快胃片聯(lián)合祛毒顆粒治療慢性腎衰竭合并高磷血癥大鼠鈣磷代謝紊亂的效果及機(jī)制

高 瑩 郭兆安 劉迎迎 姬亞敏 劉 充 李瑞豐

1.山東中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，山東濟(jì)南 250014；2.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 山東省中醫(yī)院腎病科，山東濟(jì)南 250014；3.山東省菏澤市中醫(yī)院腎病科，山東菏澤 274000；4.山東中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，山東濟(jì)南 250014

高磷血癥是終末期腎臟病最常見的并發(fā)癥之一，是導(dǎo)致慢性腎衰竭（chronic renal failure，CRF）患者低鈣血癥[1]、血管和組織異位鈣化、繼發(fā)性甲狀旁腺功能亢進(jìn)和慢性腎臟病礦物質(zhì)及骨代謝紊亂的常見因素之一[2]，是影響CRF患者預(yù)后的要素之一[3]。我國約73%的血液凈化患者血磷水平＞1.45 mmol/L，其中約90%的患者經(jīng)飲食控制和透析治療仍無法將血磷控制在正常范圍內(nèi)，需口服降磷藥物治療[4]。此前研究認(rèn)為海螵蛸改善鈣磷代謝主要與碳酸鈣有關(guān)[5-6]，且具有雙向調(diào)節(jié)鈣磷代謝的優(yōu)點[7-9]。單用海螵蛸具有服用不便及味道欠佳的缺點，而常用于改善胃腸道不適的快胃片以海螵蛸為主要成分，因此推斷其亦具有改善鈣磷代謝紊亂的作用。故本研究擬觀察快胃片聯(lián)合祛毒顆粒對CRF合并高磷血癥大鼠鈣磷代謝紊亂的療效，并從成纖維細(xì)胞生長因子23（fibroblast growth factor 23，F(xiàn)GF-23）、1，25-二羥維生素D3[1，25-（OH）2D3]和血清koltho方面對其機(jī)制進(jìn)行探索。

1 資料與方法

1.1 實驗動物

6周齡雄性SPF級SD大鼠，體重150±20 g，由濟(jì)南朋悅實驗動物繁育有限公司提供[SCXK（魯）20190003]。SPF級屏障環(huán)境內(nèi)飼養(yǎng)，自由攝食飲水，定時添加飼料及更換墊料。本實驗經(jīng)山東省中醫(yī)院倫理委員會審批（編號：AWE-2019-005）。

1.2 動物造模及分組

大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。隨機(jī)取出10只行假手術(shù)并常規(guī)飼養(yǎng)，記為sham組。另40只以5/6腎切除法聯(lián)合高磷飲食（磷含量1.03%）喂養(yǎng)4周，建立CRF合并高磷血癥模型。按sham組數(shù)據(jù)的95%可信區(qū)間制訂參考值范圍，造模成功后采用隨機(jī)數(shù)表法分為模型組（M組）、祛毒顆粒+碳酸鈣D3咀嚼片組（C組）、祛毒顆粒+低劑量快胃片組[L組：34 mg（0.2 ml）/20 g大鼠體重]、祛毒顆粒+高劑量快胃片組[H組：68 mg（0.2 ml）/20 g大鼠體重]，每組10只。

1.3 主要試劑及儀器

FGF-23、klotho、1，25-（OH）2D3ELISA試 劑盒，購自上海赫澎生物試劑公司；全自動生化分析儀，貝克曼AU5800；3D全景掃描儀，3D HISTECH Pannoramic250。

1.4 試驗用藥

快胃片（上海醫(yī)藥集團(tuán)青島國風(fēng)藥業(yè)股份有限公司，國藥準(zhǔn)字Z37021099，規(guī)格：0.7 g/片，2×12片/板/盒），碳酸鈣（惠氏制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字H10950029，藥品規(guī)格：復(fù)方，每片含鈣1.5 g、維生素D3125 U，60片/瓶），祛毒顆粒組方：大黃12 g、黨參30 g、黃芪30 g、石韋30 g、薏苡仁30 g、熟地黃30 g、雞血藤30 g、川牛膝30 g、砂仁9 g、酒萸肉12 g、當(dāng)歸15 g、枸杞子15 g，由山東省中醫(yī)院提供。

