多酚等小分子對(duì)健康也存在一定影響。因此木質(zhì)素對(duì)卷煙煙氣的感官品質(zhì)和卷煙的安全性存在重要影響[50-52]。

1 煙草木質(zhì)素結(jié)構(gòu)及表征

木質(zhì)素，作為一種復(fù)雜的酚類聚合物，按組成單元可分為：愈創(chuàng)木基木質(zhì)素(Guajacyl Lignin，G-木質(zhì)素)、紫丁香基木質(zhì)素(Syringyl lignin，S-木質(zhì)素)和對(duì)苯羥基木質(zhì)素(Hydroxy-phenyl lignin，S-木質(zhì)素)，他們分別由松柏醇(Coniferyl alcohol)、芥子醇(Sinapyl alcohol)和香豆醇(Coumary alcohol)聚合而成，如圖1所示[2,15-16]。煙草中木質(zhì)素主要是G-木質(zhì)素和S-木質(zhì)素。G-木質(zhì)素結(jié)構(gòu)單元上只含有一個(gè)甲氧基，其游離的C-5位置可與其他單體反應(yīng)形成穩(wěn)定的C—C交聯(lián)鍵，相對(duì)來(lái)說(shuō)難分離難降解;S-木質(zhì)素結(jié)構(gòu)單元上含有兩個(gè)甲氧基，無(wú)游離的C-5，不能形成C—C鍵，結(jié)構(gòu)較疏松，相對(duì)易于分離降解[16]。S/G的比值是評(píng)價(jià)木質(zhì)素的一個(gè)重要指標(biāo)，在造紙制漿、再造煙葉和生物質(zhì)燃料方面有著重要作用[1,6,17]。

圖1 木質(zhì)素單體結(jié)構(gòu)

木質(zhì)素的表征包括木質(zhì)素含量的表征和木質(zhì)素組成的表征。對(duì)于木質(zhì)素總量表征的方法有：間苯三酚法、Kalson法和乙酰溴法等[50-53]。間苯三酚法主要用于活體植株木質(zhì)素的半定量分析，將植株切片后，利用苯三酚對(duì)細(xì)胞壁將木質(zhì)素染成紅色，在顯微鏡下觀察顏色分布、深淺來(lái)對(duì)木質(zhì)素含量進(jìn)行分析。Kalson法，利用濃硫酸對(duì)樣品進(jìn)行降解，得到的難溶物固體即為木質(zhì)素，通過(guò)稱重就可以得到木質(zhì)素的含量。乙酰溴法，對(duì)樣品用乙酰溴處理，然后測(cè)定 280 nm 下UV的吸收強(qiáng)度。

木質(zhì)素組成的表征：①M(fèi)?ule染色，樣品利用高錳酸鉀和鹽酸處理，S-木質(zhì)素上的紫丁香環(huán)變成二甲氧基鄰苯二酚后，再以氨水生成甲氧基鄰醌，顯紫色；而G-木質(zhì)素不發(fā)生顯色。因此可利用顏色的深淺進(jìn)行木質(zhì)素組成的表征[18]。②中紅外法，利用G-木質(zhì)素和S-木質(zhì)素的不同紅外吸收特征來(lái)分析S/G，如 1320 cm-1為愈創(chuàng)木基環(huán)結(jié)構(gòu)的紅外特征吸收[19]。③拉曼光譜法[54]，1270 cm-1歸屬于愈創(chuàng)木基環(huán)醚鍵伸縮振動(dòng),1331 cm-1為紫丁香基環(huán)酚羥基彎曲振動(dòng)，利用其拉曼光譜吸收強(qiáng)度表征S/G。此外，還有核磁法、熱解/裂解-氣質(zhì)聯(lián)用法等。

2 木質(zhì)素生物合成及代謝路徑

木質(zhì)素生物合成可通過(guò)單體合成和單體聚合實(shí)現(xiàn)。木質(zhì)素單體的合成需要依次經(jīng)過(guò)草莽酸途徑(Shikimic Acid Pathway)、苯丙烷途徑(Phenylpropanoid Pathway)和特異性途徑。草莽酸途徑得到的苯丙氨酸經(jīng)過(guò)脫氨反應(yīng)、羥基化、甲基化反應(yīng)和氧化還原反應(yīng)等一系列反應(yīng)，最終生成3種木質(zhì)素單體(如圖2)[1-2,6,14]。單體經(jīng)過(guò)催化聚合得到相應(yīng)的木質(zhì)素聚合物，目前，該聚合過(guò)程機(jī)理尚不清楚。

