4種狂犬病病毒ELISA抗體檢測試劑盒的評價

高 露，劉婷芳，蔡冬冬，李盛瓊，尹 杰，楊天俊，張 亮，黃雅琳，袁東波，陽愛國，侯 巍

（1.四川省動物疫病預(yù)防控制中心，四川成都 610041；2.軍事醫(yī)學(xué)研究院軍事獸醫(yī)研究所，吉林長春 130122；3.富順縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，四川富順 643200）

狂犬病（rabies）是由狂犬病病毒（rabies virus，RV）感染引起的人獸共患烈性傳染病，臨床表現(xiàn)為特異性恐風(fēng)、恐水以及咽肌痙攣、進(jìn)行性癱瘓等，病死率高達(dá)100%，給公眾生命健康帶來嚴(yán)重威脅。我國報告的狂犬病發(fā)病數(shù)僅次于印度，居世界第二位[1]。分析我國狂犬病患者發(fā)現(xiàn)，經(jīng)犬咬傷感染的達(dá)90%以上[2]?？袢∧壳吧袩o有效治療手段，疫苗免疫是預(yù)防該病的唯一途徑[3]，因此對犬進(jìn)行疫苗免疫能有效筑牢狂犬病防控的第一道防線。

世界動物衛(wèi)生組織（WOAH）和世界衛(wèi)生組織（WHO）推薦，當(dāng)血清中RV中和抗體效價大于0.50 IU/mL時，疫苗免疫才視為成功，能夠產(chǎn)生免疫保護(hù)效力。目前，WOAH和WHO均推薦的狂犬病血清學(xué)檢測方法只有兩種，分別是熒光抗體病毒中和試驗(yàn)（fluorescent antibody virus neutralization test，F(xiàn)AVN）和快速熒光灶抑制試驗(yàn)（rapid fluorescent focus inhibition test，RFFIT）。這兩種方法均能檢測血清樣品中的RV中和抗體效價，可有效評估疫苗免疫效力，但均需高度可控的環(huán)境用于細(xì)胞培養(yǎng)和病毒復(fù)制，且需耗時48 h[4]。因此，需要更快速、常規(guī)的技術(shù)替代這些試驗(yàn)。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）目前在很多感染性疾病的血清學(xué)診斷中應(yīng)用較廣泛，其操作簡便，也不需要生物安全高級別實(shí)驗(yàn)室[5]。此外，ELISA對野外收集的因溶血有細(xì)胞毒性，對血清中和試驗(yàn)結(jié)果有影響的樣品同樣有效[6]。根據(jù)WOAH《陸生動物診斷試驗(yàn)與疫苗手冊》，ELISA 是評估免疫效果的最佳方法之一。目前國內(nèi)常用商品化ELISA試劑盒檢測犬RV疫苗免疫后抗體，國外也有經(jīng)WOAH評估后推薦的ELISA試劑盒，用于犬貓免疫后血清學(xué)檢測。為了解國產(chǎn)ELISA抗體檢測試劑盒的性能，本研究選擇了4種國產(chǎn)試劑盒，分別檢測463例犬血清樣本，以血清學(xué)檢測方法金標(biāo)準(zhǔn)FAVN為對照，分析比較這幾種試劑盒的診斷敏感性、診斷特異性、符合率等，以期為犬RV疫苗免疫效力評價時選用更好的試劑盒提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 血清 犬血清共計463份，來自軍事醫(yī)學(xué)研究院軍事獸醫(yī)研究所。樣品已通過FAVN檢測RV中和抗體效價，根據(jù)不同抗體效價范圍分為5組（表1）。從5組血清中，每組隨機(jī)選擇2份，共10份血清，用于重復(fù)性試驗(yàn)。

表1 不同中和抗體效價范圍的血清分組

1.1.2 ELISA抗體檢測試劑盒 從四川省多地動物疫病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)常用的RV ELISA抗體檢測試劑盒中，選擇4種國產(chǎn)品牌試劑盒進(jìn)行評估，分別編號為A試劑盒（批號202110003A）、B試劑盒（批號RV20211008E）、C試劑盒（批號20210708）和D試劑盒（批號20210817）。

