環(huán)境DNA方法在水生動(dòng)物疫病監(jiān)測(cè)方面的應(yīng)用

呂若萱，王秀華，李 晨，連新宇，3，楊 冰

（1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所，青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過(guò)程功能實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部海水養(yǎng)殖病害防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青島市海水養(yǎng)殖流行病學(xué)與生物安保重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東青島 266071；2.上海海洋大學(xué)，上海 201306；3.浙江海洋大學(xué)，浙江舟山 316022）

環(huán)境DNA（environmental DNA，eDNA）研究始于1987年，被定義為可檢測(cè)到的短DNA/RNA片段。這些片段來(lái)自活生物體的細(xì)胞成分或其分泌到周?chē)h(huán)境（水、空氣、沉積物）的非生物成分短核酸片段[1-3]。eDNA樣本被提取后，可以使用多種分子生物學(xué)方法檢測(cè)目標(biāo)片段，包括普通PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）、Sanger測(cè)序等[4-5]。此外，eDNA可直接作為宏基因組學(xué)文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序，或者在特定目標(biāo)基因區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增后測(cè)序。近年來(lái)，eDNA 技術(shù)已被應(yīng)用于生態(tài)系統(tǒng)的物種多樣性研究、資源生物量檢測(cè)以及瀕危種和入侵種檢測(cè)。在水樣、土壤及沉積物等環(huán)境中檢測(cè)eDNA，對(duì)于深入了解和保護(hù)水生動(dòng)物生態(tài)具有巨大潛力[6]。

利用eDNA方法監(jiān)測(cè)水生系統(tǒng)疫病的研究越來(lái)越多，涉及兩棲類[7-9]、魚(yú)類[10-12]、甲殼類[13-15]等多種水生動(dòng)物。它具有成本低、效率高、非破壞性的特點(diǎn)，對(duì)監(jiān)測(cè)高價(jià)值或稀有動(dòng)物疫病優(yōu)勢(shì)明顯。作為組織樣本采集的輔助方法，eDNA方法在早期發(fā)現(xiàn)野生和養(yǎng)殖動(dòng)物群體的疫病入侵或感染導(dǎo)致非明顯臨床癥狀的情況下具有潛在作用。為此，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（World Organization of Animal Health，WOAH）正與各成員討論將該方法應(yīng)用于水生動(dòng)物疫病診斷國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)的可能性[16]。但eDNA方法也存在缺乏驗(yàn)證以及診斷靈敏度易受影響的問(wèn)題。本文探討了eDNA方法在水生動(dòng)物疫病監(jiān)測(cè)方面的潛在用途，以期為深入開(kāi)展eDNA方法在水生動(dòng)物疫病監(jiān)測(cè)方面的應(yīng)用提供參考。

1 eDNA方法的優(yōu)勢(shì)

相比直接采樣檢測(cè)，eDNA方法存在很多優(yōu)點(diǎn)：eDNA方法不要求對(duì)水生動(dòng)物宿主進(jìn)行侵入性或致死性采樣，尤其對(duì)稀有或有價(jià)值的水生動(dòng)物或難以采集和捕捉的野生動(dòng)物特別有優(yōu)勢(shì)[17]；不需要處理動(dòng)物，避免了獲取非破壞性組織樣本相關(guān)的壓力[18]；與單個(gè)動(dòng)物樣本的采集和處理相比，樣本采集和樣本處理時(shí)間及相關(guān)成本可能會(huì)大幅減少[17]；環(huán)境樣本可能涉及整個(gè)或大部分養(yǎng)殖種群的動(dòng)物，即使eDNA方法的診斷靈敏度較低，檢測(cè)病原所需的樣本也可能會(huì)少得多（與單個(gè)動(dòng)物樣本相比）。Ardura等[19]運(yùn)用eDNA方法尋找歐洲泥蝸牛（Peringia ulvae）在橫緯度航行壓載水中潛在生存的分子證據(jù)，證明了eDNA方法可用于對(duì)宿主無(wú)法采樣情形下的檢測(cè)或評(píng)估。

2 在水生動(dòng)物疫病監(jiān)測(cè)方面的應(yīng)用

2.1 兩棲動(dòng)物

兩棲動(dòng)物具有可滲透的皮膚，對(duì)環(huán)境干擾的敏感性強(qiáng)同時(shí)具有兩重性的生活方式，通常被認(rèn)為是生態(tài)系統(tǒng)的健康指標(biāo)。而兩棲動(dòng)物種群正在逐步消失或減少，其原因除棲息地退化和環(huán)境被破壞外，新發(fā)傳染病也是重要原因之一[20]。例如：蛙壺菌（Bartrachochytrium dendrobatidis）導(dǎo)致至少501種兩棲動(dòng)物物種數(shù)量減少，其中90種推測(cè)已滅絕[21]；蛙病毒屬（Ranavirus）被認(rèn)為是導(dǎo)致兩棲動(dòng)物死亡的常見(jiàn)病原[22]；新發(fā)病原蠑螈壺菌（Batrachochytrium salamandrivorans）導(dǎo)致歐洲火蠑螈（Salamandra salamandra）大規(guī)模死亡。