3 木質(zhì)素合成酶及其基因調(diào)控

3.1 苯丙氨酸氨解酶(phenylalanine ammonialyase PAL)

苯丙氨酸在PAL催化下脫氨形成反式肉桂酸，該反應(yīng)為木質(zhì)素單體合成在苯丙烷途徑中的第一步反應(yīng)。在轉(zhuǎn)基因煙草中，PAL含量或活性增強(qiáng)，木質(zhì)素含量增加；反之，木質(zhì)素含量降低，但是要使木質(zhì)素水平顯著降低，則需要將PAL活性降低至野生型的10%以下，而過(guò)度抑制PAL的活性將導(dǎo)致植株矮化，抗逆性、環(huán)境適應(yīng)性降低[55]。同時(shí)，PAL抑制后，葉片形狀發(fā)生改變，生長(zhǎng)遲緩，花的形態(tài)顏色發(fā)生變化，花粉活性降低[20]。PAL活性降低，S/G比值增加，甲基含量增加[21，56]。

PAL不僅是煙草木質(zhì)素合成關(guān)鍵酶，同時(shí)也對(duì)類黃酮代謝物等合成存在影響。PAL是合成綠原酸的關(guān)鍵控制點(diǎn)，但是對(duì)于蕓香苷影響不大，PAL活性和綠原酸含量之間近似線性正相關(guān)[56]。PAL活性降低，可溶性苯丙烷類產(chǎn)物降低[20]。此外，生長(zhǎng)發(fā)育和環(huán)境等將調(diào)控影響PAL2啟動(dòng)子的時(shí)空表達(dá)，調(diào)節(jié)多種苯丙烷類天然產(chǎn)物的合成[22]。

3.2 肉桂酸-4-羥基化酶(cinnamate-4-hydroxylase，C4H)

C4H是木質(zhì)素單體合成的第二個(gè)限速酶，屬于植物細(xì)胞色素P450(CYP450)單加氧酶中的一種。C4H催化底物反式肉桂酸羥基化為對(duì)-香豆素。與PAL一樣，C4H不僅參與木質(zhì)素的合成，也參與類黃酮等苯丙烷代謝物的合成。在轉(zhuǎn)基因煙草中，C4H活性降低，木質(zhì)素含量降低，并伴隨著S/G比率降低[23，24]。

3.3 4-香豆酸輔酶A連接酶(4-Coumarate：CoA ligase，4CL)

4CL是苯丙烷代謝途徑的第三個(gè)限速酶，是木質(zhì)素的正向調(diào)控酶，調(diào)節(jié)木質(zhì)素的生物合成[24-27]。

4CL可將多種底物如阿魏酸、咖啡酸和對(duì)香豆素等羥基肉桂酸類代謝物，催化成對(duì)應(yīng)的羥基肉桂酸CoA酯。在4CL有義和反義調(diào)控轉(zhuǎn)基因煙草中，4CL下調(diào)，木質(zhì)素細(xì)胞壁中香豆酸、阿魏酸和芥子酸等3種羥基肉桂酸含量增加[25-27]，木質(zhì)部細(xì)胞壁由白色變?yōu)樽厣?CL活性增加，花中山柰酚含量增加了2倍[24]。

4CL還能調(diào)控木質(zhì)素的組成。4CL下調(diào)，G木質(zhì)素和S木質(zhì)素都降低，但是G木質(zhì)素降低更多，S/G值增加。

3.4 阿魏酸5-羥基化酶(Ferulate 5-hydroxylase，F(xiàn)5H)

