煙草增香生物技術(shù)研究進展*

孫福艷，楊雪鵬，楊 成，王 龍，劉志宏，曾 祥，盧玉松，楊 楠

(1.湖北中煙工業(yè)有限責任公司，湖北 武漢 430000;2.鄭州輕工業(yè)大學 食品與生物工程學院，河南 鄭州 450000)

煙草中的淀粉、蛋白質(zhì)、纖維素等燃燒產(chǎn)生大量有害物質(zhì)，危害身體健康，也降低卷煙品質(zhì)。降焦減害、提高卷煙的安全性成為煙草行業(yè)的共同目標，但煙草香味物質(zhì)很大一部分存在于焦油中，降焦減害同時也使卷煙香味物質(zhì)不同程度的流失，難以滿足消費者抽吸需求，進而影響卷煙的銷售。

目前，增香方法主要有：①物理方法。如微波處理煙梗，能增加雜環(huán)類物質(zhì)，即煙草典型香味化合物的含量[1]，但大量耗能，很難實現(xiàn)大規(guī)模應用；直接提取芳香植物或動物中的天然揮發(fā)性物質(zhì)，但原料有限、成本高、產(chǎn)量低，不能滿足市場需求。②化學合成。香味物質(zhì)合成周期短且純度高，但香氣單一、安全性低且許多優(yōu)良香氣成分不能規(guī)?；a(chǎn)。③生物方法。產(chǎn)香功能的微生物發(fā)酵或者生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)香[2]，微生物利用天然原料發(fā)酵產(chǎn)香，綠色安全、香味物質(zhì)品質(zhì)高、反應條件溫和、周期短[2-3]。因此煙草行業(yè)專家紛紛將微生物增香作為研究的重點。

微生物產(chǎn)香種類豐富，如芽孢桿菌發(fā)酵可增加醇香、果香、甜香、辛香、蜂蜜香、醋酸香和醬香等特征香氣；酵母發(fā)酵可產(chǎn)生玫瑰香、蟠桃香等花果香[4]。微生物產(chǎn)生的一系列高活性酶系會將底物分解、轉(zhuǎn)化為復雜的小分子化合物，如醇類、酮類、酯類、呋喃類等香味化合物，煙草的香味就是這類物質(zhì)凸顯出來的。通過篩選特定產(chǎn)香菌、優(yōu)化培養(yǎng)基及發(fā)酵條件，定向產(chǎn)生煙草香氣物質(zhì)[5]。相關(guān)研究表明，氧化作用、微生物作用及酶作用是煙葉發(fā)酵三大機理[6]。在煙葉發(fā)酵中，添加微生物或酶制劑，卷煙的雜氣、刺激性降低，香氣量、香氣質(zhì)、吸味醇度等均有提升[7]。

目前煙草生物技術(shù)增香主要分為：①添加煙草香精香料，彌補了香氣不足，突出卷煙風格，利于品牌穩(wěn)定發(fā)展[8]。目前主要通過調(diào)控發(fā)酵條件、基因工程改造等生產(chǎn)煙用香料，制備較多的煙用香料如香蘭素、2-苯乙醇等單體香料，胡蘿卜素降解香料、多糖類及其他復合香料[9]。②將有益產(chǎn)香微生物或生物酶制劑接種于煙葉表面，使其在最優(yōu)的發(fā)酵條件下產(chǎn)香，高效實用，安全專一，極具發(fā)展?jié)摿10]。

1 煙草增香微生物的種類和來源

煙草發(fā)酵過程中，煙葉表面存在大量的微生物，細菌的數(shù)量和種類均占絕對優(yōu)勢，霉菌次之[10]。利用現(xiàn)代生物學手段將有益菌株篩選分離出來，將其應用于煙草發(fā)酵過程中，以此人為地達到增香提質(zhì)目的。本文主要針對國內(nèi)近10年內(nèi)有關(guān)增香微生物種類、來源文獻進行綜述，文獻檢索策略主要是利用關(guān)鍵詞“煙草產(chǎn)香微生物”“煙草增香菌株”等進行檢索，并對檢索得到的文獻進一步的研讀與分析。結(jié)果如表1所示。