1.1.3 主要儀器設(shè)備 酶標(biāo)儀：日本BIO-RAD公司產(chǎn)品，型號iMarkTM；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海齊欣科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品，型號DGX-9243B；移液器：德國Brand公司產(chǎn)品，型號Transferpette-S。

1.2 方法

1.2.1 ELISA抗體檢測 用4種ELISA抗體檢測試劑盒檢測463份樣品（陰性163份、陽性300份），嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行試驗(yàn)以及結(jié)果判定。

1.2.2 性能指標(biāo)測定 利用四格表法（表2）統(tǒng)計比較不同品牌試劑盒和FAVN的檢測結(jié)果，用SPSS等軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，通過Kappa檢驗(yàn)和配對卡方檢驗(yàn)（McNemar檢驗(yàn)），評估ELISA與FAVN檢測的一致性和差異性，并計算ELISA試劑盒的診斷敏感性、診斷特異性和符合率。Kappa檢驗(yàn)評定標(biāo)準(zhǔn)：Kappa系數(shù)＜0，一致性程度極差；0～0.20，微弱；0.21～0.40，弱；0.41～0.60，中度；0.61～0.80，顯著（或高度一致）；0.81～1.00，極佳。McNemar檢驗(yàn)評定標(biāo)準(zhǔn)：P＜0.05為差異顯著，P＞0.05差異不顯著。診斷敏感性、診斷特異性和符合率分別按公式計算。

1.2.3 重復(fù)性測定 對用于重復(fù)性試驗(yàn)的10份血清，分別用4種ELISA抗體檢測試劑盒檢測。每種試劑盒批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)選擇1個板檢測，批間重復(fù)性試驗(yàn)選擇3個板檢測。每份血清每個板重復(fù)3孔。計算每種試劑盒的批內(nèi)變異系數(shù)和批間變異系數(shù)，評估試劑盒的重復(fù)性。

1.2.4 試劑盒參數(shù)比較 對4種試劑盒的使用范圍、樣品稀釋倍數(shù)、孵育與顯色時間、判定標(biāo)準(zhǔn)等參數(shù)進(jìn)行比較，考察試劑盒的可操作性。

2 結(jié)果與分析

2.1 一致性檢驗(yàn)與差異性分析

使用4種ELISA試劑盒檢測463份血清，與FAVN比較結(jié)果見表3。

表3 4種ELISA試劑盒與FAVN檢測結(jié)果四格表統(tǒng)計 單位：份

4種ELISA試劑盒的一致性檢驗(yàn)與差異性分析結(jié)果（表4）顯示：4種試劑盒Kappa系數(shù)處于0.21～0.40范圍內(nèi)。根據(jù)Kappa檢驗(yàn)評定標(biāo)準(zhǔn)，判定4種試劑盒與FAVN一致性程度均為弱。McNemar檢驗(yàn)A和B試劑盒的P值大于0.05，與FAVN結(jié)果的差異不顯著；C和D試劑盒P值小于0.05，差異顯著?？梢夾、B試劑盒與FAVN的差異性小于C、D試劑盒。

表4 4種ELISA試劑盒的一致性檢驗(yàn)與差異性分析結(jié)果

2.2 檢測性能指標(biāo)

計算得到的4種試劑盒診斷敏感性、診斷特異性和符合率數(shù)據(jù)見表5。在診斷敏感性方面，D試劑盒更好，為96.3%，其他3種試劑盒差異較小，診斷敏感性排序?yàn)镈＞C＞A＞B。診斷特異性方面，各試劑盒診斷特異性普遍不高，為29.5%～57.7%，其中B試劑盒最高，各試劑盒診斷特異性排序?yàn)锽＞A＞C＞D。4種試劑盒符合率相當(dāng)，為71.3%～72.8%，符合率排序?yàn)镈＞C＞A/B。

