宣肺止嗽合劑微生物限度檢查方法的建立研究

劉 荔 李 巖 俞樹花 朱建寧

甘肅省藥品監(jiān)督管理局審核查驗(yàn)中心 （甘肅省疫苗檢查中心），甘肅蘭州 730070

宣肺止嗽合劑具有疏風(fēng)宣肺、止咳化痰的功效，是由荊芥、前胡、桔梗、蜜百部、蜜紫菀、陳皮、魚腥草、薄荷、蜜罌粟殼和蜜甘草提取制成的一種非無菌中成藥[1]。依據(jù)《中華人民共和國藥典》2020年版四部的規(guī)定[2]，需要先開展針對該藥的方法適用性試驗(yàn)，以驗(yàn)證所采用的方法是否可用于該產(chǎn)品的檢查；并建立出適用于該藥微生物限度檢查的方法，以用于評價(jià)藥物受微生物污染的程度。本研究針對宣肺止嗽合劑，考察了平皿法和薄膜過濾法對需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)的適用性，平皿法對霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)的適用性，常規(guī)法和增加培養(yǎng)基體積法對控制菌檢查的適用性，最終建立了一種適用于該藥微生物限度檢查的方法。本研究也為相關(guān)藥品質(zhì)量控制部門，進(jìn)行該藥品的微生物分析和質(zhì)量分析提供了重要參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

ClassⅡ BSC二級生物安全柜（新加坡Esco公司），ML6001T電子天平（瑞士Mettler Toledo公司），IN160恒溫培養(yǎng)箱（德國Memmert公司），MJ-70-I霉菌培養(yǎng)箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司）。

1.2 樣品

宣肺止嗽合劑規(guī)格為120 ml/瓶，批號為CP009210501，由甘肅某藥廠生產(chǎn)。

1.3 培養(yǎng)基及試驗(yàn)菌株

試驗(yàn)所用培養(yǎng)基的適用性檢查均符合《中華人民共和國藥典》2020年版四部的規(guī)定[2]；所用試驗(yàn)菌株均購自中國食品藥品檢定研究院，工作菌株均為第3代。

2 方法

參照《中華人民共和國藥典》2020年版四部1105和1106描述的微生物限度檢查法[2]，進(jìn)行試驗(yàn)。

2.1 試驗(yàn)用菌液的制備

將金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌和大腸埃希菌分別接種在胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，于30～35℃培養(yǎng)18～24 h；將白色念珠菌接種在沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中，于20～25℃培養(yǎng)48～72 h。之后用無菌pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液（以下簡稱“稀釋液”），將上述菌株新鮮培養(yǎng)物分別稀釋成含菌量≤1000 cfu/ml的菌液。將黑曲霉接種至沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基斜面上，20～25℃培養(yǎng)5～7 d，直至孢子明顯生成。用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的稀釋液將黑曲霉孢子洗脫，稀釋成含菌量≤1000 cfu/ml的菌液。

2.2 供試液制備

在無菌錐形瓶中，量取宣肺止嗽合劑原液10 ml，加入稀釋液充分混勻，制成1∶10的供試液。

2.3 微生物計(jì)數(shù)方法的適用性試驗(yàn)

2.3.1 平皿法 在需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)的試驗(yàn)中，取宣肺止嗽合劑原液9.9 ml，加入“2.1”項(xiàng)下某一菌液0.1 ml混勻，作為試驗(yàn)組；以稀釋液代替菌液，作為供試品對照組；以稀釋液代替宣肺止嗽合劑原液，作為菌液對照組。

在霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)的試驗(yàn)中，取“2.2”項(xiàng)下1∶10的供試液9.9 ml，加入“2.1”項(xiàng)下的白色念珠菌或黑曲霉菌液0.1 ml混勻，作為試驗(yàn)組；以稀釋液代替菌液，作為供試品對照組；以稀釋液代替1∶10的供試液，作為菌液對照組。

取上述試液各1 ml注皿，傾注15～20 ml胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，按藥典規(guī)定培養(yǎng)、進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)測定，每組平行3皿。

