原生質(zhì)體融合技術(shù)在食用菌遺傳育種中的應(yīng)用概述

夏會楠 李東曉 趙玉陽 王春霞 鄭素月 郭金英

（河北工程大學(xué)園林與生態(tài)工程學(xué)院，河北 邯鄲 056038）

食用菌俗稱蘑菇又名蕈菌，是一種可食用的大型真菌，不僅味道鮮美、營養(yǎng)豐富，還含有藥食同源的生理活性成分，可用于食品加工、保健品開發(fā)以及醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)等領(lǐng)域[1]。目前，我國食用菌栽培技術(shù)已十分成熟，但品種較少。食用菌品種選育的主要手段有原生質(zhì)體融合、雜交、野生菌馴化等[2-3]。原生質(zhì)體融合又被稱為體細胞雜交技術(shù)[4-5]，20世紀(jì)70年代開始應(yīng)用于食用菌領(lǐng)域。隨著食用菌產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，為培育出高產(chǎn)、抗逆性強、適應(yīng)性強的優(yōu)良新品種，學(xué)者將原生質(zhì)體融合技術(shù)逐漸應(yīng)用到食用菌菌株（品種）改良以及選育中。武秋穎等[6]以高產(chǎn)、抗逆性強的平菇Pleurotus ostreatus菌株CCEF89 和適應(yīng)性強的杏鮑菇Leurotus eryngii菌株P(guān)L7 為試驗材料，建立原生質(zhì)體PEG 融合體系，通過拮抗反應(yīng)試驗及Rep-PCR 分子鑒定方法鑒定融合子，然后選擇菌絲長勢強的融合子進行出菇試驗，以此選育平菇新菌株，同時為食用菌育種提供新的種質(zhì)資源。原生質(zhì)體融合技術(shù)也是改進真菌菌株代謝物譜和生物量產(chǎn)量的有效手段[7]。駢永茹等[8]采用單因素及正交試驗方法，優(yōu)化巨大側(cè)耳Pleurotus giganteus原生質(zhì)體制備條件，為巨大側(cè)耳雜交育種，全基因測序以及遺傳轉(zhuǎn)化提供優(yōu)良菌株。REN 等[9]采用原生質(zhì)體制備結(jié)合化學(xué)誘變法改良靈芝菌株，改良后靈芝菌株的多糖及三萜類化合物合成能力強，且具有穩(wěn)定遺傳性。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，原生質(zhì)體融合技術(shù)將會為食用菌育種提供一個廣闊的平臺[10]。

筆者概述原生質(zhì)體制備、融合方法及原生質(zhì)體融合技術(shù)在新品種選育上的應(yīng)用，展望未來應(yīng)用前景，為食用菌遺傳育種提供參考。

1 原生質(zhì)體制備及再生

1981年食用菌溶壁酶的出現(xiàn)，使原生質(zhì)體融合育種技術(shù)取得突破性進展[7]。食用菌在進行原生質(zhì)體制備時，原生質(zhì)體再生率易受外界條件影響，如菌齡、酶含量、酶解時間以及酶解溫度。RAMAN 等[4]通過GPE（聚乙二醇）誘導(dǎo)融合技術(shù)進行靈芝Ganoderma lucidum種間雜交，當(dāng)酶解時間為2.5 h 時原生質(zhì)體再生率最高，原生質(zhì)體產(chǎn)量為6.40×105個/mL。許琳等[10]以靈芝Ganoderma lucidum（赤芝及無柄靈芝）為試驗材料，采用單因素及正交試驗，優(yōu)化原生質(zhì)體制備條件，結(jié)果表明，赤芝菌絲菌齡為10 d，酶解溫度為35 ℃，酶解時間為3 h時，原生質(zhì)體產(chǎn)量最高，為9.75×107個/mL。李良敏等[7]優(yōu)化糙皮側(cè)耳Pleurotus ostreatus、雙孢蘑菇Agaricus bisporus、中國美味蘑菇A.sinodeliciosus的原生質(zhì)體制備方法，將鋪有玻璃紙的培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 d 的菌絲轉(zhuǎn)至培養(yǎng)皿后，直接加入溶壁酶，酶解60 min，獲得原生質(zhì)體106～107個/mL。此方法節(jié)省時間，操作簡便，不易污染。

2 原生質(zhì)體融合方法

2.1 原生質(zhì)體自發(fā)融合

原生質(zhì)體可以自發(fā)性融合，人為去除細胞壁后的原生質(zhì)體之間具有胞間連絲，由于胞間連絲黏連或者伸縮使得同類的兩個細胞發(fā)生融合，進而產(chǎn)生融合體。研究表明，適度的干旱條件有利于原生質(zhì)體的融合[8]，但原生質(zhì)體自發(fā)融合仍比較困難。

2.2 人工誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合

人為干預(yù)親緣關(guān)系較遠的原生質(zhì)體，不僅能促進其融合，還提高融合效率[8-9，11]。研究者常采用物理及化學(xué)方法來促進原生質(zhì)體融合。聚乙二醇常被用作促進原生質(zhì)體融合的化學(xué)誘導(dǎo)劑[12-13]；物理方法有離心、振動、電刺激[14-18]。