1.5 給藥方法

sham組和M組：2 ml/d生理鹽水灌胃，2次/d，2次間隔1 h。治療組：祛毒顆粒1.8 g（0.2 ml）/20 g大鼠體重灌胃（成人等效劑量，水提濃縮）；在此基礎(chǔ)上，C組給予碳酸鈣18.2 mg（0.2 ml）/20 g大鼠體重灌胃（成人藥量2倍），L、H組分別給予快胃片34、68 mg（0.2 ml）/20 g大鼠體重灌胃（成人藥量3、6倍）。兩種藥物灌胃間隔1 h，共給藥4周。

1.6 觀察指標(biāo)

1.6.1 腎功能相關(guān)指標(biāo) 給藥前、后采用生化法測定尿蛋白/尿肌酐（albuminuria creatinine ratio，ACR），全自動生化儀檢測血肌酐（serum creatinine，Scr）和尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）。

1.6.2 療效相關(guān)指標(biāo) 采用全自動生化儀檢測血鈣（calcium，Ca）、血磷（phosphorus，Pi）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、甲狀旁腺激素（parathyroid hormone，PTH）。

1.6.3 機(jī)制相關(guān)指標(biāo) 采用ELISA試劑盒檢測血清FGF-23、1，25-（OH）2D3和klotho。

1.6.4 腎臟組織學(xué)檢測 實驗結(jié)束時取腎臟組織，處理后行HE、PAS染色下光鏡檢測及透射電鏡檢測。

1.6.5 FGF-23半定量分析 使用Quant Center 2.1軟件定量切片目的區(qū)域的H-Score，H-SCORE=∑（PI×I）（PI：陽性信號像素面積占比，I：著色強(qiáng)度）。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 25.0。正態(tài)分布計量資料表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（），組間比較采用單因素方差分析、組內(nèi)比較采用配對t檢驗。P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜ 0.01為差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

造模過程中，sham組大鼠術(shù)后不明原因死亡2只；40只造模大鼠中5只因手術(shù)死亡，3只指標(biāo)未達(dá)到造模目的。給藥過程中死亡4只，其中M組2只、C組和H組各1只。造模完成后，與sham組相比，各造模組大鼠ACR、SCr、BUN、Pi、PTH、ALP及FGF-23水平升高，Ca、klotho和1，25-（OH）2D3水平降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05），且各造模組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞ 0.05）。

2.1 給藥前后腎功能相關(guān)指標(biāo)比較

給藥組大鼠的腎功能相關(guān)指標(biāo)比M組及同組給藥前均明顯降低，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.01），但給藥組間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞ 0.05）。見表1。

表1 給藥前后腎功能相關(guān)指標(biāo)比較（±s）

表1 給藥前后腎功能相關(guān)指標(biāo)比較（±s）

注 與sham組相比，△P＜ 0.05、△△P＜ 0.01；與M組相比，＊P＜ 0.05、＊＊P＜ 0.01；ACR：尿蛋白/尿肌酐；Scr：血肌酐；BUN：血尿素氮

組別 n 時間 ACR（g/gcr） Scr（umol/L） Bun（mmol/L）sham組 8 給藥前 2.21±0.73＊ 59.26±8.87＊＊ 8.39±1.48＊＊給藥后 2.97±0.93＊＊ 56.55±6.01＊＊ 8.54±1.34＊＊M組 6 給藥前 13.46±3.17△ 120.96±40.35△△ 18.89±5.22△△給藥后 23.43±5.87△△ 143.02±20.77△△ 19.29±2.65△△C組 7 給藥前 12.67±2.45△ 121.08±22.16△△ 17.90±4.07△△給藥后 6.82±3.84＊＊ 99.72±15.07＊＊ 13.94±1.87＊＊L組 8 給藥前 12.29±2.84△ 121.08±32.44△△ 17.26±6.04△△給藥后 6.13±3.46＊＊ 99.41±11.81＊＊ 14.11±1.74＊＊H組 7 給藥前 13.18±2.40△ 123.80±27.21△△ 18.34±3.89△△給藥后 6.78±2.72＊＊ 86.62±14.76＊＊ 13.29±1.67＊＊F值 給藥后 50.984 28.343 27.383 P值 給藥后 0.000 0.000 0.000

