體外透皮遞送SPE 的CMC/CS/Ca2+復(fù)合水凝膠及其抗氧化活性研究

葉君 劉祿瑩 黃卓生 熊犍

（1. 華南理工大學(xué) 制漿造紙工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510640；2. 宜瑞安食品配料有限公司，上海 201600；3. 華南理工大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州 510640）

自由基和身體抗氧化劑的失衡會(huì)導(dǎo)致氧化應(yīng)激反應(yīng)，研究發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激與許多疾病的病因之間具有關(guān)聯(lián)性，這些疾病包括但不限于心血管疾病、神經(jīng)退行性疾病、肝病和癌癥［1-5］。氧化應(yīng)激也是皮膚老化的主要原因，自由基會(huì)減少皮膚中的膠原蛋白和彈性蛋白，導(dǎo)致皮膚松弛和起皺［6］。這些發(fā)現(xiàn)揭示了抗氧化劑的重要性［7］。

大豆肽（SPE）具有多種抗氧化特性，如清除自由基活性、金屬離子螯合活性和抑制脂質(zhì)過氧化［8］，是一種天然的抗氧化劑。由于透皮遞送系統(tǒng)可以避免肝臟和胃腸道“首過效應(yīng)”的影響，維持穩(wěn)定、持續(xù)的藥物血漿濃度，減少給藥頻率，提高藥物的生物利用度，提高患者的依從性，特別適合于嬰兒、老人或不宜口服藥物的病人［9］，因此，在過去的幾十年里，透皮遞送系統(tǒng)成為研究遞送小分子藥物、蛋白質(zhì)、小肽分子和疫苗等的前沿課題［10］。水凝膠具有高度多孔的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，其多孔性允許藥物包封到水凝膠基質(zhì)中，并隨后通過水凝膠網(wǎng)絡(luò)擴(kuò)散［11］。此外，水凝膠是可變形的，有利于它們?cè)诓煌砻婧蛻?yīng)用部位上的固定，可用于透皮遞送系統(tǒng)中［12］。Ladenheim 等［13］的研究表明，含有藥物的水凝膠貼片系統(tǒng)，其透皮滲透性是非密封條件下的3 到4 倍?；诶w維素、殼聚糖和透明質(zhì)酸的水凝膠已被用作透皮貼片給藥的遞送材料［14］，其中羧甲基纖維素（CMC）作為一種廣泛使用的纖維素多糖衍生物，對(duì)皮膚和粘膜具有生物相容性，已被美國(guó)食品和藥物管理局（FDA）批準(zhǔn)用于藥物產(chǎn)品的使用［15］。Park 等［14］制備了基于CMC/2-丙烯酸羥乙酯的pH 響應(yīng)水凝膠，透皮遞送結(jié)果表明該水凝膠增強(qiáng)了柚皮苷的透皮滲透效果，在特應(yīng)性皮炎的治療中具有潛在的應(yīng)用。Xu 等［16］對(duì)兩性淀粉的吸濕保濕性能進(jìn)行了考察，發(fā)現(xiàn)引入季銨陽(yáng)離子基團(tuán)和羧甲基基團(tuán)的兩性淀粉的吸濕性和保濕性能均好于甘油。探索CMC 和陽(yáng)離子淀粉（CS）復(fù)合水凝膠在透皮遞送中的可行性具有重要的科學(xué)意義和巨大的應(yīng)用潛力。

鑒于此，文中通過簡(jiǎn)單的方法制備可用于透皮遞送SPE 的CMC/CS/Ca2+復(fù)合水凝膠，通過掃描電子顯微鏡（SEM）和比表面積測(cè)試（BET）分析復(fù)合水凝膠的形態(tài)結(jié)構(gòu)，通過流變表征其使用時(shí)的力學(xué)性能及結(jié)構(gòu)，探索該復(fù)合水凝膠透皮遞送SPE 的原因，考察經(jīng)釋放后的SPE的抗氧化活性，并對(duì)復(fù)合水凝膠的感官及理化指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定，以評(píng)估其作為透皮遞送載體的安全性。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