2.3.2 薄膜過濾法 取宣肺止嗽合劑原液9.9 ml，加入“2.1”項(xiàng)下的金黃色葡萄球菌或枯草芽孢桿菌0.1 ml混勻，作為試驗(yàn)組；以稀釋液代替菌液，作為供試品對照組；以稀釋液代替宣肺止嗽合劑原液，作為菌液對照組。取上述試液1 ml至100 ml稀釋液中混勻，經(jīng)濾膜過濾后轉(zhuǎn)移濾膜，菌面朝上貼于胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基平板上，按藥典規(guī)定培養(yǎng)后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)測定，每組平行3皿。

2.4 試驗(yàn)菌回收比值計(jì)算

試驗(yàn)菌回收比值=（試驗(yàn)組平均菌落數(shù)-供試品對照組平均菌落數(shù)）/菌液對照組平均菌落數(shù)

2.5 控制菌檢查法的適用性試驗(yàn)

2.5.1 常規(guī)法 在100 ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，加入“2.2”項(xiàng)下1∶10供試液10 ml，混勻后作為供試品組；加入“2.2”項(xiàng)下1∶10供試液10 ml和“2.1”項(xiàng)下大腸埃希菌的菌液0.1 ml，混勻后作為陽性對照組；加入稀釋液10 ml，混勻作為陰性對照組。按藥典規(guī)定培養(yǎng)，接種后進(jìn)行大腸埃希菌的檢查，每組平行3皿。

2.5.2 增加培養(yǎng)基體積法 除將胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基由“2.5.1常規(guī)法”中的100 ml換為200 ml外，其余均與“2.5.1”相同。

3 結(jié)果

3.1 微生物計(jì)數(shù)方法的適用性

依照《中華人民共和國藥典》2020年版四部1105的規(guī)定：微生物計(jì)數(shù)包含需氧菌總數(shù)的測定、霉菌和酵母菌總數(shù)的測定；計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)中，釆用平皿法或薄膜過濾法時(shí)，試驗(yàn)菌的回收比值應(yīng)在0.5～2.0范圍內(nèi)；若各試驗(yàn)菌的回收試驗(yàn)均符合要求，則可采用所用的供試液制備方法和計(jì)數(shù)方法[2]。

對需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)的適用性試驗(yàn)，本研究分別釆用了平皿法和薄膜過濾，兩種方法中均以宣肺止嗽合劑原液為供試液。平皿法對各菌株的回收比見表1，可看出對銅綠假單胞菌、白色念珠菌和黑曲霉的回收比均處于0.5～2.0，然而對金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的回收比均小于0.5，說明宣肺止嗽合劑原液對金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌均有較強(qiáng)的抑制性。薄膜過濾法試驗(yàn)顯示對金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的回收比均在0.5～2.0的范圍內(nèi)（表2），說明薄膜過濾法可消除供試液的抑菌性，符合藥典的要求，可用于需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)的試驗(yàn)。

表2 薄膜過濾法用于需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)的試驗(yàn)結(jié)果

在霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)的適用性試驗(yàn)中，采用平皿法和1∶10供試液對兩種藥典的規(guī)定菌（白色念珠菌和黑曲霉）進(jìn)行了試驗(yàn)。各菌的回收比均在0.5～2.0的范圍內(nèi)（表1），符合藥典的規(guī)定，表明該法可適用。

表1 平皿法用于需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)、霉菌及酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)的試驗(yàn)結(jié)果

3.2 控制菌檢查方法的適用性

宣肺止嗽合劑屬口服類不含藥材原粉的中藥制劑，依據(jù)《中華人民共和國藥典》2020年版四部通則1107[2]，本研究在控制菌檢查方法中釆用大腸埃希菌為試驗(yàn)菌種，采用常規(guī)法和增加培養(yǎng)基體積法以1∶10供試液進(jìn)行適用性試驗(yàn)。兩種方法對大腸埃希菌陽性對照組均可給出陽性結(jié)果，對供試品組及陰性對照組均未檢出，見表3。表明供試液對大腸埃希菌無抑菌性，這兩種方法均滿足《中華人民共和國藥典》2020年版四部通則1106的要求[2]，可用于控制菌的檢查。