2.2 給藥前后療效相關(guān)指標(biāo)比較

與M組相比，給藥組大鼠的Pi、PTH及ALP水平降低，Ca水平升高，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.01）。L組與C組大鼠的療效相關(guān)指標(biāo)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞ 0.05）；與C組相比，H組大鼠Ca水平較高，而PTH水平較低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05）。見表2。

表2 給藥前后療效相關(guān)指標(biāo)比較（±s）

表2 給藥前后療效相關(guān)指標(biāo)比較（±s）

注 與sham組相比，△△P ＜ 0.01；與M組相比，＊＊P＜ 0.01；與C組相比，▲P＜ 0.05；Pi：血磷；Ca：血鈣；PTH：甲狀旁腺激素；ALP：堿性磷酸酶

組別 n 時間 Pi（mmol/L） Ca（mmol/L） PTH（pg/ml） ALP（U/L）sham組 8 給藥前 2.37±0.19＊＊ 2.43±0.07 5.80±1.14＊＊ 171.60±24.53＊＊給藥后 2.55±0.34＊＊ 2.47±0.14＊＊ 5.49±0.21＊＊ 173.50±32.29＊＊M組 6 給藥前 3.19±0.27△△ 2.08±0.41△△ 9.59±0.26△△ 230.90±19.02△△給藥后 3.85±0.22△△ 2.11±0.04 13.98±0.42△△ 329.10±34.74△△C組 7 給藥前 3.27±0.34△△ 2.07±0.11 9.26±1.43△△ 231.70±27.93△△給藥后 2.61±0.28＊＊ 2.36±0.08＊＊ 7.45±0.45＊＊ 239.80±30.75＊＊L組 8 給藥前 3.01±0.18△△ 2.11±0.15 9.18±0.39△△ 238.50±27.32△△給藥后 2.60±0.54＊＊ 2.33±0.07＊＊ 7.29±0.78＊＊ 240.00±33.86＊＊H組 7 給藥前 3.15±0.12△△ 2.09±0.28 9.62±0.80△△ 232.00±38.77△△給藥后 2.59±0.57＊＊ 2.54±0.09＊＊▲ 6.90±0.35＊＊▲ 246.20±58.79＊＊F值 給藥后 18.624 33.525 469.657 19.616 P值 給藥后 0.000 0.000 0.000 0.000

2.3 給藥前后機(jī)制相關(guān)指標(biāo)比較

M組大鼠與自身給藥前相比，F(xiàn)GF-23明顯升高、klotho降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05），1，25-（OH）2D3差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞ 0.05）；給藥組大鼠與同組給藥前相比，F(xiàn)GF-23水平下降，1，25-（OH）2D3和klotho水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05）。見表3。

表3 給藥前后機(jī)制相關(guān)指標(biāo)比較（±s）

表3 給藥前后機(jī)制相關(guān)指標(biāo)比較（±s）

注 與sham組相比，△△P ＜ 0.01；與M組相比，＊＊P＜ 0.01；與C組相比，▲P＜ 0.05；FGF-23：成纖維細(xì)胞生長因子23；1，25-（OH）2D3：1，25-二羥維生素D3

組別 n 時間 FGF-23（ng/ml） 1，25-（OH）2D3（ng/ml） klotho（pg/ml）sham組 8 給藥前 35.85±2.87 154.01±7.29＊＊ 4296.20±297.60＊＊給藥后 33.28±2.58＊＊ 168.19±9.92＊＊ 4418.20±243.78＊＊M組 6 給藥前 68.35±4.41△△ 69.29±7.10△△ 2297.70±128.46△△給藥后 87.28±3.77 57.47±13.73△△ 1732.50±200.35△△C組 7 給藥前 61.08±5.10△△ 61.82±4.92△△ 2317.30±136.44△△給藥后 56.07±2.03＊＊ 98.61±23.20＊＊ 1903.20±237.86＊＊L組 8 給藥前 73.30±1.94△△ 57.72±8.74△△ 2358.00±203.38△△給藥后 57.36±2.22＊＊ 100.78±20.11＊＊ 1918.30±280.21＊＊H組 7 給藥前 74.38±5.60△△ 63.96±7.66△△ 2359.00±172.81△△給藥后 51.34±3.30＊＊ 124.85±14.01＊＊▲ 1991.90±295.79＊＊F值 給藥后 462.568 47.589 140.992 P值 給藥后 0.000 0.000 0.000