CMC（取代度為0.92，數(shù)均相對(duì)分子質(zhì)量為2.17×105，型號(hào)FVH9，食品級(jí)），常熟威怡科技有限公司產(chǎn)品；CS（取代度為0.028~0.030，重均相對(duì)分子質(zhì)量為50 000，型號(hào)CATO），宜瑞安食品配料有限公司產(chǎn)品；NaOH、HCl、NaCl、乙醇、無水CaCl2、KBr，均為AR 級(jí)，廣州化學(xué)試劑廠產(chǎn)品；SPE（A 型），廣東華泰生物科技有限公司產(chǎn)品；牛血清白蛋白（BSA，平均相對(duì)分子質(zhì)量為67 000）、2，2′-聯(lián)氮-雙-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）、2，2-聯(lián)苯基-1-苦基肼基（DPPH），阿拉丁化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；新鮮小乳豬皮，光圈生物科技（山東）有限公司產(chǎn)品。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 CMC/CS/Ca2+復(fù)合水凝膠及負(fù)載SPE 的復(fù)合水凝膠的制備

稱取0.80 g CMC 溶于10 mL 去離子水中，再按表1 所示用量稱取CS 溶于10 mL 去離子水中，在95 ℃下糊化30 min，并不斷攪拌。按表1稱取一定量的CaCl2加入到CMC 溶液中并與糊化的CS混合，在45 ℃下攪拌2 h，得到CMC/CS/Ca2+混合體系。倒入24孔板中，靜置消除氣泡后在-20 ℃下冷凍20 h，再于室溫下解凍4 h，如此循環(huán)3次，得到一系列CMC/CS/Ca2+復(fù)合水凝膠，分別命名為CC1、CC2和CC3。

表1 復(fù)合水凝膠各成分的用量Table 1 Dosages of the components of composite hydrogels

按表1 將不同質(zhì)量的SPE 緩慢加入上述所制得的CMC/CS/Ca2+混合體系中，按上述凍融循環(huán)條件循環(huán)3 次制備負(fù)載SPE 的CMC/CS/Ca2+復(fù)合水凝膠，樣品編號(hào)分別為CCL1、CCL2、CCL3、CCL1-3、CCL1-4和CCL1-6。

1.3 表征方法

采用德國(guó)Carl Zeiss 公司產(chǎn)EVO 18 型掃描電子顯微鏡來觀察冷凍干燥復(fù)合水凝膠的截面形貌，加速電壓為5.0 kV。采用上海儀電物理光學(xué)儀器有限公司產(chǎn)WBL-820 型比表面積及孔隙度分析儀獲得干燥水凝膠的比表面積和孔徑分布，樣品在80 ℃下脫氣4 h 后使用。采用德國(guó)Mütek 公司產(chǎn)PCD-03 型顆粒電荷分析儀分析0.1 mg/mL樣品懸浮液（溶劑為生理鹽水）的電荷需求量。采用德國(guó)Bruker 公司產(chǎn)TENSOR型傅里葉變換紅外光譜儀進(jìn)行FT-IR測(cè)試，KBr 壓片法，分辨率為4 cm-1，掃描范圍為400~4 000 cm-1。采用荷蘭PANalytical公司產(chǎn)X′pert Pow?der型多位自動(dòng)進(jìn)樣X射線衍射儀分析樣品的結(jié)晶性能，Cu 靶，Kα射線，管壓為40 kV，管流為40 mA，掃描速度為12 °/min，掃描范圍為5°~60°。采用德國(guó)哈克公司產(chǎn)MARS60型旋轉(zhuǎn)流變儀分析樣品的流變性能，夾具采用60 mm 平行板，間距為500 μm，掃描溫度為25 ℃，應(yīng)變?yōu)?.01，角頻率掃描范圍為1~100 rad/s。采用美國(guó)Biotek 公司產(chǎn)Synergy Neo2型多功能酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度。

溶脹實(shí)驗(yàn)參照文獻(xiàn)［17］，將干燥的復(fù)合水凝膠樣品浸泡在（37.0±0.5） ℃的生理鹽水中進(jìn)行溶脹實(shí)驗(yàn)。溶脹分?jǐn)?shù)由式（1）計(jì)算：