F5H是木質(zhì)素合成中除C4H外的另一個(gè)重要的羥基化酶，也屬于細(xì)胞色素 P450 家族[18]。在木質(zhì)素合成過(guò)程中，F(xiàn)5H可將阿魏酸、松柏醛、松柏醇等催化得到相應(yīng)的5位羥基化化合物如5-羥基阿魏酸、5-羥基松柏醛和5-羥基松柏醇等，是S木質(zhì)素合成的關(guān)鍵酶[57]。在轉(zhuǎn)基因煙草中，F(xiàn)5H的基因沉默和過(guò)表達(dá)對(duì)植株木質(zhì)含量和生長(zhǎng)影響較小[57]，但是S木質(zhì)素會(huì)相應(yīng)的降低和增加[18]，因此，F(xiàn)5H基因是調(diào)控木質(zhì)素組成的很好的調(diào)控位點(diǎn)。

3.5 O-甲基轉(zhuǎn)移酶(O-methyltransferases，OMTs)

植物的O-甲基轉(zhuǎn)移酶(OMTs)家族分為兩種亞型[16]，其中，咖啡酸-O-甲基轉(zhuǎn)移酶(caffeic acid O-methyltransferase，COMT)屬于I型OMTs，咖啡酰-輔酶 A 甲基轉(zhuǎn)移酶(caffeoyl CoA 3-O-methyltransferase,CCoAOMT)屬于II型[27,58-60]。Maury認(rèn)為，煙草中存在兩種COMT類型(I和II)和三種不同的CCoAOMT類型[14]。CCoAOMTs在莖中表達(dá)量最高，它們參與G木質(zhì)素前體的合成。Pellegrini和Martz等[12-13]研究表明，COMT I基因?qū)ｉT參與木質(zhì)素的生物合成，而COMT II受病源物感染強(qiáng)烈誘導(dǎo)。

COMT可催化酸、醛或醇如咖啡酸、5-羥基阿魏酸、5-羥基松柏醛和5-羥基松柏醇等代謝物苯環(huán)上C5位的酚羥基甲氧基化。CCoAOMT催化底物為咖啡酰CoA、5-羥基阿魏酸CoA等，將其苯環(huán)上C5位的酚羥基甲氧基化。甲氧基化可以調(diào)控木質(zhì)素的化學(xué)組成及性能。抑制OMT活性能抑制丁香基單元的生物合成，提高S/G值[25-26]。

圖2 木質(zhì)素生物合成的苯丙烷代謝路徑

3.6 肉桂酰輔酶A還原酶(cinnamoyl-CoA reductas CCR)和肉桂醇脫氫酶(cinamyl alcohol dehydrogenase,CAD)

木質(zhì)素特異合成途徑酶主要有兩種：CCR和CAD。CCR為該合成途徑的第一限速酶，可將阿魏酰輔酶A、對(duì)-香豆酰輔酶A和5-羥基-阿魏酰輔酶A等三種底物分別催化為松柏醛、對(duì)-香豆醛和5-羥基-松柏醛。CAD是木質(zhì)素單體生物合成的最后一步的關(guān)鍵酶，可將對(duì)羥基肉桂醛、咖啡醛、松柏醛、5-羥基松柏醛和芥子醛等催化還原相應(yīng)的醇[28-31]。CCR和CAD的調(diào)控都將影響煙草中木質(zhì)素的含量和組成。Yahiaoui[19,37]等研究了CAD活性顯著下調(diào)的(對(duì)照的8%～56%)的轉(zhuǎn)基因煙草。其S/G顯著降低，同時(shí)轉(zhuǎn)基因煙草中木質(zhì)部中檢測(cè)到松柏醛(coniferyl aldehyde)。他們發(fā)現(xiàn),未轉(zhuǎn)化煙草莖中木質(zhì)部細(xì)胞壁肉桂醛的原位聚合產(chǎn)生紅棕色與反義的CAD下調(diào)植物木質(zhì)部的紅棕色類似。他們認(rèn)為肉桂醛的原位聚合是CAD下調(diào)植株中木質(zhì)部變紅得的原因。

3.7 聚合

化學(xué)上，木質(zhì)素單體通過(guò)脫氫聚合得到木質(zhì)素，而該生物合成過(guò)程仍然處于探索的初級(jí)階段。相關(guān)研究表明，負(fù)責(zé)催化該過(guò)程的酶主要是漆酶(Laccase，LAC)和過(guò)氧化物酶(Peroxidases，POX)，而其調(diào)控機(jī)理的還有待進(jìn)一步研究[1-4]。

