內(nèi)耳類器官技術(shù)的研究進(jìn)展

古興亮,林昭錦,齊潔玉,柴人杰,3,4,5,6

(1.東南大學(xué)數(shù)字醫(yī)學(xué)全國重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,附屬中大醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科,生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,生命健康高等研究院,江蘇省生物醫(yī)藥高新技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 南京 210096;2.華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院,廣東 廣州 510000;3.南通大學(xué)神經(jīng)再生協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇 南通 226001;4.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科,四川 成都 610072;5.中國科學(xué)院干細(xì)胞與再生醫(yī)學(xué)研究中心,北京 100101;6.首都醫(yī)科大學(xué)北京市神經(jīng)再生修復(fù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100069)

聽力損傷作為危害人類健康前三名的疾病,在全世界范圍內(nèi)有近五分之一的人被其困擾。 由于成年哺乳動(dòng)物毛細(xì)胞損傷或丟失后的不可再生性,研究和揭露聽力損傷相關(guān)的機(jī)制并制定干預(yù)策略對(duì)全人類有著非比尋常的意義。內(nèi)耳是感知聲音和平衡的器官。全世界超過6%的人患有聽力損失,同樣有6%的人患有平衡障礙。雖然內(nèi)耳疾病常見,但干預(yù)和恢復(fù)其感覺和平衡功能的方法有限。聽力損失致病機(jī)制研究和開發(fā)治療干預(yù)措施需要明確控制組織發(fā)育、存活的信號(hào)通路的基礎(chǔ)知識(shí),并建立基于人類細(xì)胞的治療策略。內(nèi)耳的體外模型,如類器官系統(tǒng),可以幫助識(shí)別新的保護(hù)或再生藥物,以及開發(fā)新的基因療法。

1 內(nèi)耳

2019年全球有15.7億人被聽力損傷所困擾,約占總?cè)丝谖宸种?在“全球疾病負(fù)擔(dān)”分析中,危害健康的傷殘損傷的病因前三名為腰痛、偏頭痛和聽力障礙。大多數(shù)永久性聽力缺失都是感音神經(jīng)型的[1]。人耳可以大致分為外耳、中耳和內(nèi)耳三部分[2],其中內(nèi)耳包含聽覺感受器和方位感受器,內(nèi)耳的機(jī)械感受器主要由感覺毛細(xì)胞和支持細(xì)胞組成[3]。感覺毛細(xì)胞能夠?qū)C(jī)械刺激轉(zhuǎn)化為電化學(xué)信號(hào),隨后激活螺旋神經(jīng)元(spiral ganglion neuron,SGNs)。前庭組織中的其他感覺斑塊,包括橢圓囊、球囊和半規(guī)管的壺腹嵴,都含有感覺毛細(xì)胞,負(fù)責(zé)感知線性運(yùn)動(dòng)、重力和頭部旋轉(zhuǎn),共同維持平衡感。耳蝸感覺上皮中存在兩種類型的毛細(xì)胞,內(nèi)毛細(xì)胞和外毛細(xì)胞,作為主要聲音受體其作用是放大上皮中的聲音誘導(dǎo)振動(dòng)[4, 5]。在鳥類中,內(nèi)耳毛細(xì)胞可以持續(xù)的更新[6～10],毛細(xì)胞的損傷可以激活病變區(qū)域支持細(xì)胞和毛細(xì)胞有絲分裂和分化[11, 12],從而恢復(fù)內(nèi)耳功能[13, 14]。普遍認(rèn)為哺乳動(dòng)物毛細(xì)胞僅在胚胎發(fā)育過程中產(chǎn)生,成年哺乳動(dòng)物內(nèi)耳毛細(xì)胞損傷或丟失后將很難再生[3, 15～22]。