表1 增香微生物的種類及來源

表1(續(xù))

從表1中可知，煙草增香微生物的種類多樣，分別為酵母菌、霉菌、細菌以及混合菌；酶的種類分為單一酶和混合酶，以及酶+微生物混合發(fā)酵增香。煙草增香菌主要是細菌和酵母，少數(shù)為霉菌；混合菌株仍以細菌和酵母菌居多，這與李秀妮、余玉莎等人的研究結(jié)果一致[10,24]。細菌以芽孢桿菌為優(yōu)勢菌屬，酵母菌中產(chǎn)香酵母、釀酒酵母為優(yōu)勢菌屬。芽孢桿菌代謝過程中產(chǎn)生大量胞外酶，經(jīng)過酶催化轉(zhuǎn)化積累各種多肽、氨基酸和還原糖類以及乙偶姻、四甲基吡嗪等美拉德反應產(chǎn)物[76]。酵母菌具有優(yōu)良的發(fā)酵及營養(yǎng)特性，可產(chǎn)生諸多風味物質(zhì)，增香效果顯著，安全性也較強[77]。

煙草增香微生物來源分為煙草源微生物、非煙草源微生物。從表1中看出，增香微生物主要篩選自煙草源，煙葉表面篩選的比例最大，其次為煙草土壤和浸提液。煙草源微生物能很好的適應煙葉生化環(huán)境，可與煙葉內(nèi)源微生物整體協(xié)調(diào)發(fā)酵，提升香氣質(zhì)、香氣量，改善卷煙吸味品質(zhì)，安全性高[78-79]。非煙草源微生物是指從非煙草環(huán)境中篩選出的微生物，此類微生物目前研究較少，主要是以食物為主，如葡萄、酒糟、酒曲、茶葉等。增香微生物從食源性材料中篩選，應用于煙草發(fā)酵，經(jīng)過一系列生物化學反應，產(chǎn)生香味物質(zhì)，整個過程綠色、安全。

酶制劑是從微生物中提取的具高催化活性的生物制品。從表1中看出，相比微生物發(fā)酵產(chǎn)香，添加酶制劑的研究較少，主要為單一酶、混合酶、微生物和酶聯(lián)合催化產(chǎn)香。單一酶有果膠酶、纖維素酶、蛋白酶、淀粉酶等，針對性解決煙葉本身不足；復合酶種類較雜，且一般是三種及三種以上的酶共同催化產(chǎn)香，故催化產(chǎn)生的小分子香氣物質(zhì)種類多，協(xié)調(diào)性好；增香微生物在生長過程中會產(chǎn)生一系列酶系，酶+微生物聯(lián)合催化產(chǎn)生香氣。研究表明，煙葉中淀粉、蛋白質(zhì)、纖維素和果膠等在不完全燃燒時，顯著影響卷煙煙氣的焦油、氫氰酸、亞硝胺類、苯并[a]芘(B[a]P)等有毒有害物質(zhì)的釋放量[58]。采用生物法酶解煙草中的蛋白質(zhì)、果膠等大分子物質(zhì)定向生成小分子增香，專一高效，提升煙葉整體品質(zhì)及協(xié)調(diào)性。酶制劑一部分直接從生物酶有限公司購得，純度高，活性強；一部分由微生物發(fā)酵代謝產(chǎn)生濃縮所得，經(jīng)濟實惠，產(chǎn)香豐富。

