頭孢克肟片微生物限度檢查方法研究

楊 麗 賴(lài)燁才 伍雙茜 陳婉榕

廣州白云山醫(yī)藥集團(tuán)股份有限公司白云山制藥總廠，廣東廣州 510515

頭孢克肟（cefixime）為第三代頭孢菌素類(lèi)抗生素，由日本藤澤制藥于20世紀(jì)80年代研發(fā)成功并應(yīng)用于臨床，其對(duì)革蘭陰性菌有較強(qiáng)的抗菌活性，對(duì)多種革蘭陽(yáng)性菌尤其是葡萄球菌抗菌活性較低[1-2]。頭孢克肟能與青霉素結(jié)合蛋白（PBP）相結(jié)合，抑制細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖的合成，從而破壞細(xì)菌分裂，起抗菌作用[3-4]。目前市場(chǎng)上頭孢克肟的劑型很多，但有關(guān)微生物限度檢查方法研究比較少，且已不適用于新版藥典要求，因此建立此類(lèi)藥物合適的微生物限度檢查方法是有必要的。在探索頭孢克肟片微生物限度檢查方法適用性時(shí)，只有通過(guò)消除其抑菌活性而建立的方法，才能真實(shí)反映其微生物污染情況，防止出現(xiàn)假陰性結(jié)果，這對(duì)該產(chǎn)品生產(chǎn)放行、有效期存放和企業(yè)微生物控制體系建立[5]具有重大意義。本研究依照《中華人民共和國(guó)藥典》（縮寫(xiě)為“ChP”）2020年版四部[6]進(jìn)行方法適用性試驗(yàn)，通過(guò)利用β-內(nèi)酰胺酶（頭孢菌素酶）[7-8]與頭孢類(lèi)藥物結(jié)合使其抗菌活性降低，結(jié)合薄膜過(guò)濾法、延長(zhǎng)酶作用時(shí)間、不影響檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)選擇更高稀釋級(jí)等方法，發(fā)揮協(xié)同作用而去除樣品的抑菌性，從而為頭孢克肟片的微生物限度檢查提供合理、有效和可行的方法。

1 儀器與材料

1.1 儀器

BSC-1600IIA2生物安全柜（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；EZ-FIT微生物過(guò)濾三聯(lián)支架（美國(guó)默克密理博）；BCE822-1CCN電子天平（北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；BSP-250生化培養(yǎng)箱（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；IN812C低溫培養(yǎng)箱（廣州貝特生物科技有限公司）；XG1.DTED-0.6D脈動(dòng)真空滅菌器（山東新華醫(yī)療器械股份有限公司）。

1.2 樣品與培養(yǎng)基

頭孢克肟片（白云山制藥總廠，批號(hào)：02210201-1、02210801、02210802，規(guī)格：0.1 g）；頭孢菌素酶（≥210萬(wàn)單位/5 ml，蘇州普今生物科技有限公司，批號(hào)：2103020）。

胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（TSB）[默克化工技術(shù)（上海）有限公司]、胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（TSA）[默克化工技術(shù)（上海）有限公司]、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（SDA）[默克化工技術(shù)（上海）有限公司]、沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基（SDB）[默克化工技術(shù)（上海）有限公司]、麥康凱液體培養(yǎng)基（MacB）（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司）、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基（MacA）（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司）、pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司）、0.1%無(wú)菌蛋白胨水溶液（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司），培養(yǎng)基適用性試驗(yàn)均符合ChP 2020年版規(guī)定。

1.3 菌種

大腸埃希菌[CMCC（B）44102]、金黃色葡萄球 菌[CMCC（B）26003]、銅 綠 假 單 胞 菌[CMCC（B）10104]、枯草芽孢桿菌[CMCC（B）63501]、白色念珠菌[CMCC（F）98001]、黑曲霉[CMCC（F）98003]，均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。

2 方法與結(jié)果

2.1 菌液制備

按ChP 2020年版四部制備金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌、黑曲霉菌、大腸埃希菌的102～104cfu/ml的菌懸液，進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)備用。

2.2 供試液制備

取供試品10 g，放入預(yù)熱不超過(guò)45℃ pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100 ml，振搖混勻，靜置5 min，取上層溶液[9]作為1∶10供試液，并用pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液稀釋為1∶100的供試液。

2.3 微生物計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)

2.3.1 需氧菌總數(shù)

2.3.1.1 方法適用性預(yù)試驗(yàn) 方案Ⅰ：取1∶10供試液10 ml，分別加入0.1 ml金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和枯草芽孢桿菌菌懸液混勻（≤100 cfu/ml），將含菌供試液1 ml加至100 ml 45℃ 0.1%無(wú)菌蛋白胨水溶液中經(jīng)薄膜過(guò)濾后，再用45℃ 0.1%無(wú)菌蛋白胨水溶液（100 ml/次），總量分別為300、500、700 ml沖洗，濾干后取出濾膜，貼于約含20 ml TSA（含頭孢菌素酶300萬(wàn)單位/100 ml TSA）并凝固的平皿上。

