血清CTC聯(lián)合臨床特征對乳腺癌新輔助治療效果的預測價值*

獨曉燕，馬秀芬，周海存，周慶云

（甘肅省婦幼保健院 乳腺科，甘肅 蘭州 730050）

近年來，乳腺癌的發(fā)病率越來越高，已成為女性群體中最常見的惡性腫瘤之一，嚴重威脅女性健康[1]。乳腺癌屬于異質(zhì)性疾病，患者即使處于同一分期，其治療反應和臨床轉(zhuǎn)歸也不盡相同，傳統(tǒng)臨床病理參數(shù)已無法完全反應目前多種治療方法的療效。新輔助治療是在手術或以其他方式治療惡性腫瘤之前進行的全身性化療，其最初的目的是通過術前化療使晚期乳腺癌腫塊可以進行局部手術切除，后來也是為了縮小腫瘤體積并提高保乳手術率[2]。臨床應用新輔助治療能夠了解原發(fā)腫瘤對化療的敏感性，及時調(diào)整化療方案，減少對化療效果較差患者的毒副作用。同時新輔助治療能夠清除經(jīng)腋窩淋巴結轉(zhuǎn)移的癌細胞，改善預后[3]。另外新輔助治療還能夠有效控制乳腺癌早期微小轉(zhuǎn)移灶，抑制腫瘤細胞增殖，通過強化治療使患者達到病理學完全緩解（pathological complete response, pCR）。越來越多的研究[4-5]表明，pCR與乳腺癌患者新輔助治療后的遠期生存率顯著相關，循環(huán)腫瘤細胞（circulating tumor cell, CTC）和患者的臨床特征與pCR也具有一定相關性。因此，對影響患者pCR的相關因素進行研究對優(yōu)化新輔助治療方案、改善患者預后有重要意義。本研究旨在探討血清CTC聯(lián)合臨床特征對乳腺癌新輔助治療效果的預測價值，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性分析2019年4月—2022年4月甘肅省婦幼保健院收治的80例乳腺癌患者的臨床資料，根據(jù)患者治療效果分為pCR獲得組30例和pCR未獲得組50例。pCR獲得組患者經(jīng)新輔助治療后獲得pCR，即乳腺、腋窩淋巴結無浸潤性癌殘留，導管內(nèi)可有癌成分殘留；pCR未獲得組患者經(jīng)新輔助治療后未獲得pCR。兩組患者的一般資料比較見表1。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準（2019-18號）。

1.2 納入與排除標準

納入標準：①符合《中國晚期乳腺癌臨床診療專家共識2016》[6]的關于乳腺癌的診斷標準；②年齡18～75歲；③患者均接受新輔助治療；④美國東部協(xié)作腫瘤組（Eastern Cooperative Oncology Group,ECOG）體能狀況評分0～1分；⑤臨床資料完整。排除標準：①新輔助治療前已接受其他方式治療，如放療、內(nèi)分泌治療、靶向治療等；②有嚴重器質(zhì)性疾??；③男性乳腺癌患者；④無法耐受化療及手術；⑤已遠處轉(zhuǎn)移；⑥對化療藥物過敏；⑦心肝腎功能損害。

1.3 治療方法

依據(jù)《中國抗癌協(xié)會乳腺癌診治指南與規(guī)范（2017年版）》[7]選擇新輔助治療方案。①TAC方案：多西他賽（國藥準字：H20020543，規(guī)格：20 mg，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司）75 mg/m2，吡柔比星（國藥準字：H10930106，規(guī)格：20 mg，深圳萬樂藥業(yè)有限公司）50 mg/m2，環(huán)磷酰胺（國藥準字：H32020857，規(guī)格：0.2 g，江蘇盛迪醫(yī)藥有限公司）500 mg/m2；②TC方案：多西他賽75 mg/m2，環(huán)磷酰胺600 mg/m2；③TCbHP方案：多西他賽75 mg/m2，卡鉑（國藥準字：H10950273，規(guī)格：50 mg，云南植物藥業(yè)有限公司），靜脈滴注赫賽?。▏帨首郑篔20180073，規(guī)格：440 mg，上海羅氏制藥有限公司），首次劑量為8 mg/kg，之后為6 mg/kg，靜脈滴注帕妥珠單抗（國藥準字：JS20140058，規(guī)格：420 mg，上海羅氏制藥有限公司），第1個周期（治療21 d為1周期）的第1天首次劑量為840 mg，然后在第2～6個周期中，每個周期的第1天靜脈滴注420 mg，每3周給藥1次。HER-2陽性的患者給予靶向藥物治療，吡咯替尼（國藥準字：H20180013，規(guī)格：80 mg，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司）320 mg/次，1次/d。