而快速準(zhǔn)確識(shí)別病原微生物對(duì)于早期發(fā)現(xiàn)感染，以便采取適當(dāng)?shù)木徑獯胧┲陵P(guān)重要。近年來(lái)，環(huán)境樣品（如水）中的病原DNA 檢測(cè)已被成功用于鑒定多種水生動(dòng)物寄生蟲(chóng)、壺菌、卵菌和蛙病毒。

目前，檢測(cè)蛙壺菌主要通過(guò)收集兩棲動(dòng)物宿主的皮膚拭子，從拭子中提取DNA，使用qPCR方法檢測(cè)病原體的存在和數(shù)量[23]。eDNA方法采用非侵入性采樣方法，對(duì)于檢測(cè)蛙壺菌具有較大潛力。有研究[24-26]通過(guò)過(guò)濾水樣以獲得游動(dòng)孢子和游動(dòng)孢子囊，然后對(duì)過(guò)濾顆粒使用qPCR方法進(jìn)行檢測(cè)，成功從小體積（＜1 L）水中檢測(cè)到蛙壺菌的存在。該方法具有較高的分析靈敏度，檢測(cè)限低至0.1游動(dòng)孢子[23]，甚至0.06游動(dòng)孢子[25]。研究[27-28]顯示，在兩棲動(dòng)物死亡前的棲息地中，采用eDNA方法檢測(cè)到大量蛙壺菌的存在，并且疫病暴發(fā)期間在環(huán)境表面也發(fā)現(xiàn)了蛙壺菌的存在[28]，表明eDNA方法可用于疫病預(yù)測(cè)，或者提供疫病暴發(fā)期間研究棲息地病原是否存在的依據(jù)。

Hall等[29]發(fā)現(xiàn)，在初始死亡事件發(fā)生前約15 d和發(fā)生后約30 d，eDNA樣本中均可檢測(cè)到蛙病毒，表明即使未觀察到死亡，采用eDNA方法亦可在水體中檢測(cè)到蛙病毒。

主動(dòng)和被動(dòng)監(jiān)測(cè)是確定兩棲動(dòng)物感染狀態(tài)和需要采取保護(hù)措施的關(guān)鍵因素[23]。目前蠑螈壺菌的主動(dòng)監(jiān)測(cè)主要通過(guò)收集兩棲動(dòng)物宿主的皮膚拭子[30]，使用qPCR技術(shù)檢測(cè)是否存在該病原DNA[31]，因此需要進(jìn)行大量個(gè)體采樣，成本高昂。而eDNA方法已被證明具有更高的檢測(cè)能力和成本效益。研究[32-33]表明，可以在天然水體和沉積物中檢測(cè)到蠑螈壺菌DNA。Brunner等[18]提出了針對(duì)蠑螈壺菌，從有限種群中收集合并單個(gè)樣本（如拭子）和eDNA樣本的公式，并討論了使用它們的關(guān)鍵假設(shè)和考慮因素，表明eDNA方法在減少樣本量等方面具有很大應(yīng)用潛力。

2.2 魚(yú)類

隨著魚(yú)類養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大和集約化水平的提高，魚(yú)類病害的發(fā)生日益頻繁，成為制約水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的重要因素之一。而通過(guò)eDNA方法檢測(cè)病原體可以更早地識(shí)別魚(yú)類種群中的感染情況，防止病原進(jìn)一步傳播。

鮭魚(yú)甲病毒（SAV）是大西洋鮭、虹鱒魚(yú)等魚(yú)類胰腺病的主要病原。目前檢測(cè)SAV的方法主要為魚(yú)類組織取樣、組織病理學(xué)診斷和qPCR檢測(cè)。這些致死性取樣方式耗費(fèi)時(shí)間和資源。水平傳播研究[34-35]表明，可直接從海水中檢測(cè)到SAV。有研究通過(guò)過(guò)濾水來(lái)檢測(cè)水環(huán)境中的病原，如魚(yú)類體外寄生蟲(chóng)Gyrodactylus salaris[17，36]和SAV3亞型[12，37]。