2 煙草增香微生物應用場景

本文對國內(nèi)近十年來增香微生物在煙草領域的應用統(tǒng)一歸納總結(jié)，主要分為五類。

2.1 增香微生物與卷煙

利用生物學手段定向篩選微生物(或添加酶制劑)應用于卷煙增香較多，精準性高，專一性好，取得了一定的成效。王曉丹等篩選畢赤酵母發(fā)酵煙葉(發(fā)酵前切絲，或者切絲后發(fā)酵)，得到煙草帶玫瑰花香、粉香、蜂蜜樣香氣[19]。張知曉利用白地霉(G.candidum) 發(fā)酵煙葉，產(chǎn)生酯類、醇類、酮類等揮發(fā)性香味物質(zhì)。李寧研究了蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)人工發(fā)酵雪茄煙葉，可以使雜氣減輕，香氣增加[22]。薛磊等篩選得到芽孢桿菌屬(Bacillussp.)發(fā)酵煙絲，煙氣香味物質(zhì)含量、細膩度、甜感均增加[39]。曾婉俐等將甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌應用于煙葉發(fā)酵，煙葉產(chǎn)生明顯奶香味[42]。于少藤等將假單胞菌yc10粗酶液用于煙葉發(fā)酵達到提質(zhì)增香的效果[43]。Lan Yao等利用芽孢桿菌Bacillusvelezensis發(fā)酵雪茄茄葉，結(jié)果表明酮類香味物質(zhì)顯著提高，茄葉香氣質(zhì)和香氣量均提升[46]。蘇加坤等篩選產(chǎn)酶菌株(芽孢桿菌)添加到煙絲上進行陳化，卷煙的香氣更加充實、雜氣及刺激性降低、余味更凈[55]。楊婧等將多酚氧化酶、抗壞血酸氧化酶生物酶制劑加入煙絲中制成新型煙草制品，抽吸過程中生物酶在適宜的條件下作用于煙絲，使其快速碳化，散發(fā)煙香，結(jié)果表明加入生物酶產(chǎn)生致香物質(zhì)的種類更多，含量更高，口感更好[70]。

2.2 增香微生物與煙用香料

利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)純天然的煙用香料來彌補煙葉自身香氣缺陷，產(chǎn)生的香味物質(zhì)豐富、醇和、與煙絲配伍性好。馬海昌利用耐高溫淀粉酶、糖化酶、復合植物水解酶處理煙梗制備煙用香料，GC-MS檢測結(jié)果顯示，糠醛、糠醇、茄酮等煙草典型致香成分含量增加，香氣濃郁而舒適[12]。鞏效偉等利用釀酒酵母菌(Saccharomycescerevisiae)KMLY1-2制備的電子煙煙液香氣諧調(diào)飽滿，余味干凈，抽吸品質(zhì)好[20]。楊金初等利用耐高溫α-淀粉酶發(fā)酵制備甘薯浸膏，該浸膏(烤甜香)致香成分為美拉德/焦糖化反應產(chǎn)物，與卷煙煙絲存在良好的配伍性[64]。

2.3 增香微生物與低廢煙草

利用低等級煙葉(或煙草廢棄物)發(fā)酵增香，減小煙草低次原料的庫存壓力，充分利用煙草廢棄物(煙末、煙梗等)價值，提升經(jīng)濟效益。吳長偉等利用貝萊斯芽孢桿菌HF-09(BacillusvelezensisHF-09) 固體發(fā)酵紅大煙梗(C3F)，結(jié)果表明該菌株能高效降解煙梗纖維素轉(zhuǎn)化生糖，菌株HF-09休止細胞發(fā)酵工藝的轉(zhuǎn)化效率和生香率更高[44]。伍雪瑩添加增香菌群處理低等級煙葉，結(jié)果表明，昆明菌群明顯提升了煙葉香氣質(zhì)、香氣量及透發(fā)性[53]。郭林青等篩選得漢遜酵母菌株YG-4，將其用于煙末發(fā)酵，發(fā)酵液醇類、雜環(huán)類物質(zhì)含量均有不同程度的增加，產(chǎn)生了特征香味物質(zhì)，改善了發(fā)酵液香味[56]。孫偉峰利用復配酶(多糖酶、中性蛋白酶、果膠酶、淀粉酶)處理低等級煙葉，結(jié)果表明，煙葉基本成分和含量更加協(xié)調(diào)，卷煙中性香味成分含量增加[63]。王毅等利用短小芽孢桿菌Bacilluspumilus0855-9發(fā)酵制得發(fā)酵蛋白酶液，將粗酶液均勻地噴灑至低次煙葉煙絲，明顯改善了煙葉的品質(zhì)、香氣質(zhì)，雜氣減輕，抽吸口感較好[67]。