Kavousi等[25]分別利用四季豆(French bean)和煙草的過(guò)氧化物酶FBP1和TP60反義轉(zhuǎn)化煙草。研究表明，除CCR外，所有木質(zhì)素合成酶轉(zhuǎn)錄水平皆下調(diào)，木質(zhì)素降低20%，纖維素和半纖維素合成基因轉(zhuǎn)錄水平增加，但是維管多糖含量和組成變化不大。形態(tài)上，轉(zhuǎn)基因煙草的木質(zhì)部欠發(fā)達(dá)，其纖維和維管的細(xì)胞壁薄，且次生壁增厚有限，并帶有異常的S2層，但是總體生長(zhǎng)正常。轉(zhuǎn)基因煙草，葉片厚度增加和葉尖分叉，葉綠體體積大和氣孔少。葉片顏色變淺，葉綠素a，b和類胡蘿卜素含量明顯降低。

Blee等[26]通過(guò)煙草過(guò)氧化物酶TP60在煙草中使用反義轉(zhuǎn)化下調(diào)，這使轉(zhuǎn)化株的木質(zhì)素降低高達(dá)野生型(對(duì)照)植物的40%～50%。通過(guò)硫酸解和硝基苯氧化分析，愈創(chuàng)木?；妥隙∠慊暮匡@著地隨著木質(zhì)素含量的降低呈線性下降。葉片有波浪狀而不是光滑的邊緣，花冠減少。

4 木質(zhì)素合成的轉(zhuǎn)錄組調(diào)控

轉(zhuǎn)錄因子即反式作用因子，是指能夠與基因啟動(dòng)子區(qū)中順式作用元件發(fā)生特異性結(jié)合的結(jié)合蛋白，通過(guò)蛋白的相互作用調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄因子對(duì)煙草的木質(zhì)素的合成起重要的調(diào)控作用。

NAC(NAM / ATAF / CUC)是最大的植物特異性轉(zhuǎn)錄因子(TF)家族之一，在木質(zhì)素生物合成中起重要作用。Yao在煙草中過(guò)表達(dá)NAC15基因，結(jié)果表明，CAD、PAL、4CL、C4H等木質(zhì)素相關(guān)基因表達(dá)水平增加，同時(shí)木質(zhì)素，半纖維素和纖維素含量增加[27]。

MYB(v-myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog)也是調(diào)控木質(zhì)素合成代謝的重要的轉(zhuǎn)錄因子家族。R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子的4亞群被認(rèn)為是調(diào)節(jié)苯丙烷途徑的抑制劑。Ma等[28]報(bào)道了一個(gè)編碼小麥4亞群R2R3-MYB因子的cDNA，TaMYB4。TaMYB4基因在莖和根組織中高度表達(dá)。酵母細(xì)胞的體外結(jié)合分析表明，TaMYB4可以與大米的(Rice Cinnamyl Alcohol Dehydrogenase 2) OsCAD2啟動(dòng)子中的AC-II元件相互作用。TaMYB4在轉(zhuǎn)基因煙草中過(guò)表達(dá)導(dǎo)致了參與木質(zhì)素生物合成的CAD和CCR基因的轉(zhuǎn)錄降低。酶促試驗(yàn)表明，轉(zhuǎn)基因煙草的CAD和CCR活性降低，明顯降低了總木質(zhì)素水平，但S/G比值增加。此外，轉(zhuǎn)基因煙葉中總黃酮含量增加，提示TaMYB4的過(guò)表達(dá)可能導(dǎo)致了代謝通量從木質(zhì)素途徑轉(zhuǎn)向黃酮類途徑。

MYB轉(zhuǎn)錄因子在苯丙烷代謝的調(diào)節(jié)中發(fā)揮廣泛的作用，同時(shí)也調(diào)控植物類黃酮代謝。Tamagnone等[29]研究發(fā)現(xiàn)，煙草中過(guò)表達(dá)了金魚(yú)草的AmMYB308和AmMYB330基因后抑制了酚酸代謝和木質(zhì)素合成，導(dǎo)致植物的維管組織中木質(zhì)素至少減少17%。研究表明，AmMYB308作為一個(gè)非常弱的轉(zhuǎn)錄激活子，它的過(guò)表達(dá)將可能會(huì)競(jìng)爭(zhēng)性地抑制識(shí)別相同目標(biāo)序列的強(qiáng)激活子的活性。