表5 4種ELISA試劑盒檢測結(jié)果比較 單位：%

2.3 重復(fù)性試驗(yàn)

從表6可知：批內(nèi)變異系數(shù)均值，A試劑盒最小，B試劑盒均值大于5%，10個樣品批內(nèi)變異系數(shù)均值排序?yàn)锳＜C＜D＜B；批間變異系數(shù)均值，C試劑盒最小，A、B、D試劑盒均大于10%，其中B試劑盒大于20%，說明這些試劑盒批間穩(wěn)定性普遍較差，批間變異系數(shù)均值排序?yàn)镃＜A＜D＜B。因變異系數(shù)越小，重復(fù)性越好，可見A、C試劑盒的重復(fù)性好于D試劑盒，而B試劑盒效果最不理想。

表6 試劑盒批內(nèi)和批間變異系數(shù) 單位：%

2.4 不同中和抗體效價范圍血清符合率

從每組中和抗體效價范圍血清檢測的符合率（表7）可知：第2組（0.10≤X＜0.50）符合率最低，第3組（0.50≤X＜1.00）稍高，這兩組FAVN效價均處于0.50 IU/mL這一臨界值附近；其他組中，除第1組（X＜0.10）D試劑盒出現(xiàn)低符合率（29%）外，符合率普遍較高。

表7 4種試劑盒檢測不同中和抗體效價范圍血清的符合率 單位：%

2.5 試劑盒參數(shù)比較

將4種國產(chǎn)試劑盒的使用范圍、樣品稀釋倍數(shù)、孵育與顯色時間等參數(shù)進(jìn)行比較。結(jié)果（表8）顯示：4種試劑盒均為間接法，其中C試劑盒樣品稀釋度低，需要量多，可有助于提高靈敏度；D試劑盒雖然孵育時間較長，但其可定性或定量檢測，判定標(biāo)準(zhǔn)分為陽性、弱陽、陰性3個等級，結(jié)果判定方式較精確。

表8 試劑盒參數(shù)比較結(jié)果

3 討論

四川省是我國狂犬病高發(fā)省份之一，做好狂犬病的預(yù)防尤為重要。為犬注射疫苗是預(yù)防狂犬病的有效策略，因?yàn)橐呙绠a(chǎn)生的抗體能有力抵抗RV。免疫后抗體監(jiān)測有助于評估疫苗免疫效力，也可用于分析抗體消長規(guī)律，為制定疫苗免疫程序提供輔助。商品化ELISA試劑盒操作簡便、快速，適用于在基層開展抗體監(jiān)測。目前國內(nèi)有報道[7-9]將狂犬病ELISA試劑盒與FAVN檢測方法進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)兩者符合率較高，但是比對樣品數(shù)量偏少。本試驗(yàn)擴(kuò)大了樣品數(shù)量，用463份已知RV抗體效價的犬血清科學(xué)評估了4種國產(chǎn)狂犬病ELISA試劑盒性能參數(shù)，為試驗(yàn)提供了有力的數(shù)據(jù)支持。

通過試驗(yàn)結(jié)果可知，試劑盒診斷敏感性為78.7%～96.3%，診斷特異性較低，為29.5%～57.7%。羅靜霞等[10]將間接ELISA法與RFFIT比較檢測人群RV免疫抗體，發(fā)現(xiàn)兩者陽性符合率為85.30%，陰性符合率為52.94%，與本試驗(yàn)敏感性和特異性的結(jié)果接近。診斷敏感性越高的試劑盒，易出現(xiàn)假陽性，診斷特異性趨于更低，如試驗(yàn)中的D試劑盒診斷敏感性最高，診斷特異性最低，但總體符合率4種試劑盒差別不大，為71.3%～72.8%。國外有研究[5]發(fā)現(xiàn)ELISA試劑盒測試多血清樣本與FAVN的符合率為86.2%，提示國產(chǎn)試劑盒檢測技術(shù)仍有提升空間。本試驗(yàn)中的D試劑盒雖然敏感性更高，但檢測低中和抗體效價血清（＜0.10 IU/mL）符合率低，特異性差，容易將陰性樣品判定為陽性，不利于免疫后抗體監(jiān)測；B試劑盒敏感性和穩(wěn)定性均不理想；C試劑盒敏感性次于D試劑盒，但特異性較好，且重復(fù)性表現(xiàn)更好，因此認(rèn)為C試劑盒更能滿足免疫后抗體檢測需求；A試劑盒敏感性較好，特異性、重復(fù)性和差異性也表現(xiàn)不錯，因此也可作為臨床選用的候選試劑盒。