新輔助治療1～6個周期，化療同時予以保肝、保胃等對癥支持治療，定期復查，總周期結束后2周進行手術，根據(jù)患者情況給予相應輔助化療、放射治療、分子靶向治療、內(nèi)分泌治療等，新輔助治療結束后2周評估患者的治療效果。

1.4 臨床資料收集

記錄所有患者的年齡、體質(zhì)量指數(shù)（BMI）、絕經(jīng)狀態(tài)、哺乳史、糖尿病史、高血壓史、乳腺疾病史、家族史、腫瘤大小、T分期、N分期、臨床分期、組織學分級、腋窩淋巴結狀態(tài)、雌激素受體（estrogen receptor, ER）、孕激素受體（progesterone receptor,PR）、人表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2, HER-2）、細胞增殖指數(shù)Ki-67、分子分型、CTC等臨床資料。

1.5 免疫組織化學檢測及判定

將穿刺活檢及手術切除的組織染色后進行免疫組織化學檢測，抗體和試劑盒均購自上海彩偌實業(yè)有限公司。具體方法：用10%甲醛將組織固定，脫水后制成石蠟切片；抗原修復和蒸餾水漂洗后將其放入磷酸鹽緩沖液中；用3%過氧化氫阻斷內(nèi)源性過氧化物酶并孵育10 min，經(jīng)蒸餾水漂洗后放入磷酸鹽緩沖液中10 min；將一抗ER、PR、HER-2、Ki-67分別加入其中后再孵育30 min，放入磷酸鹽緩沖液漂洗10 min；在辣根過氧化物標記的抗體銜接的顯色劑中孵育30 min，放入磷酸鹽緩沖液漂洗10 min，用二氨基聯(lián)苯胺顯色；最后蒸餾水漂洗、復染、封片。依據(jù)美國臨床腫瘤學會及美國病理學家協(xié)會[8-9]的標準判定ER、PR、HER-2、Ki-67結果，ER和PR陽性細胞與全部癌細胞比值≥ 1%為陽性，陽性細胞與全部癌細胞比值＜ 1%為陰性；HER-2陽性為細胞膜內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒；Ki-67陽性細胞比值＜14%為低表達，≥ 14%為高表達。

1.6 分子分型

Luminal A型為ER和/或PR陽性，且PR≥20%，HER-2陰性，Ki-67低表達。Luminal B型為Luminal B（HER-2陰性）：ER和/或PR陽性，HER-2陰性，且Ki-67高表達或PR＜20%；Luminal B（HER-2陽性）：ER和/或PR陽性，HER-2過表達，任何Ki-67。HER-2過表達型為ER和PR陰性，HER-2過表達。三陰型：ER、PR、HER-2均為陰性[10]。