2.4 腎臟病理變化

2.4.1 HE染色 sham組大鼠腎臟組織未見明顯異常。M組大鼠腎臟組織皮髓質(zhì)分界不清，局部被膜結(jié)締組織增生，大量腎小管上皮細(xì)胞腫脹，較多腎小管擴(kuò)張，形成蛋白管型。腎小球結(jié)構(gòu)紊亂，系膜增生嚴(yán)重。腎間質(zhì)可見大量炎癥細(xì)胞浸潤。給藥組大鼠腎臟HE染色損傷情況相近且輕于M組。見圖1。

圖1 腎臟組織HE染色病理圖片（200×，1∶50μm）

2.4.2 PAS染色 對PAS陽性面積與腎小球總面積的比值的檢測顯示，sham組＜C組≈L組≈H組＜M組。見圖2。

圖2 腎臟組織PAS染色病理圖片（400×，1∶20μm）

2.4.3 透射電鏡 sham組大鼠足細(xì)胞基本正常，偶可見輕度水腫。M組大鼠足細(xì)胞趨于壞死，細(xì)胞核溶解；線粒體嚴(yán)重腫脹，空泡化，嵴斷裂消失；基底膜結(jié)構(gòu)較模糊、疏松，不規(guī)則增厚；足突局部融合或消失。給藥組損傷情況輕于M組。濾過屏障損傷程度：M組＞C組≈L組≈H組＞sham組。見圖3。

圖3 腎臟組織電鏡下圖片（2500×，1∶5.0μm）

2.5 FGF-23半定量分析

FGF-23在腎臟表達(dá)：M組＞C組≈L組＞H組＞sham組。見圖4。

圖4 FGF-23在腎臟組織中的表達(dá)（200×，1∶50 μm）

3 討論

高磷血癥在CRF患者中較常見[10]，會增加血管鈣化和心血管意外風(fēng)險[11]，且血液透析患者還可因嚴(yán)重高磷血癥和繼發(fā)性甲狀旁腺功能亢進(jìn)引起繼發(fā)性腫瘤及鈣化[12]。目前高磷血癥的治療主要為采用藥物抑制腸道吸收磷，常存在療效欠佳、安全性不高或經(jīng)濟(jì)緊張等問題，影響臨床使用，且國內(nèi)缺乏被廣泛認(rèn)可的治療高磷血癥的中成藥。

快胃片的藥物組成為海螵蛸、白礬（煅）、白及、延胡索（醋制）、甘草，海螵蛸作為快胃片的君藥，可雙向調(diào)節(jié)鈣磷代謝紊亂[7-9]。本研究顯示，快胃片聯(lián)合祛毒顆粒可糾正鈣磷代謝紊亂問題，且高劑量快胃片升高Ca的水平更強(qiáng)。祛毒顆粒為郭兆安教授臨床經(jīng)驗組方，既往研究顯示祛毒顆?？山档湍I間質(zhì)纖維化面積、減輕腎小管損傷[13]、減輕腎小球硬化[14]，從而保護(hù)腎功能[15]。本研究再次證明了祛毒顆粒對腎功能的保護(hù)作用。

FGF-23和klotho是繼PTH、1，25-（OH）2D3之后慢性腎臟病礦物質(zhì)及骨代謝紊亂重要的參與因子[16]。FGF-23可通過其共受體α-klotho調(diào)節(jié)腎臟對磷酸酯的重吸收和1，25-（OH）2D3的生成[16]。klotho蛋白具有調(diào)節(jié)鈣磷代謝、調(diào)控細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激與炎癥等作用[17]。有研究發(fā)現(xiàn)血清klotho表達(dá)水平與血鈣、血磷水平呈負(fù)相關(guān)[18]。FGF-23/KL軸與Pi、PTH、1，25-（OH）2D3的水平及CKD后期并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展息息相關(guān)[19]。本研究結(jié)果顯示，快胃片聯(lián)合祛毒顆?？山档虵GF-23、升高1，25-（OH）2D3和klotho，故考慮快胃片聯(lián)合祛毒顆?？赡芡ㄟ^調(diào)節(jié)FGF-23/KL軸調(diào)節(jié)鈣磷代謝紊亂。同時本研究結(jié)果顯示，H組效果優(yōu)于C組，且快胃片升高Ca作用與劑量相關(guān)，但快胃片升高Ca的同時是否會帶來血管鈣化的風(fēng)險尚需更長時間的觀察。