式中，SR為溶脹分?jǐn)?shù)（%），ms為溶脹復(fù)合水凝膠的質(zhì)量（g），md為干燥復(fù)合水凝膠的初始質(zhì)量（g）。

體外釋放實(shí)驗(yàn)在（37.0±0.5） ℃下，以不同濃度的BSA 生理鹽水溶液的吸光度作標(biāo)準(zhǔn)曲線。取520 mg的復(fù)合水凝膠在相同溫度下的生理鹽水中參照文獻(xiàn)［14］取樣，并采用酶標(biāo)儀在562 nm處測(cè)定其吸光度。SPE的累積釋放量由式（2）計(jì)算：

式中，ρi為第i個(gè)時(shí)間點(diǎn)所取樣品中SPE的質(zhì)量濃度（mg/mL），Vi為取樣體積（mL），m為520 mg 復(fù)合水凝膠負(fù)載的SPE 質(zhì)量（mg），Q為n時(shí)間點(diǎn)的SPE 累積釋放量（%）。

抗氧化活性測(cè)試1）參照文獻(xiàn)［18］，由式（3）計(jì)算DPPH自由基的清除率：

式中，A0為1.5 mL 95%無水乙醇與0.5 mL DPPH溶液的混合溶液的吸光度，A1為1.5 mL 0.1 mg/mL 樣品溶液與0.5 mL 95%無水乙醇的混合溶液的吸光度，A2為1.5 mL 0.1 mg/mL 樣品溶液與0.5 mL DPPH 溶液的混合溶液的吸光度。所有溶液的吸光度采用酶標(biāo)儀在517 nm處測(cè)定。

2）參照文獻(xiàn)［19］，由式（4）計(jì)算ABTS自由基的清除率：

式中，A′0為1 mL PBS與1 mL ABTS 測(cè)試液的混合溶液的吸光度，A′1為1 mL 0.1 mg/mL 樣品溶液與1 mL PBS 的混合溶液的吸光度，A′2為1 mL 0.1 mg/mL 樣品溶液與1 mL ABTS 測(cè)試液的混合溶液的吸光度。所有溶液的吸光度采用酶標(biāo)儀在734 nm處測(cè)定。

透皮遞送性能測(cè)試標(biāo)準(zhǔn)曲線與體外釋放實(shí)驗(yàn)中的一致。取180 mg 的復(fù)合水凝膠置于Franz 擴(kuò)散池中，在（37.0±0.5） ℃生理鹽水中參照文獻(xiàn)［20］取樣，并采用酶標(biāo)儀在562 nm處測(cè)定其吸光度，相關(guān)過程如圖1 所示。n時(shí)間點(diǎn)的單位面積累積滲透量qn（mg/cm2）由式（5）計(jì)算：

圖1 Franz擴(kuò)散池體外透皮遞送SPE的過程Fig.1 Process of in vitro transdermal delivery of SPE in Franz diffusion cell

式中，S為有效皮膚滲透面積（取3.14 cm2）

SPE 累積滲透百分比為圖1 所示SPE 的累積釋放質(zhì)量（mg）與總累積滲透質(zhì)量（mg）的比值。

1.4 SPE/CMC/CS/Ca2+復(fù)合水凝膠的感官和理化性質(zhì)

復(fù)合水凝膠的外觀、pH 值、耐熱性和耐寒性等按QB/T 2872—2017進(jìn)行測(cè)定［21］。

保濕性測(cè)試參照文獻(xiàn)［22］將復(fù)合水凝膠置于25 ℃的烘箱中，每5 min稱量一次，直至25 min。保濕率H由式（6）計(jì)算：

式中，mt為樣品在烘箱中某個(gè)時(shí)刻的質(zhì)量（g），m0為樣品的初始質(zhì)量（g）。

含水率測(cè)試參照文獻(xiàn)［23］測(cè)試復(fù)合水凝膠的含水率。含水率W由式（7）計(jì)算：

式中，m2為溶脹平衡時(shí)樣品的質(zhì)量（g），m1為樣品干燥至恒重時(shí)的質(zhì)量（g）。

皮膚刺激測(cè)試參照文獻(xiàn)［24］將CCL1、CCL2、CCL3 敷在手背上30 min，再用溫水洗去，仔細(xì)觀察皮膚有無充血、水腫、出血、糜爛及潰爛等現(xiàn)象。