1.7 CTC檢測及判定

采集患者靜脈血4 mL，以3 000 r/min離心20 min分離血清，采用紅細胞裂解、離心的方法去除紅細胞，然后用免疫磁珠的方式去除絕大多數(shù)的白細胞，得到樣品中剩余的稀有細胞包括葉酸受體陽性細胞，達到對目標細胞富集的目的。靶向探針標記系統(tǒng)使用特異性小分子探針對葉酸受體陽性細胞進行標記，在小分子探針與葉酸受體陽性細胞充分結合后，洗滌去除未結合的探針；然后洗脫受體結合的探針，用于后續(xù)定量檢測。聚合酶鏈反應（PCR）系統(tǒng)利用針對小分子探針設計的特異性引物，結合Taqman探針，采用實時熒光定量聚合酶聯(lián)反應（qRT-PCR），對葉酸受體結合的小分子探針中的寡聚核苷酸進行定量檢測；前期大樣本檢測結合受試者工作特征（ROC）曲線分析，推薦參考值為8.70 FU。血樣檢測值＜ 8.7 FU/ 3 mL判讀為陰性，為正常值參考范圍；血樣檢測值8.7～10.01 FU/ 3 mL判讀為陽性可疑；血樣檢測值＞ 10.01 FU/3 mL判讀為陽性[11]。

1.8 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標準差±s）表示，比較用t檢驗；計數(shù)資料以構成比或率（%）表示，比較用χ2檢驗；多因素分析采用非條件Logistic逐步回歸分析。P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩組相關因素的比較

pCR獲得組和pCR未獲得組的年齡、BMI、絕經(jīng)狀態(tài)、哺乳史、糖尿病史、高血壓史、乳腺疾病史、家族史、腫瘤大小、T分期、N分期、臨床分期、組織學分級、腋窩淋巴結狀態(tài)比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；兩組ER陰性、PR陰性、HER-2陽性、Ki-67高表達、HER-2過表達型、CTC陰性患者的占比比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），pCR獲得組ER陰性、PR陰性、HER-2陽性、Ki-67高表達、HER-2過表達型、CTC陰性患者的占比高于pCR未獲得組（P＜0.05）（見表1）。乳腺癌患者ER、PR、HER-2、Ki67免疫組織化學結果見圖1。

圖1 乳腺癌患者ER、PR、HER-2、Ki-67免疫組織化學結果 （×400）

表1 pCR獲得組與pCR未獲得組相關因素的比較

2.2 影響乳腺癌患者新輔助治療效果的多因素分析

以乳腺癌患者新輔助治療效果為因變量（效果不佳= 0，效果良好= 1），以ER（陽性= 0，陰性= 1）、PR（陽性= 0，陰性= 1）、HER-2（陰性= 0，陽性= 1）、Ki-67（低表達= 0，高表達= 1）、分子分型（Luminal A型或Luminal B型或三陰型= 0，HER-2過表達型= 1）、CTC（陽性= 0，陰性= 1）為自變量，納入非條件Logistic逐步回歸分析（α入=0.05，α出=0.10），結果顯示，ER陰性[=3.113（95% CI：1.524，6.359）]、PR陰性[=3.242（95% CI：1.431，7.345）]、HER-2陽性[=2.756（95% CI：1.135，6.692）]、Ki-67高表達[=2.895（95% CI：1.074，7.804）]、HER-2過表達型[=2.957（95% CI：1.247，7.012）]和CTC陰性[=3.688（95% CI：1.752，7.763）]是乳腺癌患者新輔助治療效果良好的影響因素（P＜0.05）。見表2。

表2 影響乳腺癌患者新輔助治療效果的非條件Logistic逐步回歸分析參數(shù)

2.3 血清CTC聯(lián)合臨床特征預測乳腺癌患者新輔助治療效果的價值

判定為治療效果良好的影響因素為：ER陰性、PR陰性、HER-2陽性、Ki-67高表達、HER-2過表達型、CTC陰性。聯(lián)合預測中任意一項指標提示治療效果良好，則視為聯(lián)合預測聯(lián)合預測獲得pCR。血清CTC聯(lián)合臨床特征預測乳腺癌患者新輔助治療效果的敏感性為93.3%（28/30）（95% CI：1.611，8.047）、特 異性 為94.0%（47/50）（95% CI：1.336，7.823），準 確性 為93.8%（75/80）（95% CI：1.288，8.112）。見表3。