表3 控制菌檢查方法的試驗(yàn)結(jié)果

4 討論

宣肺止嗽合劑是一種液體復(fù)方非無菌中藥制劑，廣泛用于中重度咳嗽和久咳的治療，且對治療兒童呼吸道感染安全性高、效果明顯[3]，對減輕慢性阻塞性肺疾病患者在急性加重期的炎癥反應(yīng)也有較好療效[4]，與沙美特羅替卡松聯(lián)合使用后能有效治療咳嗽變異性哮喘[5]。由于中成藥具有生產(chǎn)工序多、工藝復(fù)雜、品質(zhì)易受原料干擾等特點(diǎn)，在生產(chǎn)、包裝、運(yùn)輸、貯存等環(huán)節(jié)很容易受到外界環(huán)境影響而滋生微生物。藥品中污染微生物越多，藥品變質(zhì)、失效的風(fēng)險(xiǎn)也就越高，帶來的危害也就越嚴(yán)重，可能會造成患者感染，甚至威脅到患者的生命安全[6]。建立與宣肺止嗽合劑匹配的微生物限度檢查方法，可確定藥品及其原料、輔料等受微生物的污染程度，是評價(jià)該藥安全性的一項(xiàng)重要指標(biāo)[7]。

依照《中華人民共和國藥典》2020年版四部的規(guī)定：在微生物限度檢查時(shí)，需要判斷供試品對試驗(yàn)菌種是否有抗菌活性，如有則要選擇合適的方法先消除或中和其抗菌活性再進(jìn)行檢查，以保證方法的適用性[2]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，宣肺止嗽合劑處方中的荊芥、陳皮、魚腥草、薄荷、蜜甘草等成分會在一定程度上抑制糞腸球菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌或銅綠假單胞菌等微生物的繁殖和生長[8-11]，藥物中添加的苯甲酸鈉也可能會導(dǎo)致對某些微生物具有抑菌作用。因此，在方法適用性試驗(yàn)中需要特別關(guān)注宣肺止嗽合劑的抑菌作用和對抑菌作用的消除，這也是其他含有抑菌成分藥物的微生物限度檢查研究中所面臨的重點(diǎn)和難點(diǎn)[12-13]。

本研究中，在需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)方法的適用性試驗(yàn)中，以宣肺止嗽合劑原液為供試液，平皿法顯示供試液對金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌均有較強(qiáng)抑制性；采用薄膜過濾法，上述兩菌的回收比均處于0.5～2.0，表明薄膜過濾法可消除宣肺止嗽合劑自身的抑菌性，適用于需氧菌總數(shù)的計(jì)數(shù)。在霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)檢查的方法適用性試驗(yàn)中，平皿法可適用。在控制菌的檢查中，使用1∶10供試液、常規(guī)法和增加培養(yǎng)基體積法均適用；考慮到常規(guī)法使用的培養(yǎng)基數(shù)量更少、操作相對簡便、費(fèi)用較低，建議采用本法。

本研究探討了兩種常用的方法（平皿法和薄膜過濾法）在需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)中的適用性，發(fā)現(xiàn)薄膜過濾法有良好的適用性。通常薄膜過濾法先采用孔徑為0.22 μm的無菌微孔濾膜，對藥品過濾阻截微生物和不溶性大顆粒物質(zhì)，之后把濾膜貼置在培養(yǎng)基表面培養(yǎng)、計(jì)數(shù)，最終對藥品中污染菌種進(jìn)行檢測[14-15]。然而，薄膜過濾法操作繁瑣、所用到的測試材料多、對檢測人員的操作和環(huán)境潔的凈度要求很高，易導(dǎo)致假陽性結(jié)果，在未來的研究中應(yīng)繼續(xù)尋找更加簡便、易操作的適用性檢測方法。