相比金標(biāo)準(zhǔn)檢測方法FAVN，國產(chǎn)狂犬病 ELISA抗體檢測試劑盒符合率不夠高，特異性低，假陽性高。一些制約因素可能影響了狂犬病ELISA試劑盒檢測的準(zhǔn)確性，如包被抗原質(zhì)量、非中和抗體結(jié)合物干擾等。FAVN方法采用固定病毒稀釋待檢血清的辦法，將固定濃度的病毒和不同稀釋度的待檢血清中和，經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)、熒光染色等步驟后判定結(jié)果，檢測的是血清中和抗體，而間接ELISA檢測的是與包被抗原結(jié)合的“結(jié)合抗體”，有些“結(jié)合抗體”不一定是中和抗體[11]，這可能會增加ELISA結(jié)果的假陽性率。其次是方法的轉(zhuǎn)換問題，有研究[12-13]建議將FAVN標(biāo)準(zhǔn)從0.50 IU/mL這一臨界值調(diào)低至0.24 IU/mL，即試劑盒在表6中第2組測出的部分陽性可認(rèn)為是FAVN陽性，因此金標(biāo)準(zhǔn)臨界值一定范圍的擺動，可造成在臨界值附近ELISA與FAVN符合率不高的問題。此外，由于RV基因組序列比較保守，各國流行毒株的G蛋白差異不大，國內(nèi)外間接ELISA試劑盒多采用RV G蛋白包被酶標(biāo)板，但國內(nèi)部分產(chǎn)品使用片段未知的重組RV重組抗原，造成包被抗原質(zhì)量各異，可能影響檢測效果。

狂犬病是目前病死率最高的人獸共患病，按照全國畜間人獸共患病防治規(guī)劃，嚴(yán)格實(shí)施犬只免疫和開展監(jiān)測流調(diào)是狂犬病的重點(diǎn)預(yù)防措施。因此，ELISA作為檢測基層大樣本量的快速簡便方法，對狂犬病的清除具有重要意義。本次試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，國產(chǎn)狂犬病ELISA試劑盒診斷敏感性、診斷特異性、批間穩(wěn)定性等性能均需進(jìn)一步提高，但也有綜合性能較好的試劑盒，建議在基層犬只狂犬病免疫后抗體水平檢測中，可通過與FAVN方法比對，選用與其符合率較高的試劑盒，從而可以準(zhǔn)確掌握轄區(qū)內(nèi)的犬狂犬病免疫狀況，保障實(shí)現(xiàn)區(qū)域間犬只免疫抗體合格率達(dá)到75%以上的目標(biāo)。

4 結(jié)論

本研究以RV血清中和抗體檢測金標(biāo)準(zhǔn)FAVN方法測得的抗體效價為標(biāo)準(zhǔn)，評估了4種國產(chǎn)狂犬病ELISA試劑盒的診斷敏感性、診斷特異性等性能參數(shù)，發(fā)現(xiàn)不同的國產(chǎn)試劑盒診斷性能存在一定差異，整體來看診斷特異性普遍較低，各項(xiàng)檢測性能還需進(jìn)一步提升，實(shí)際應(yīng)用時應(yīng)與FAVN方法進(jìn)行比對，篩選性能最佳的試劑盒用于犬只狂犬病免疫后抗體水平監(jiān)測與評估。