表3 血清CTC聯(lián)合臨床特征預測乳腺癌患者新輔助治療效果

3 討論

乳腺癌是現(xiàn)今導致中國女性死亡的主要原因，近年來其發(fā)病率和病死率呈上升和年輕化趨勢[12]。乳腺癌的治療主要采取的是手術、化療、放療、靶向治療、免疫治療結合的方式，隨著乳腺癌治療技術、理念的進步和發(fā)展，新輔助治療也成為了乳腺癌治療的重要方式，在臨床治療應用中越來越多。新輔助治療可縮小腫瘤體積，降低腫瘤分期，減少腋窩淋巴結轉(zhuǎn)移，使不能手術和不能保乳的患者實現(xiàn)可手術和可保乳，提高手術率和保乳率。同時新輔助治療還可用于評價腫瘤對化療藥物的敏感性，指導后續(xù)治療。目前臨床可通過無創(chuàng)的影像學或查體等，以及有創(chuàng)的組織病理學評價乳腺癌患者新輔助治療的療效和預后，無創(chuàng)評價方式會受主觀因素影響，可能存在偏差；有創(chuàng)的組織病理學評價是評價腫瘤的金標準，但在新輔助治療和手術后才能進行，無法及時了解患者對化療藥物的敏感性并及時調(diào)整化療方案，可能錯失良機。因此尋找能夠反復檢測，并且可以及時反映患者預后的指標具有重要意義。

pCR是評價乳腺癌患者新輔助治療效果和預后的重要指標，多項研究[13-14]證實，獲得pCR患者的遠期生存率顯著高于未獲得pCR患者。本研究顯示，pCR獲得組ER陰性、PR陰性、HER-2陽性、Ki-67高表達、HER-2過表達型、CTC陰性的患者占比顯著高于pCR未獲得組，提示ER、PR、HER-2、Ki-67、分子分型、CTC與乳腺癌患者新輔助治療的效果有關。筆者分析原因如下：①ER和PR為基因調(diào)節(jié)蛋白，ER存在于人體乳腺、垂體、子宮、陰道等雌激素靶器官，細胞發(fā)生惡變時ER仍處于腫瘤細胞內(nèi)，并受內(nèi)分泌系統(tǒng)調(diào)節(jié)，所以腫瘤細胞在雌激素靶器官惡變后仍受激素調(diào)節(jié)；PR是雌激素作用的產(chǎn)物，與ER的表達相關[15-16]。ER和PR可下調(diào)細胞周期調(diào)節(jié)基因活性，通過調(diào)節(jié)生長因子受體通路對細胞的生長、發(fā)育、分化產(chǎn)生影響。ER陽性的乳腺癌為激素依賴性腫瘤，采取內(nèi)分泌治療的效果較好[17]，因此臨床檢測ER和PR在指導內(nèi)分泌藥物治療和評估患者預后有著重要的作用。有研究[18]報道，ER或PR陰性患者與陽性患者相比pCR獲得率更高，這也表明ER、PR陰性的乳腺癌細胞對于化療藥物更為敏感，更容易被殺死，ER、PR陽性的乳腺癌細胞則具有一定的耐藥性。②HER-2基因在正常情況下未激活，可參與調(diào)節(jié)細胞生長、增殖、分化的過程，在受到刺激后，無法正常調(diào)控，HER-2基因被激活，則具有了腫瘤轉(zhuǎn)化活性[19]。另外，HER-2基因過表達的乳腺癌患者常常也伴有拓撲異構IIA過表達，HER-2陽性患者新輔助治療后pCR獲得率更高可能與拓撲異構IIA過表達有關[20]。多數(shù)學者[21-22]認為，HER-2陽性的患者化療反應較陰性更好，但目前對于HER-2與新輔助治療的效果還存在較大爭議，結論并不統(tǒng)一，HER-2陽性患者病情發(fā)展快，如不使用靶向治療藥物可能延誤病情，影響預后，但并不是所有適合靶向治療的HER-2陽性患者都應用了靶向藥物，這可能會對HER-2預測預后的價值產(chǎn)生一定程度的影響。③正常乳腺組織中也會有Ki-67表達，但其陽性表達率一般＜3%，乳腺癌組織中Ki-67表達明顯上升，而且腫瘤的惡性程度越嚴重，Ki-67表達越高，Ki-67的陽性表達率是腫瘤增殖活性的反映。有研究[23]顯示，Ki-67高表達的患者對化療更敏感，因此更容易獲得pCR，但Ki-67高表達也有可能導致患者遠期生存率降低。④乳腺癌不同的分子分型對于新輔助治療的反應也不一樣，既往研究[24-25]顯示，在乳腺癌患者中，HER-2過表達型、三陰型、Luminal B型pCR率較高，最低的是Luminal A型，與本研究結果存在一定的相似之處。Luminal B型、HER-2過表達型和三陰型這3種乳腺癌分子亞型具有較強的侵襲性，因此患者可獲得更好的pCR，同時可延長生存期，但也有一些研究[26-27]指出，pCR的預后效應不能在所有分子亞型中適用，部分亞型的乳腺癌患者即使獲得了pCR，預后較好，但由于腫瘤本身具有的HER-2陽性、臨床IIIB-C期等生物學特性，可能會增加患者發(fā)生復發(fā)和轉(zhuǎn)移的風險，導致預后變差。⑤大部分乳腺癌患者在手術切除腫瘤及輔助治療后預后明顯改善，但存在部分患者因沒有及時發(fā)現(xiàn)早期進入循環(huán)系統(tǒng)的腫瘤細胞，發(fā)生了血液微轉(zhuǎn)移，從而影響預后。CTC生成及游走是細胞轉(zhuǎn)移的前提，研究[28-29]表明，在多種惡性腫瘤患者的外周血中均有CTC存在，CTC對化療反應敏感，而且CTC的檢測方法簡單、創(chuàng)傷小、可重復、可以準確地反映腫瘤的生物學特性，監(jiān)測CTC指標有利于評估患者病情和分期，預測輔助治療的效果，制訂個體化治療方案。單海琳等[30]研究顯示，在新輔助治療后CTC陰性乳腺癌患者比陽性患者總有效率更高，說明CTC轉(zhuǎn)陰可以提示更好的療效；郝帥等[31]分析結果也顯示，檢測CTC可以在一定程度上反映新輔助治療的療效。這也印證了本次研究中乳腺癌患者經(jīng)過新輔助治療后效果良好者CTC陽性率顯著低于效果不良者。