AC 元件也稱為 PAL-box 和 H-box，最早從香芹的PAL1 的啟動(dòng)子中分離鑒定來(lái)。大部分木質(zhì)素合成基因如PAL、4CL、CCR 和 CAD的啟動(dòng)子中都含有AC元件。AC元件分為三類AC-1(ACCTACC)、 AC-II(ACCAACC)和AC-III(ACCTAAC)，AC元件的活性將調(diào)控木質(zhì)素合成基因的表達(dá)。其中，AC-1和 AC-II對(duì)木質(zhì)素相關(guān)基因表達(dá)影響較大，它們單個(gè)的突變將導(dǎo)致木質(zhì)素相關(guān)基因表達(dá)降低，它們同時(shí)突變則會(huì)導(dǎo)致相關(guān)木質(zhì)素基因不表達(dá)。而AC-III元件的突變將輕微降低木質(zhì)素相關(guān)基因表達(dá)。AC 元件是 MYB 基因調(diào)控木質(zhì)素合成的重要方式。

Lin-Isl-Mec domain (LIM結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)) 是由最早克分離得到的Lin-1、Isl-1和Mec-3 三個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的首字母命名。Pal-box富含AC的元件，是苯丙烷途徑生物合成中基因表達(dá)的重要順式作用元件。Kawaoka等[30]得到了一個(gè)編碼Pal-box結(jié)合蛋白的基因Ntlim1。Ntlim1的氨基酸序列與LIM蛋白家族中含有鋅指基序的成員高度相似。Ntlim1具有特異性的DNA結(jié)合能力，由Pal-box序列驅(qū)動(dòng)的β-葡萄糖醛酸酶報(bào)告基因(β-glucuronidase reporter，GFP)的瞬時(shí)激活轉(zhuǎn)錄。煙草細(xì)胞瞬時(shí)表達(dá)試驗(yàn)表明，GFP與Ntlim1的融合蛋白可以進(jìn)入細(xì)胞核。反義Ntlim1轉(zhuǎn)基因煙草顯示PAL、4CL和CAD等關(guān)鍵苯丙類途徑基因轉(zhuǎn)錄量低。反義Ntlim1轉(zhuǎn)基因煙草的木質(zhì)素含量降低了20%以上。

EgMYB2是轉(zhuǎn)錄因子R2R3 MYB家族的一個(gè)亞群，Goicoechea等[31]從桉樹(shù)木質(zhì)部中克隆得到了EgMYB2。研究表明，EgMYB2蛋白能夠特異地結(jié)合兩個(gè)木質(zhì)素生物合成基因CCR和CAD啟動(dòng)子的順式調(diào)節(jié)區(qū)域，調(diào)節(jié)它們的轉(zhuǎn)錄。EgMYB2過(guò)表達(dá)的轉(zhuǎn)基因煙草植株表現(xiàn)出與野生型植株相比次生細(xì)胞壁厚度顯著增加，木質(zhì)素含量增加不大(5%)，但S木質(zhì)素增加，G木質(zhì)素減少，S/G值明顯增加。EgMYB2 是次生細(xì)胞壁形成和木質(zhì)素生物合成的正向調(diào)節(jié)劑。

WRKY轉(zhuǎn)錄因子對(duì)于植物生長(zhǎng)發(fā)育、植物抵抗生物脅迫和非生物脅迫具有重要作用，同時(shí)也對(duì)植物木質(zhì)素代謝合成起一定的作用。Mzid等[11]研究表明，過(guò)表達(dá)葡萄(Vitis vinifera L.)轉(zhuǎn)錄因子VvWRKY2的轉(zhuǎn)基因煙草植物對(duì)壞死性真菌病原體抗病性增強(qiáng)。VvWRKY2參與木質(zhì)素生物合成途徑的VvC4H基因啟動(dòng)子的激活。莖和葉柄中丁香基/愈創(chuàng)木基比值均降低。