2 內(nèi)耳類器官的構(gòu)建與發(fā)展

類器官是指由胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells,ESCs)、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cell, iPSC)、組織前體細(xì)胞或者成體細(xì)胞,在體外自組裝形成的能部分模擬體內(nèi)組織結(jié)構(gòu)與功能的細(xì)胞聚合體[23, 24]。2009年Sato等首次成功地在體外培養(yǎng)出了真正意義上的腸道類器官[25],這種腸類器官體系的成功建立開啟了類器官研究的新篇章。近幾十年,隨著體外干細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的進(jìn)步以及人們對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的深入理解,不同組織器官的類器官培養(yǎng)系統(tǒng)逐步受到重視并被建立和優(yōu)化。目前,已經(jīng)建立了包括腦、腎臟、肺、腸等在內(nèi)的多種類器官培養(yǎng)技術(shù)[26]。類器官技術(shù)的快速發(fā)展在疾病發(fā)生發(fā)展機(jī)制的研究[27]、建立新的藥物篩選方案[23]以及治療策略[28]等諸多方面都發(fā)揮了極其重要的作用。

目前的內(nèi)耳類器官衍生方案大多為在早期誘導(dǎo)期間操縱轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β (transforming growth factor,TGFβ),骨形態(tài)發(fā)生蛋白 (bone morphogenetic protein, BMP) 和成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子 (fibroblast growth factor, FGF),在分化后期激活Wnt信號(hào)通路來促進(jìn)耳基板形成[29～31]。2010年Oshima等首次證明了功能性內(nèi)耳毛細(xì)胞可以衍生自ESC和iPSCs[32]。2014年Karl等首次描述了一種利用三維 (3D) 小鼠胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)物生成內(nèi)耳類器官的培養(yǎng)系統(tǒng),提供了一種體外可重復(fù)、可擴(kuò)展生成內(nèi)耳感覺組織的方法。其中內(nèi)耳感覺組織在一定的生化條件下由小鼠胚胎干細(xì)胞產(chǎn)生,該模型適用于內(nèi)耳生物學(xué)和再生的基礎(chǔ)和轉(zhuǎn)化研究[29]。2016年Mills等描述了一種用于產(chǎn)生內(nèi)耳感覺上皮的3D培養(yǎng)方法,生成感覺毛細(xì)胞的同時(shí)還生成了神經(jīng)元群[33]。之后Koehler等給出了一種將人類多能干細(xì)胞分化為含有功能性毛細(xì)胞的內(nèi)耳類器官的方法。Koehler等使用3D培養(yǎng)系統(tǒng),通過調(diào)節(jié)TGF、BMP、FGF和Wnt信號(hào),誘導(dǎo)單個(gè)干細(xì)胞聚集體產(chǎn)生多耳囊泡結(jié)構(gòu)。同時(shí)使用CRISPR / Cas9,生成了ATOH1-P2A-eGFP細(xì)胞系來檢測(cè)誘導(dǎo)衍生毛細(xì)胞的效果,并證明衍生的毛細(xì)胞具有類似于天然感覺毛細(xì)胞的電生理特性。該培養(yǎng)系統(tǒng)將有助于闡明人類內(nèi)耳發(fā)育的機(jī)制和測(cè)試潛在的內(nèi)耳疾病相關(guān)療法[30]。Nie等發(fā)表了一種體外3D分化方法,將人多能干細(xì)胞(human pluripotent stem cell, hPSCs)聚集在低結(jié)合的96孔板中,并用細(xì)胞外基質(zhì)蛋白處理從而促進(jìn)其上皮化。用逐步調(diào)節(jié)BMP、FGF和Wnt等信號(hào)通路的小分子以及使用重組蛋白處理類器官,有順序地誘導(dǎo)非神經(jīng)外胚層、耳-鰓外胚層區(qū)和耳基板的形成。耳基板隨后經(jīng)歷自我引導(dǎo)的形態(tài)發(fā)生并形成耳囊泡,最終產(chǎn)生含有內(nèi)耳毛細(xì)胞和支持細(xì)胞的感覺上皮組織,以及與毛細(xì)胞有突觸連接的神經(jīng)元。這些hPSCs來源的內(nèi)耳感覺結(jié)構(gòu)被認(rèn)定為人類內(nèi)耳類器官[34]。Kurihara等提出了一種高效的將人iPSCs分化為含有SGNs樣細(xì)胞的內(nèi)耳類器官的方案,并在內(nèi)耳類器官的表面鑒定出與SGNs基因表達(dá)模式相似的神經(jīng)元細(xì)胞。這些細(xì)胞表現(xiàn)出神經(jīng)元特異性的電壓和時(shí)間依賴性的電流特性,類似于在嚙齒動(dòng)物SGNs中看到的兩種不同放電模式[35]。Liu等在3D培養(yǎng)系統(tǒng)中誘導(dǎo)小鼠胚胎干細(xì)胞產(chǎn)生機(jī)械敏感毛細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)類器官毛細(xì)胞的機(jī)械敏感性相當(dāng)于正常小鼠功能成熟的毛細(xì)胞,并擁有類似的離子通道表達(dá)動(dòng)態(tài)發(fā)育過程,和天然前庭毛細(xì)胞相似[36]。Osaki 等開發(fā)以一種誘導(dǎo)前庭毛細(xì)胞分化的類器官培養(yǎng)體系,使用前庭細(xì)胞來源的限定培養(yǎng)基會(huì)增強(qiáng)前庭毛細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物(Math1, Myosin6, Brn3c, Dnah5)的表達(dá),但未增強(qiáng)耳蝸毛細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物L(fēng)mod3的表達(dá)[37]。