為尋找預測乳腺癌患者新輔助治療效果的有效指標，本研究行單因素分析和多因素的非條件Logistic逐步回歸分析，證實ER、PR、HER-2、Ki-67、分子分型、CTC是影響乳腺癌患者新輔助治療效果的因素。同時血清CTC聯(lián)合臨床特征預測乳腺癌患者新輔助治療效果能夠獲得更高的準確性，即血清CTC聯(lián)合臨床特征預測的敏感性和特異性高于單獨預測，因此，血清CTC聯(lián)合臨床特征能提高對乳腺癌患者新輔助治療效果的預測價值，有利于對患者病情的評估。另外，本研究仍存在一定不足之處，如樣本量較小，對患者的選擇可能存在一定偏倚，部分類型患者例數(shù)較少；作為回顧性研究，前期沒有較好地研究設計，化療方案的周期、類型等不統(tǒng)一，均可能影響對患者治療效果的判斷；本研究僅對患者短期治療效果進行評估，未對乳腺癌患者新輔助治療后的復發(fā)和生存期等遠期預后指標進行分析。后續(xù)可作更詳細、全面的前瞻性研究，并增加樣本容量，延長隨訪時間，觀察乳腺癌患者的遠期生存情況，使數(shù)據(jù)更加有效和可靠。

綜上所述，監(jiān)測CTC水平及臨床特征，可以及時反映化療效果，盡早發(fā)現(xiàn)疾病進展情況，并根據(jù)患者的病情變化及時調(diào)整最優(yōu)治療方案，從而提高療效，對乳腺癌患者新輔助治療效果具有一定預測價值。