數(shù)據(jù)分析所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用OriginPro 2021 處理，并使用R 軟件分析各組結(jié)果間的顯著性差異水平（P<0.05）。

2 結(jié)果與討論

2.1 SEM和BET結(jié)果與分析

圖2（a）為所制備樣品的實(shí)物圖，可以看出，樣品是具有穩(wěn)定形狀的復(fù)合水凝膠。圖2（b）為復(fù)合水凝膠截面的SEM形貌圖，可以看出，所有樣品顯示出蜂窩狀的三維孔洞結(jié)構(gòu)，說明CMC 和CS 經(jīng)冷凍循環(huán)后形成了復(fù)合水凝膠［25］。隨著CS含量的增加，相應(yīng)復(fù)合水凝膠的孔徑減小。與CC1-CC3相比，負(fù)載SPE后的CCL1、CCL2、CCL3孔洞變得小而密。

由BET 測(cè) 得 的CC1、CC2、CC3 以 及CCL1、CCL2、CCL3 的平均孔直徑分別為2.56、2.62、2.60、2.64、2.65、2.68 nm，相應(yīng)的孔徑分布如圖2（c）所示。由圖2（c）可知：負(fù)載SPE 后的CCL1、CCL2、CCL3的累積孔體積均大于CC1、CC2、CC3，且在微孔區(qū)的差距最大，到中孔區(qū)其差距減小，當(dāng)孔徑在4 nm左右時(shí)累積孔體積趨于一致［26］。這表明負(fù)載SPE會(huì)影響復(fù)合水凝膠的孔洞大小及其分布。

圖2 復(fù)合水凝膠的實(shí)物照片、截面SEM圖及孔徑分布Fig.2 Photos， SEM images of cross-section and pore size dis?tributions of composite hydrogels

2.2 PCD結(jié)果與分析

復(fù)合水凝膠的顆粒電荷分析（PCD）結(jié)果如圖3所示?？梢钥闯觯械膹?fù)合水凝膠及SPE均帶負(fù)電荷，且隨著添加CS含量的增加，陽(yáng)離子需求量減少，CC1、CC2、CC3的陽(yáng)離子需求量分別為2.02、1.78和1.63 mol/L，這表明雖然CS中的季銨離子與CMC 中的—COO-發(fā)生了作用，但陽(yáng)離子需求量并沒有按照CS添加量的比例降低。這可能是因?yàn)槟臼淼矸鄣闹ф湻浅ＸS富，發(fā)生取代的位置較為復(fù)雜，因此僅有部分季銨離子與CMC發(fā)生了靜電作用。另一方面，在實(shí)驗(yàn)中觀察到，當(dāng)不添加Ca2+時(shí)，所制備的樣品為啫喱狀，而不是具有穩(wěn)定形狀的復(fù)合水凝膠，說明Ca2+也與CMC 中的—COO-形成了離子鍵［27］（如圖1所示），從而形成了穩(wěn)定的復(fù)合水凝膠，同時(shí)降低了復(fù)合水凝膠的陽(yáng)離子需求量。

圖3 SPE和復(fù)合水凝膠的陽(yáng)離子需求量Fig.3 Cation demands of SPE and composite hydrogels

當(dāng)負(fù)載SPE 后，盡管SPE 呈負(fù)電性，但CCL1的陽(yáng)離子需求量卻降低了。在保持CS 的量恒定而改變Ca2+濃度時(shí)，復(fù)合水凝膠的陽(yáng)離子需求量也隨著Ca2+濃度的升高而降低（CCL1：1.69 mol/L；CCL1-3：1.76 mol/L；CCL1-4：1.70 mol/L；CCL1-6：1.63 mol/L），但其降低幅度與Ca2+濃度的增加量并不成正比，因此，Ca2+也有可能與SPE 酰胺鍵產(chǎn)生相互作用［28］。