3 內(nèi)耳類器官的應(yīng)用

3.1 模擬發(fā)育內(nèi)耳類器官可用于研究早期耳板誘導(dǎo),評(píng)估毛細(xì)胞和內(nèi)耳感覺神經(jīng)元發(fā)育,以及毛細(xì)胞與感覺神經(jīng)元之間的突觸發(fā)生。進(jìn)一步揭示了人類內(nèi)耳毛細(xì)胞再生的機(jī)制,使類器官成為研究?jī)?nèi)耳遺傳疾病和干細(xì)胞療法的重要工具[30]。內(nèi)耳類器官的3D培養(yǎng)系統(tǒng)可以產(chǎn)生大量功能齊全的感覺細(xì)胞,可用于研究?jī)?nèi)耳發(fā)育和疾病的機(jī)制以及內(nèi)耳修復(fù)的再生機(jī)制[36]。內(nèi)耳類器官模型也是首次提供驗(yàn)證基于藥物的療法、基因靶向方法和細(xì)胞替代療法的內(nèi)耳工具[38]。Nie 等使用人類多能干細(xì)胞衍生的類器官作為模型系統(tǒng)研究CHD7突變?nèi)绾斡绊憙?nèi)耳發(fā)育,CHD7在調(diào)節(jié)人類耳系規(guī)格和毛細(xì)胞分化中起著關(guān)鍵作用。該研究結(jié)果揭示了與CHARGE綜合征相關(guān)的內(nèi)耳表型的分子基礎(chǔ),提供了潛在的治療靶基因和途徑[39]。

目前對(duì)人類耳聾的細(xì)胞和分子生物學(xué)以及更廣泛的人類聽覺系統(tǒng)的大部分理解都是從動(dòng)物模型的觀察和實(shí)驗(yàn)研究中推斷出來的。由于無法在不對(duì)聽力或平衡器官造成重大、不可逆轉(zhuǎn)損害的情況下進(jìn)行人體活檢,因此通常對(duì)人類內(nèi)耳細(xì)胞的生物學(xué)研究?jī)H限于稀少的胎兒或尸體組織。利用內(nèi)耳類器官模擬遺傳性耳聾,對(duì)開發(fā)新的治療方法,如生長(zhǎng)因子、干細(xì)胞和基因療法有著非比尋常的意義,同時(shí)也是非常好的臨床前測(cè)試高保真模型[1]。