AP2/ERF (APETALA 2/ethylene-responsive element binding factor)轉(zhuǎn)錄因子家族不僅能夠調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育，也能調(diào)控木質(zhì)素的生物合成。Liu在煙草中過(guò)表達(dá)了胡楊PsnSHN2基因[32]，它是擬南芥AP2/ERF型轉(zhuǎn)錄因子SHINE2的對(duì)應(yīng)基因。煙草中PsnSHN2的過(guò)表達(dá)顯著改變了與次生壁形成有關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子和生物合成基因的表達(dá)，導(dǎo)致次生壁比野生型增加了55%，纖維素增加了 37%，半纖維素增加了 28%，木質(zhì)素減少了 34%，根部斷裂應(yīng)力增加了22%。說(shuō)明PsnSHN2 協(xié)同調(diào)節(jié)纖維素、半纖維素和木質(zhì)素的生物合成。轉(zhuǎn)基因煙草的qRT-PCR 分析結(jié)果表明，煙草木質(zhì)素生物合成途徑基因PAL1、C4H、4CL1、CCR、COMT、CCoAOMT、CAD等轉(zhuǎn)錄水平受到顯著抑制。特異性激活木質(zhì)素生物合成途徑基因的 NAC 轉(zhuǎn)錄因子(SND1 和 VND6)和 MYB 轉(zhuǎn)錄因子(MYB58、MYB63 和 MYB85)的轉(zhuǎn)錄水平在PsnSHN2 轉(zhuǎn)基因株系中被顯著抑制。相反，專門激活了纖維素和半纖維素生物合成基因的中間開(kāi)關(guān)基因 MYB8311 和幾個(gè) MYB 基因(MYB20、MYB43 和 MYB69)的表達(dá)水平，在 PsnSHN2 轉(zhuǎn)基因品系中顯著增加。PsnSHN2通過(guò)選擇性上調(diào)/下調(diào)，控制次級(jí)壁形成的下游轉(zhuǎn)錄因子(NAC和MYB)來(lái)協(xié)調(diào)調(diào)控次級(jí)壁形成。

KNOX(Knotted1-like-homeobox)同源盒基因是轉(zhuǎn)錄因子，可用于調(diào)節(jié)發(fā)育和農(nóng)學(xué)上重要的植物特征，以優(yōu)化生物量質(zhì)量。BREVIPEDICELLUS(BP)/ KNAT1，一種特定的KNOX基因，是擬南芥形態(tài)發(fā)育以及木質(zhì)素生物合成的調(diào)節(jié)劑[67-68]。

BP功能突變將導(dǎo)致花序中木質(zhì)素生物合成的增加，而該基因的過(guò)表達(dá)導(dǎo)致植物中木質(zhì)素沉積的抑制[69]。這些結(jié)果表明，BP可通過(guò)抑制木質(zhì)素生物合成酶的作用，從而抑制了木質(zhì)素的沉積。因此，KNOX基因(如BP)參與控制木質(zhì)素生物合成。

Townsley等[33]發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)Kn1和LeT6(一種來(lái)自番茄與擬南芥(Shoot Meristemless)STM直系同源的非BP型KNOX1基因)的轉(zhuǎn)基因煙草葉子呈卷曲圓形，葉柄較短，木質(zhì)素含量在LeT6中沒(méi)有顯著改變，但在Kn1植物中顯著降低。相對(duì)于野生型轉(zhuǎn)錄水平表明，Kn1中過(guò)氧化物酶PRX(peroxidase)基因顯著增加，而在Kn1和LeT6中觀察到CAD顯著減少，表明KNOX基因至少調(diào)節(jié)木質(zhì)素生物合成途徑中的兩個(gè)關(guān)鍵步驟(CAD 和 PRX)。肉桂醛(木質(zhì)素的單體前體)分析表明，LeT6 中的肉桂醛部分沒(méi)有顯著差異，而Kn1莖中的肉桂醛部分相對(duì)于野生型顯著降低，這可能是由于木質(zhì)素含量降低造成的。Kn1可能通過(guò)改變4CL上游的生物合成步驟的水平來(lái)抑制木質(zhì)化，而CAD表達(dá)水平并沒(méi)有因?yàn)檫@一途徑流量的減少而受到限制。