3 原生質(zhì)體融合技術(shù)在食用菌遺傳育種中的應(yīng)用

3.1 食用菌顏色遺傳規(guī)律研究應(yīng)用

食用菌品種繁多，色澤多樣，如金針菇有白色、黃色，真姬菇有白色、灰色。為滿足人們對食用菌顏色喜好，菇體顏色也成為食用菌育種的重要目標(biāo)性狀[5]。武秋穎等[6]進行交配型的原生質(zhì)體單核菌株配對雜交獲得F1 代，將F1 代子實體的孢子單核菌株與親本進行回交配對，觀察菇體顏色，分析子實體顏色遺傳規(guī)律。謝寶貴等[14]分析白色、黃色金針菇Flammulina velutipes雜交品種菇體顏色遺傳規(guī)律，發(fā)現(xiàn)黃色、白色是一對相對性狀，受一對等位基因控制。劉新銳等[15]以柱狀田頭菇Agrocybe cylindracea白色變種Ag.c0002、野生型Ag.c0067 為親本，進行兩者原生質(zhì)體單核菌株雜交，結(jié)果表明，柱狀田頭菇菇體顏色是受一對等位基因控制。盛春鴿等[16]以白黃側(cè)耳Pleurotus cornucopiae的白色菌株CCMSSC00358 及深灰色菌株CCMSSC00406 為試驗材料，采用自交、回交的方式研究子實體顏色遺傳規(guī)律，結(jié)果表明，白黃側(cè)耳的顏色性狀為數(shù)量性狀，灰色對白色為不完全顯性，由不同位點上的兩對基因控制。張澤華[17]以桃紅側(cè)耳Pleurotus djamor的粉紅色菌株CCMSSC00450、灰褐色菌株CCMSSC04445 為試驗材料，研究其顏色遺傳規(guī)律，將通過原生質(zhì)體融合技術(shù)獲得的不同交配型的單核菌株配對雜交得F1 代，根據(jù)F1 子實體顏色，推斷相對性狀的顯隱性，再通過單孢回交的方法構(gòu)建測交群體進行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果表明桃紅側(cè)耳子實體顏色是由多基因控制。原生質(zhì)體單核化雜交為子實體顏色遺傳規(guī)律研究以及后續(xù)食用菌育種提供基礎(chǔ)，將不同優(yōu)良性狀組合到雜交子中，根據(jù)市場需求制定育種目標(biāo)，將其應(yīng)用到生產(chǎn)實際中，為食用菌顏色定向育種提供理論依據(jù)[14-15]。

3.2 選育食用菌優(yōu)良菌株應(yīng)用

隨著食用菌產(chǎn)業(yè)化的不斷發(fā)展，豐富食用菌種質(zhì)資源，培育高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、穩(wěn)定遺傳的菌株是食用菌育種的重要目標(biāo)之一。王波[3]采用原生質(zhì)體制備技術(shù)獲得高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的黃色金針菇Flammulina velutipes，已大面積用于生產(chǎn)。刑振楠等[12]利用原生質(zhì)體融合技術(shù)選育抗逆性強、產(chǎn)量高的香菇Lentinus subnudus菌株，經(jīng)過DUS測試可以進行推廣。

3.3 食用菌雜交育種應(yīng)用

根據(jù)不同的育種目標(biāo)，通過滅活處理原生質(zhì)體進行不同屬之間的原生質(zhì)體融合獲得新的重組子，選育出高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗病性強的優(yōu)質(zhì)雜交新菌株[13]。錢可晴[18]采用原生質(zhì)體融合技術(shù)進行玉木耳Auricularia cornea與冰糯耳Auricularia heimuer雜交，獲得穩(wěn)定遺傳的純白色黑木耳優(yōu)良菌株，不僅為生產(chǎn)提供優(yōu)良菌株，也為后續(xù)雜交育種提供優(yōu)良的種質(zhì)資源。SINGH等[2]進行雙孢蘑菇Agaricus bisporus、姬松茸Agaricus blazei原生質(zhì)體融合子篩選，并研究優(yōu)質(zhì)融合子的菌絲形態(tài)、生長速度。陳小紅等[19]為獲得茯苓育種的漆酶轉(zhuǎn)化體系，以靈芝Ganoderma lucidum與茯苓Wolfiporia cocos為試驗材料，通過原生質(zhì)體親本滅活處理將靈芝的漆酶基因轉(zhuǎn)入茯苓中獲得優(yōu)良茯苓新菌株。肖在勤等[20]進行金針菇Flammulina velutipes與鳳尾菇Pleurotus pulmonarius原生質(zhì)體融合育種，選育出遠緣原生質(zhì)體融合菌株金鳳221，該結(jié)果引起食用菌界廣泛關(guān)注。蔡佺佑[21]為獲得兼具秀珍菇與巨大口蘑共同優(yōu)良特性的新菌株，進行秀珍菇Pleurotus geesteranus與巨大口蘑Tricholoma giganteum的原生質(zhì)體融合育種。鄭錦榮[22]、吳曉華[23]進行金針菇Flammulina velutipes、巨大口蘑Tricholoma giganteum原生質(zhì)體融合育種，獲得生長周期短的巨大口蘑新菌株以及高溫下可以生長的金針菇新菌株。

4 展 望

原生質(zhì)體融合技術(shù)自應(yīng)用以來備受科研工作者的重視與關(guān)注，科研工作者經(jīng)過不計其數(shù)的試驗獲得許多新品種。通過原生質(zhì)體融合育種雜交獲得穩(wěn)產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗病、抗蟲的優(yōu)良菌株，能穩(wěn)定遺傳的少之又少[24-25]。并且，仍有很多食用菌品種尚未建立相應(yīng)的雜交體系，不利于原生質(zhì)體融合育種技術(shù)的發(fā)展[26-27]。但隨著分子生物技術(shù)（酯酶同工酶、RAPD、分子標(biāo)記、原生質(zhì)體滅活）在原生質(zhì)體融合領(lǐng)域的發(fā)展，家族間遠緣雜交將取得重大進展，原生質(zhì)體融合技術(shù)也將在食用菌領(lǐng)域迅速發(fā)展[28-29]。