方案Ⅱ：取1∶100供試液10 ml，加入0.1 ml金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和枯草芽孢桿菌菌懸液混勻（≤100 cfu/10 ml），將含菌供試液10 ml加至100 ml 45℃ 0.1%無(wú)菌蛋白胨水溶液中經(jīng)薄膜過(guò)濾后，用45℃ 0.1%無(wú)菌蛋白胨水溶液（100 ml/次），總量為500 ml沖洗，濾干后取出濾膜，貼于約含20 ml TSA（含頭孢菌素酶300萬(wàn)單位/100 ml TSA）并凝固的平皿上。

方案Ⅰ和Ⅱ分別以同法測(cè)定菌液組和供試品對(duì)照組，分別計(jì)算回收比值。各平皿于32℃倒置培養(yǎng)3 d，逐日觀察。

結(jié)果顯示，采用方案Ⅰ和300、500、700 ml沖洗量，銅綠假單胞菌回收比值分別為0.33、0.41、0.43，枯草芽孢桿菌回收比值分別為0.20、0.35、0.41，均＜0.5；采用方案Ⅱ和500 ml沖洗量，金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和枯草芽孢桿菌回收比值分別為0.81、0.92和0.93，均在藥典規(guī)定的0.5～2.0之間。見(jiàn)表1。

表1 金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和枯草芽孢桿菌預(yù)試驗(yàn)回收比值

2.3.1.2 方法適用性試驗(yàn) 根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，方案Ⅱ是可行的，因此本試驗(yàn)按照方案Ⅱ采用3批次樣品，以及ChP規(guī)定的5種需氧菌進(jìn)行計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)，并設(shè)菌液組、供試品對(duì)照組以及滅活劑對(duì)照組。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，對(duì)ChP規(guī)定的5種需氧菌進(jìn)行3批次的計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)，結(jié)果顯示，試驗(yàn)組和滅活劑對(duì)照組中金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌和黑曲霉菌回收比值均＞0.90，均在ChP規(guī)定的0.5～2.0之間，故可照該供試品制備方法和計(jì)數(shù)方法測(cè)定頭孢克肟片的需氧菌總數(shù)。見(jiàn)表2。

表2 需氧菌總數(shù)和滅活劑對(duì)照組回收比值

2.3.2 霉菌和酵母菌總數(shù)方法適用性試驗(yàn) 頭孢克肟屬于β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素，具有較強(qiáng)的抗細(xì)菌活性，但對(duì)真菌（霉菌和酵母菌）基本無(wú)抗菌活性[9-11]，所以采用平皿法對(duì)其進(jìn)行檢查方法適用性試驗(yàn)。取1∶10供試液1 ml按照ChP 2020年版1105要求對(duì)3個(gè)不同批次進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果顯示，霉菌和酵母菌總數(shù)按照平皿法操作，3批次白色念珠菌回收比值均為0.92，黑曲霉菌回收比值分別為0.92、0.92和0.90，均在ChP規(guī)定的0.5～2.0之間，故此方法測(cè)定頭孢克肟片的霉菌和酵母菌總數(shù)有效、可行。見(jiàn)表3。

表3 霉菌和酵母菌總數(shù)回收比值

2.4 控制菌（大腸埃希菌）檢查方法適用性試驗(yàn)

方案①：取1∶10供試液10 ml，加至100 ml 45℃ 0.1%無(wú)菌蛋白胨水溶液混勻，全量經(jīng)濾膜過(guò)濾，再用45℃ 0.1%無(wú)菌蛋白胨水溶液適量（約100 ml/次），總量為500 ml，在最后100 ml沖洗液中加入1 ml大腸埃希菌菌懸液（≤100 cfu/ml），濾干，取出濾膜接入不少于100 ml TSB（含頭孢菌素酶60萬(wàn)單位/100 ml TSB）中。

方案②：取1∶10供試液10 ml，加至100 ml 45℃ 0.1%無(wú)菌蛋白胨水溶液混勻，全量經(jīng)濾膜過(guò)濾，再用45℃ 0.1%無(wú)菌蛋白胨水溶液適量（約100 ml/次），總量為300 ml，在最后100 ml沖洗液中加入1 ml大腸埃希菌菌懸液（≤100 cfu/ml），并在最后20 ml沖洗液中加入酶活力不少于60萬(wàn)單位的頭孢菌素酶，濾干，取出濾膜接入不少于100 ml TSB（含頭孢菌素酶60萬(wàn)單位/100 ml TSB）中。