5 其他

5.1 酶

糖基化發(fā)生在植物的許多生物過(guò)程中，并被認(rèn)為在一系列植物化合物的生產(chǎn)中起重要作用。糖基轉(zhuǎn)移酶(GTs)是負(fù)責(zé)植物化合物糖基化的酶。糖基轉(zhuǎn)移酶在維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)，發(fā)育以及對(duì)壓力環(huán)境的防御反應(yīng)中起重要作用[70-71]。糖基轉(zhuǎn)移酶在次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成，激素的修飾，和細(xì)胞壁合成等過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

Wang等[34]將楊樹(shù)的糖基轉(zhuǎn)移酶基因PtGT1(屬于GT1家族)在煙草中過(guò)表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)基因煙草中木質(zhì)素含量顯著增加70%以上，同時(shí)還出現(xiàn)明顯早花現(xiàn)象。但是GT1調(diào)控木質(zhì)素的機(jī)理還不清楚。

5.2 激素

植物激素是調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育和抗病抗逆的重要因子，而木質(zhì)素則是植物生長(zhǎng)細(xì)胞壁的組成部分和抗病抗逆的重要代謝化合物。因此激素也能調(diào)控木質(zhì)素的代謝合成。其中，赤霉素(Gibberellin, GA)、水楊酸(Salicylates，SA)、茉莉酸(Jasmonates ，JA)、乙烯(Ethylene，ETH)和吲哚乙酸(indoleacetic acid，IAA)等植物激素對(duì)木質(zhì)素合成調(diào)控研究較為廣泛[1-6]。

Sitbon在煙草中共表達(dá)了來(lái)自根癌土壤桿菌(A. tumefaciens)的 IAA 生物合成基因35S-iaaM和iaaH，在轉(zhuǎn)基因煙草中IAA含量增加，乙烯含量也顯著增加[35]。轉(zhuǎn)基因煙草莖中木質(zhì)部的木質(zhì)素含量高于野生型，木質(zhì)素的組成也發(fā)生了變化，G-木質(zhì)素增加，S/G比值降低。過(guò)氧化物酶(POD)活性增加明顯，而CAD酶和β-葡萄糖苷酶活性變化不大。POD的mRNA水平增加明顯，而POD的mRNA水平增加被認(rèn)為與與木質(zhì)素和相關(guān)多酚的水平升高有關(guān)。他們認(rèn)為轉(zhuǎn)化體中的高 IAA 水平，通過(guò)誘導(dǎo)乙烯合成，增加了 POD 活性，因此也增加了木質(zhì)素沉積。

6 總結(jié)及展望

木質(zhì)素作為一種重要的代謝化合物，不僅對(duì)煙草的生長(zhǎng)發(fā)育、抗病抗逆性存在影響，也對(duì)煙草的感官質(zhì)量存在重要影響。目前，對(duì)于煙草中木質(zhì)素的調(diào)控研究，有著廣泛的研究，其主要調(diào)控酶研究的較為清楚和透徹，但是其主酶調(diào)控基因以及主酶調(diào)控基因間相互作用影響研究還有待進(jìn)一步挖掘完善；木質(zhì)素單體到木質(zhì)素的聚合過(guò)程機(jī)理及基因調(diào)控機(jī)制還不是很清楚，有待進(jìn)一步研究；而轉(zhuǎn)錄因子以及轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)有一定研究，但是基因和調(diào)控機(jī)制還需系統(tǒng)研究；其他酶和激素基因?qū)煵菽举|(zhì)素的調(diào)控以及調(diào)控機(jī)理也有待拓展完善；現(xiàn)有技術(shù)主要使用的是轉(zhuǎn)基因技術(shù)，而隨著基因編輯技術(shù)的成熟應(yīng)用，基因編輯技術(shù)在煙草木質(zhì)素中的應(yīng)用，將有廣闊的研究空間。另外,煙草木質(zhì)素在煙草農(nóng)業(yè)適應(yīng)性、抗病性能、烘烤性能、香吃味感官性能、物理性能、加工性能、工業(yè)適用性能等研究較少，可以進(jìn)一步拓展相關(guān)研究。