2.3 FT-IR結(jié)果與分析

所制備的復(fù)合水凝膠的FT-IR譜圖如圖4所示?？梢钥闯觯c純CMC 和純CS 譜帶相比，所有復(fù)合水凝膠的紅外圖譜沒有產(chǎn)生新的吸收峰，說明CMC與CS 之間沒有產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)，但它們的吸收峰發(fā)生了一些變化。處于1 462 cm-1的譜帶歸屬于CS 的甲基彎曲振動(dòng)［29］，在復(fù)合水凝膠譜帶中消失或減弱為小的肩峰；CS分子中位于929 cm-1處的環(huán)氧基的特征吸收峰以及位于690~880 cm-1處的NR4+骨架振動(dòng)譜帶在CC1、CC2、CC3 中變?nèi)酰@些均表明季銨離子與CMC 中的—COO-發(fā)生了相互作用［30］。CS中位于1 243、1 082 cm-1處的吸收峰分別歸屬于側(cè)鏈—CH2OH 振動(dòng)以及C—O—H 帶振動(dòng)［31］，CMC 中位于1 328 cm-1處的吸收峰歸屬于—OH 的彎曲振動(dòng)，它們?cè)谛纬蓮?fù)合水凝膠時(shí)均變?nèi)?，說明CS 中的—OH 與CMC 中的—OH 發(fā)生了氫鍵作用［32］。CMC 在1 603 cm-1處的—COO-反對(duì)稱伸縮振動(dòng)峰在CC1、CC2、CC3 中變強(qiáng)，而1 418 cm-1處的—COO-對(duì)稱伸縮振動(dòng)峰變?nèi)?，這表明CMC 中的—COO-與Ca2+形成了離子鍵［27，33］。因此，CMC與CS及Ca2+之間產(chǎn)生了化學(xué)和物理交聯(lián)作用，從而形成了穩(wěn)定的復(fù)合水凝膠，如圖1所示。

圖4 水凝膠及CMC、SPE粉末的FT-IR譜圖Fig.4 FT-IR spectra of the hydrogels， CMC and SPE powder

當(dāng)負(fù)載SPE后，CCL1、CCL2、CCL3出現(xiàn)了SPE位于1 600~1 700 cm-1（酰胺Ⅰ鍵）以及1 500~1 600 cm-1（酰胺Ⅱ鍵）的特征峰，這明顯地有別于CC1、CC2、CC3在1 603 cm-1處的尖峰，表明SPE已成功負(fù)載于CCL1、CCL2、CCL3中。但這兩個(gè)酰胺鍵的特征峰較SPE向低波數(shù)位移，且峰強(qiáng)度減弱，表明SPE中的酰胺鍵與Ca2+之間發(fā)生了作用［28］。進(jìn)而，929 cm-1處的環(huán)氧振動(dòng)峰及690~880 cm-1譜帶在CCL1、CCL2、CCL3 中較在CC1、CC2、CC3 中進(jìn)一步減弱，表明當(dāng)負(fù)載SPE 后，SPE 中的—COO-不僅與CS發(fā)生了作用，而且與Ca2+形成了離子鍵［30］。

2.4 流變學(xué)結(jié)果與分析

從圖5 可以看出：CCL1、CCL2、CCL3 的儲(chǔ)能模量G′都大于損耗模量G″，且隨角頻率的增大，儲(chǔ)能模量和損耗模量的差值也增大，其中CCL2 表現(xiàn)得最為明顯，說明復(fù)合水凝膠內(nèi)部的交聯(lián)程度是不同的；所有復(fù)合水凝膠的損耗模量在該角頻率范圍內(nèi)基本上保持恒定，這是典型的弱凝膠的特征［34］。這些具有彈性的復(fù)合水凝膠可以滿足透皮遞送過程中力學(xué)強(qiáng)度的需要。對(duì)比圖5 和圖6 可以看出，與CC1、CC2、CC3 的儲(chǔ)能模量相比，復(fù)合水凝膠負(fù)載SPE后儲(chǔ)能模量降低，這是因?yàn)樵谛纬赡z的過程中，呈現(xiàn)負(fù)電性的SPE 中的—COO-可與Ca2+結(jié)合，減弱了Ca2+與CMC 鏈上的—COO-的作用，從而破壞了穩(wěn)定的復(fù)合水凝膠結(jié)構(gòu)；但復(fù)合水凝膠儲(chǔ)能模量的降低并不與SPE 的負(fù)載量成比例，說明SPE 中的—NH2有與CS 鏈上的—OH 形成氫鍵的可能［35］。