2.4 增香微生物與煙草浸提液

浸提液為煙草液體環(huán)境，理論上有利于微生物建立對煙草(有害物質(zhì))的耐受性，更適合增香微生物在煙葉中生長、發(fā)酵。馬海昌利用生香酵母發(fā)酵煙梗提取液獲得了增香的效果[12]。葉建斌等利用類芽孢桿菌發(fā)酵再造煙葉浸提液，提高了發(fā)酵液中香味物質(zhì)種類和總量，樣品裂解過程中增加了γ-丁內(nèi)酯、2,3-二氫-5-甲基呋喃、糠醛等特征煙氣致香組分[40]。駱莉利用生香酵母和植物乳桿菌發(fā)酵煙梗提取液，提升了卷煙的香氣、煙氣及口感特性[52]。

2.5 微生物降解潛香物質(zhì)

在含有潛香物質(zhì)的培養(yǎng)基中進行微生物增香發(fā)酵，目的性強，產(chǎn)香定向、高效。段焰青等利用米曲霉(Aspergillusoryzae) 發(fā)酵降解β-胡蘿卜素，經(jīng)GC-MS檢測分析得發(fā)酵產(chǎn)物具有典型果香味[23]。黃申等將新鞘氨醇桿菌 (Novosphingobiumpanipatense) 在含有西柏三烯-4,6-二醇培養(yǎng)基上進行發(fā)酵降解試驗，該菌株將西柏三烯-4,6-二醇降解為金合歡醛(8.57%)[34]。蒿洪欣等分離、篩選得到降解類胡蘿卜素的芽孢桿菌屬，生成了2-庚酮、棕櫚酸、鄰苯二甲酸酐等降解產(chǎn)物[80]。

綜上所述，近10年來關(guān)于煙草增香微生物的應用主要集中在賦予卷煙典型香味、開發(fā)新型煙用香料、彌補低次煙葉的香氣缺陷、提升煙草薄片品質(zhì)、降解潛香物質(zhì)增香等，增香微生物已成為煙葉提質(zhì)增香的重要支柱，為煙草行業(yè)的發(fā)展注入新的活力。

3 結(jié)語及展望

通過總結(jié)分析，目前國內(nèi)煙草生物技術(shù)的相關(guān)研究主要有以下幾部分：

1)煙草生物增香技術(shù)主要有：微生物發(fā)酵生產(chǎn)煙用香料，微生物發(fā)酵煙草增香，添加酶制劑或微生物+酶制劑結(jié)合發(fā)酵煙草增香。

2)煙草增香菌主要是細菌和酵母，少數(shù)為霉菌。細菌以芽孢桿菌為增香優(yōu)勢菌屬，酵母菌中產(chǎn)香酵母、釀酒酵母為增香優(yōu)勢菌屬。主要從煙草環(huán)境篩選增香微生物，篩選比例排序為：煙葉表面>煙草土壤>浸提液。

3)煙草增香技術(shù)應用主要集中在賦予卷煙特色香味、開發(fā)新型煙用香料、彌補低次煙葉的香氣缺陷、提升煙草薄片品質(zhì)、降解潛香物質(zhì)增香等方面。

煙草增香生物技術(shù)研究取得了一定成果，但還存在許多的問題，今后可以從以下幾方面進一步開展：

1) 煙草源高效率微生物或酶制劑的開發(fā)研究。利用現(xiàn)代生物技術(shù)從煙草源環(huán)境中篩選優(yōu)勢增香微生物或制備酶制劑，應用于煙草發(fā)酵增香。

2)微生物增香機理探索研究，逐步挖掘出發(fā)酵增香機理、產(chǎn)香基因等，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將增香基因?qū)氪竽c桿菌或芽孢桿菌等菌株，控制代謝途徑，定向、高效產(chǎn)生煙用香味物質(zhì)。

3)完善煙草應用場景的工業(yè)化工藝技術(shù)，針對不同煙葉，研究菌株對煙葉生化反應的影響，優(yōu)化發(fā)酵及產(chǎn)酶條件等，完善微生物發(fā)酵產(chǎn)香的工業(yè)化工藝技術(shù)，精準指導工業(yè)化生產(chǎn)。