3.2 致聾機(jī)制研究此外,在類器官模型中應(yīng)用基因靶向技術(shù),可以敲除和敲入基因以研究不同基因?qū)?nèi)耳毛細(xì)胞分化與發(fā)育的作用[40, 41]。Cong等設(shè)計(jì)了兩種不同的II型CRISPR / Cas9系統(tǒng),具有簡(jiǎn)單可編程性和廣泛適用性,利用短RNA指導(dǎo)Cas9核酸酶精確切割人類和小鼠細(xì)胞中內(nèi)源性基因組位點(diǎn),將多個(gè)引導(dǎo)序列編碼到單個(gè)CRISPR陣列中,可以實(shí)現(xiàn)哺乳動(dòng)物基因組多位點(diǎn)同時(shí)編輯[42]。利用類器官和基因編輯技術(shù)可以很好的構(gòu)建不同的基因缺陷型耳聾模型,一般是從遺傳性耳聾患者身上收獲體細(xì)胞,通常是真皮成纖維細(xì)胞或外周血單核細(xì)胞,并將其轉(zhuǎn)化為iPSC,可以形成具有不同遺傳缺陷的細(xì)胞系[43]。

3.3 耳聾治療研究此外還可以建立一個(gè)強(qiáng)大的高通量耳蝸類器官平臺(tái),促進(jìn)人工耳蝸?zhàn)婕?xì)胞的3D擴(kuò)增和毛細(xì)胞的時(shí)間調(diào)節(jié)分化。Liu 等對(duì)FDA批準(zhǔn)的藥物庫進(jìn)行高通量篩選,將VEGFR抑制劑瑞戈非尼確定為用于毛細(xì)胞分化的強(qiáng)效小分子,該研究不僅證明了耳蝸類器官平臺(tái)在毛細(xì)胞生理學(xué)高通量分析中的能力,而且還強(qiáng)調(diào)了VEGFR-MEK-TGFB1信號(hào)串?dāng)_作為毛細(xì)胞再生和聽力恢復(fù)的潛在靶標(biāo)[44]。Kurihara 等證明內(nèi)耳類器官具有用作藥物誘導(dǎo)神經(jīng)病變實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷臐摿?以及為將來開發(fā)聽力缺失的新治療方法提供幫助[30]。內(nèi)耳類器官為內(nèi)耳發(fā)育和病理發(fā)生觀察提供了優(yōu)秀體外模型,在尋找新療法的過程中,加速治療藥物的發(fā)現(xiàn)。內(nèi)耳類器官還可用于測(cè)試病毒介導(dǎo)的先天性聽力損失障礙基因療法[44, 45],并篩選耳毒性藥物暴露后再生感覺毛細(xì)胞的小分子化合物[46]。

4 總結(jié)與展望

內(nèi)耳作為重要的感覺器官之一, 對(duì)其的研究從未停止過。內(nèi)耳類器官在內(nèi)耳研究鄰域發(fā)揮了重要的作用,也極大地推進(jìn)了內(nèi)耳器官的研究進(jìn)展。同樣,對(duì)內(nèi)耳類器官誘導(dǎo)構(gòu)建的研究從未停止過。異質(zhì)性是部分3D培養(yǎng)系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)同時(shí)也是局限性。與單層培養(yǎng)模式不同,類器官中的細(xì)胞根據(jù)其在類器官中的空間位置接收不同濃度的信號(hào)線索,常導(dǎo)致位于類器官不同深度的細(xì)胞不同步分化,表層中的細(xì)胞分化得更快。此外,內(nèi)耳內(nèi)器官僅產(chǎn)生前庭感覺器官樣結(jié)構(gòu)。未來仍需要對(duì)協(xié)同調(diào)控策略進(jìn)行進(jìn)一步修改,開發(fā)耳蝸細(xì)胞類型的誘導(dǎo)和分化新方法,包括如何衍生出耳蝸型毛細(xì)胞樣細(xì)胞,新生毛細(xì)胞是否存在細(xì)胞與細(xì)胞間連接,以及內(nèi)耳類器官是否容易受到導(dǎo)致人類和其他哺乳動(dòng)物耳聾的相同外在損傷,以及如何在體外再現(xiàn)調(diào)控內(nèi)耳的血液供應(yīng)的脈管系統(tǒng)。