圖5 CCL1、CCL2、CCL3的角頻率掃描曲線Fig.5 Frequency sweep curves of CCL1， CCL2 and CCL3

圖6 CC1、CC2、CC3的角頻率掃描曲線Fig.6 Frequency sweep curves of CC1， CC2 and CC3

2.5 溶脹行為、體外釋放和抗氧化活性

CCL1、CCL2、CCL3 在生理鹽水中的溶脹分?jǐn)?shù)與時(shí)間的關(guān)系如圖7 所示?？梢钥闯觯珻CL1、CCL2、CCL3 具有優(yōu)異的溶脹性能，在溶脹的前120 min 已經(jīng)達(dá)到或接近平衡溶脹，在720 min 時(shí)其平衡溶脹分?jǐn)?shù)分別達(dá)到636.23%，583.89% 和634.53%，且隨時(shí)間的延長(zhǎng)它們的溶脹趨勢(shì)均相同，但溶脹速度略有不同，這決定著水凝膠對(duì)負(fù)載藥物的釋放動(dòng)力學(xué)模式［39］。在透皮遞送過程中，水凝膠優(yōu)異的溶脹能力有助于提高所遞送藥物的擴(kuò)散性［13］。水凝膠的孔洞大小及其分布、水凝膠的彈性決定了其溶脹速度和溶脹程度［40-41］。CCL1、CCL2、CCL3的中孔孔徑差別不大，而CCL1的儲(chǔ)能模量最小，因此它的溶脹速度是最快的，而儲(chǔ)能模量最大的CCL2，其溶脹速度最慢。

圖7 復(fù)合水凝膠的溶脹行為Fig.7 Swelling behavior of composite hydrogels

由BSA的標(biāo)準(zhǔn)曲線可得體外釋放和透皮滲透的SPE 的量。CCL1、CCL2、CCL3 的SPE 釋放曲線如圖8 所示?？梢钥闯?，3 種復(fù)合水凝膠的釋放行為均依賴于其溶脹行為，為溶脹控制的釋放模式［39］，且釋放趨勢(shì)相同，在120 min 內(nèi)SPE 快速釋放，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)釋放速度變慢，在480 min時(shí)，CCL1、CCL2、CCL3的累積釋放量均大于61.87%。

圖8 復(fù)合水凝膠的體外釋放Fig.8 In vitro release of composite hydrogels

圖9為CCL1、CCL2、CCL3 的SPE 透皮遞送實(shí)驗(yàn)結(jié)果?？梢钥闯?，SPE 的透皮遞送趨勢(shì)與其體外釋放趨勢(shì)一致，在初始的120 min內(nèi)SPE 快速透過，隨后趨于平穩(wěn)；平衡時(shí)，CCL1、CCL2、CCL3 中SPE 的單位面積累積滲透量分別為0.55、0.70 和0.60 mg/cm2，累積滲透百分比分別為84.13%、92.93% 和92.57%。 該 結(jié) 果 表 明， 從CCL1、CCL2、CCL3 中釋放出來的SPE 可穿過皮膚的真皮層，證明該復(fù)合水凝膠是一種有效的肽類透皮遞送系統(tǒng)載體。SPE是一種親水性的分子，由于角質(zhì)層是由部分死亡的、干燥的、角質(zhì)化的細(xì)胞組成，且由脂質(zhì)粘合的皮膚層次結(jié)構(gòu)，親水性的分子穿過皮膚屏障的傳遞極具挑戰(zhàn)性［42］。圖7的結(jié)果顯示，該復(fù)合水凝膠載體對(duì)水具有高度親和性，在透皮遞送過程中易于吸附周圍環(huán)境中的水分，從而通過濃度差提高SPE 這類水溶性肽在皮膚角質(zhì)層中的滲透性［13］，為達(dá)到最佳透皮遞送效果提供必要條件。