方案③：取1∶10供試液10 ml，加至100 ml 45℃ 0.1%無(wú)菌蛋白胨水溶液混勻，全量經(jīng)濾膜過(guò)濾，再用45℃ 0.1%無(wú)菌蛋白胨水溶液適量（100 ml/次，總量為300 ml，在最后100 ml沖洗液中加入1 ml大腸埃希菌菌懸液（≤100 cfu/ml），并在最后20 ml沖洗液中加入酶活力不少于60萬(wàn)單位的頭孢菌素酶，靜置10 min后濾干，取出濾膜接入不少于100 ml TSB（含頭孢菌素酶60萬(wàn)單位/100 ml TSB）中。

方案①、②和③的試驗(yàn)組均采用3個(gè)不同批次進(jìn)行試驗(yàn)，并分別設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照組和陰性對(duì)照組，培養(yǎng)物于32℃培養(yǎng)至規(guī)定時(shí)間。結(jié)果顯示，采用方案①和方案②，3批次試驗(yàn)組中均有1批次未檢出大腸埃希菌，方案③中3批次均可檢出大腸埃希菌，故可用方案③控制菌檢查法進(jìn)行頭孢克肟片的大腸埃希菌檢查。見(jiàn)表4。

表4 大腸埃希菌檢查方法適用性試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

徐秋萍等[12]建立頭孢克肟顆粒的微生物限度檢查方法，需氧菌計(jì)數(shù)是供試液經(jīng)薄膜過(guò)濾法后再加入試驗(yàn)菌株，這種加菌方法已不適合現(xiàn)行ChP要求。本研究先接種試驗(yàn)菌于供試液[13]，采用薄膜過(guò)濾法、滅活劑及作用時(shí)間、選用更高稀釋級(jí)聯(lián)合應(yīng)用，消除或減弱頭孢克肟的抑菌作用，建立的方法可確保在檢查時(shí)能檢出樣品真實(shí)微生物含量。

通過(guò)薄膜過(guò)濾法可將供試品中抑菌成分有效去除，促進(jìn)供試品污染微生物生長(zhǎng)和繁殖。本研究采用薄膜過(guò)濾法減弱本品的抑菌活性，降低對(duì)各試驗(yàn)菌的影響；試驗(yàn)采用1∶10含菌供試液用薄膜過(guò)濾法，沖洗液量多至700 ml時(shí)，銅綠色假單胞菌和枯草芽孢桿菌回收比值仍低于0.5，可見(jiàn)頭孢克肟對(duì)這兩種菌株有較強(qiáng)的抑菌作用，表明1∶10供試液不適合用于需氧菌計(jì)數(shù)檢查。

加入適宜的滅活劑以及采用供試液的更高稀釋級(jí)進(jìn)行需氧菌計(jì)數(shù)。滅活劑添加到?jīng)_洗液或培養(yǎng)基中能鈍化、中和供試品抑菌活性，進(jìn)一步消除其抑菌成分；另外由于頭孢克肟片是口服制劑，在不影響結(jié)果判斷情況下，可采用使微生物生長(zhǎng)的更高稀釋級(jí)的供試液進(jìn)行計(jì)數(shù)試驗(yàn)。本研究需氧菌計(jì)數(shù)采用1∶100含菌供試液[14]經(jīng)薄膜過(guò)濾法沖洗，并加頭孢克肟的滅活劑β-內(nèi)酰胺酶[15]約60萬(wàn)單位于平皿培養(yǎng)基中，各菌株回收比值均在0.5～2.0之間，符合ChP規(guī)定。

延長(zhǎng)滅活劑作用時(shí)間[16]，頭孢菌素酶是一種蛋白質(zhì)，分子直徑大約在1～100 nm之間，遠(yuǎn)低于常用截留需氧菌的濾膜孔徑（0.45 μm），因此在大腸埃希菌檢查方法適用性試驗(yàn)中，在最后20 ml沖洗液中加入頭孢菌素酶靜置10 min，便于酶與殘留于濾膜上的頭孢克肟充分反應(yīng)，有效去除樣品的抑菌性，更有利于檢出大腸埃希菌。

藥物微生物限度檢查方法適用性試驗(yàn)的目的，首先是要為藥物制劑尋求一個(gè)具有專(zhuān)屬性、有效性和可行性的檢查方法；其次是方法操作要簡(jiǎn)單，檢查成本低、污染風(fēng)險(xiǎn)低，能滿足企業(yè)常規(guī)化的微生物檢驗(yàn)。本研究通過(guò)采用多種方法相結(jié)合來(lái)建立頭孢克肟片微生物限度檢查方法，所建立的試驗(yàn)方法操作方便，對(duì)不同廠家生產(chǎn)的頭孢克肟原料和制劑的微生物限度檢查方法具有一定的參考價(jià)值。