圖9 復(fù)合水凝膠的透皮遞送Fig.9 Transdermal delivery of composite hydrogels

圖10 所示為從CCL1、CCL2、CCL3 中釋放出來的SPE的抗氧化活性?？梢钥闯觯珻CL1、CCL2、CCL3的DPPH自由基清除率均大于40.01%，ABTS自由基清除率也均大于68.43%，且當(dāng)CMC和CS的質(zhì)量比為1∶1.6時(shí)，復(fù)合水凝膠的DPPH自由基清除率和ABTS 自由基清除率均達(dá)到最大。相比于一些現(xiàn)有成果（如表2所示），經(jīng)這些復(fù)合水凝膠釋放的SPE具有廣譜的抗氧化活性，說明這些復(fù)合水凝膠有希望在透皮遞送肽及蛋白質(zhì)類藥物上得以應(yīng)用，此外在皮膚抗氧化護(hù)理方面也具有應(yīng)用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)利益。

圖10 復(fù)合水凝膠的抗氧化活性Fig.10 Antioxidant activity of composite hydrogels

表2 最大DPPH自由基和ABTS自由基清除率的比較Table 2 Comparison of the maximum scavenging rates of DPPH and ABTS free radicals

2.6 感官和理化性質(zhì)

由于透皮遞送需要接觸人體皮膚，復(fù)合水凝膠在致敏性及毒性等方面必須符合QB/T 2872—2017的規(guī)定［21］。CCL1、CCL2、CCL3 在室溫下的pH 值分別為7.33±0.02，7.06±0.01 及7.00±0.02。經(jīng)-8 ℃下冷凍24 h、40 ℃下加熱24 h，再恢復(fù)至室溫時(shí)，它們的外觀均無明顯變化（見圖11（a））。這些性質(zhì)符合QB/T 2872—2017的要求。

圖11 復(fù)合水凝膠的感官及理化指標(biāo)Fig.11 Sensory and physicochemical indicators of composite hydrogels

CCL1、CCL2、CCL3的含水率分別為97.12%、95.63%及96.82%，其中當(dāng)CMC 與CS 的質(zhì)量比為1∶1.5時(shí)，復(fù)合水凝膠的含水率最大。由圖11（b）可知，這些復(fù)合水凝膠的保濕率先隨時(shí)間的增加而降低，5 min后保濕率趨于平衡，在25 min時(shí)所有復(fù)合水凝膠的保濕率均保持在97.34%以上，表明CCL1、CCL2、CCL3具有較好的吸水性能和保濕性能。這不僅有助于SPE透過角質(zhì)層，而且有望在皮膚護(hù)理中得到應(yīng)用。

通過圖11（c）可以觀察到，手背皮膚在清除掉CCL1、CCL2、CCL3 后未發(fā)現(xiàn)有充血、水腫、出血、糜爛及潰瘍等不良反應(yīng)，說明CCL1、CCL2、CCL3溫和且無刺激性［24］。

3 結(jié)論

文中僅以水為介質(zhì)，通過凍融循環(huán)法制備了一系列質(zhì)量比不同的CMC/CS/Ca2+復(fù)合水凝膠，作為一種有效透皮遞送SPE 的載體。SEM、BET 和FTIR 結(jié)果證實(shí)，SPE、CMC、CS 及Ca2+之間產(chǎn)生了化學(xué)和物理交聯(lián)作用，形成具有孔洞結(jié)構(gòu)的網(wǎng)絡(luò)復(fù)合水凝膠，所有復(fù)合水凝膠的含水率均高于95.63%，且25 min 后其保濕率仍保持在97.34%以上，這有助于提高SPE這類水溶性肽在皮膚角質(zhì)層中的滲透性。體外釋放結(jié)果表明，復(fù)合水凝膠在前120 min內(nèi)呈直線釋放，SPE 的累積釋放量超過48.66%；此外，從復(fù)合水凝膠中釋放出來的SPE仍具有較高的抗氧化活性。透皮遞送實(shí)驗(yàn)表明，經(jīng)釋放的SPE可穿過皮膚的真皮層，在720 min 時(shí)，CCL1、CCL2、CCL3 的累積滲透百分比分別達(dá)84.13%、92.93%和92.57%；復(fù)合水凝膠的感官及理化指標(biāo)表明，該復(fù)合水凝膠符合QB/T 2872—2017的規(guī)定。研究結(jié)果表明，CMC/CS/Ca2+復(fù)合水凝膠在透皮遞送肽及蛋白質(zhì)類藥物、皮膚抗氧化護(hù)理方面具有巨大的應(yīng)用潛力。