錦鯉皰疹病毒3型（Cyprinid herpesvirus 3，CyHV-3）可感染鯉魚(yú)（Cyprinus carpio）和錦鯉（Cyprinus carpio koi），對(duì)養(yǎng)殖產(chǎn)生巨大影響。CyHV-3存在于受感染魚(yú)類的腸、腎和鰓等多個(gè)器官中[38]，糞便中也可檢測(cè)到 CyHV-3[39]，因此水體和池塘沉積物可能也有CyHV-3的存在。Honjo等[40]建立了一種使用病毒濃度法和TaqMan PCR 結(jié)合外標(biāo)病毒定量檢測(cè)環(huán)境水體中CyHV-3的方法，表明來(lái)自不同環(huán)境水域的CyHV-3和外部標(biāo)準(zhǔn)病毒的回收率呈正相關(guān)，揭示了天然水中存在高水平的病毒DNA（超過(guò)2×105copies/L）。Honjo等[41]還建立了使用外標(biāo)病毒對(duì)天然沉積物中CyHV-3 DNA 進(jìn)行定量檢測(cè)的方法，并發(fā)表了關(guān)于天然湖泊或池塘沉積物中存在CyHV-3的第一份報(bào)告，證明沉積物中的CyHV-3 DNA濃度高于水中的濃度。

2.3 甲殼類動(dòng)物

在甲殼類動(dòng)物疫病中，對(duì)蝦白斑綜合征病毒（WSSV）、急性肝胰腺壞死病（AHPND）病原、蝦肝腸胞蟲(chóng)（EHP）、傳染性皮下和造血組織壞死病毒（IHHNV）等病原，對(duì)對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重威脅[42-44]，因此開(kāi)展此類疫病監(jiān)測(cè)至關(guān)重要。Wang等[45]依據(jù)eDNA原理及技術(shù)實(shí)現(xiàn)了對(duì)環(huán)境水體中IHHNV的濃縮和檢測(cè)。張娜等[46]基于eDNA技術(shù)優(yōu)化了檢測(cè)環(huán)境水體中WSSV的切向流濃縮方法，但需要進(jìn)一步研究來(lái)評(píng)估水環(huán)境和土壤中WSSV存在的風(fēng)險(xiǎn)，以對(duì)WSSV有更深入和全面的了解。

鰲蝦瘟不僅可以使本地小龍蝦種群面臨滅絕風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)自然生態(tài)系統(tǒng)也構(gòu)成嚴(yán)重危害。鰲蝦瘟是通過(guò)變形絲囊霉菌（A.astaci）孢子傳播的。而Strand等[47]證明eDNA方法能夠直接從大型淡水系統(tǒng)中檢測(cè)到A.astaci孢子，還發(fā)現(xiàn)鰲蝦種群中的A.astaci流行率、組織中的感染程度和湖水中的A.astaci孢子密度水平呈正相關(guān)，表明該方法在鰲蝦瘟監(jiān)測(cè)中具有巨大潛力。

2.4 軟體動(dòng)物

軟體動(dòng)物分布于淡水、海水和陸地，在生態(tài)系統(tǒng)和群落結(jié)構(gòu)中發(fā)揮著非常重要作用，可保持生態(tài)平衡和凈化水環(huán)境。對(duì)于軟體動(dòng)物，使用eDNA方法檢測(cè)病原相對(duì)于其他水生動(dòng)物起步較晚，研究較少。已有運(yùn)用eDNA方法來(lái)檢測(cè)和量化環(huán)境水體中寄生蟲(chóng)等病原的研究[48-50]，并且針對(duì)DNA回收率和環(huán)境樣本中可能存在的抑制劑影響進(jìn)行優(yōu)化[48]。

3 展望

近年來(lái)eDNA 技術(shù)發(fā)展迅速，不僅被應(yīng)用于監(jiān)測(cè)瀕危種和入侵種，評(píng)估生物量，還被用于檢測(cè)種群遺傳特征，評(píng)估水生生態(tài)系統(tǒng)生境等，已成為闡明生態(tài)學(xué)，如生物多樣性監(jiān)測(cè)、生物量估算及水生動(dòng)物健康狀況監(jiān)測(cè)的有力工具。eDNA方法可有助于增強(qiáng)主動(dòng)監(jiān)測(cè)，以便進(jìn)行早期檢測(cè)，特別對(duì)稀有、有價(jià)值或難以采集樣本的野生水生動(dòng)物有較大的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)，對(duì)水生動(dòng)物養(yǎng)殖環(huán)境中的疫病監(jiān)測(cè)具有成本優(yōu)勢(shì)。

但eDNA方法在病原檢測(cè)方面存在一定的局限性。由于環(huán)境對(duì)檢測(cè)對(duì)象的稀釋和核酸的降解，環(huán)境樣品中的目標(biāo)病原DNA/RNA可能很少，這將對(duì)其靈敏度產(chǎn)生負(fù)面影響[18]。環(huán)境樣本中目標(biāo)DNA/RNA濃度會(huì)因一系列因素而變化，如宿主密度、感染率、感染強(qiáng)度、取樣方法（例如取樣水量、過(guò)濾器孔徑、儲(chǔ)存條件）和環(huán)境條件（例如有機(jī)物量、紫外線）。因此，eDNA方法的檢測(cè)靈敏度在不同地區(qū)、不同時(shí)間點(diǎn)和不同目標(biāo)分類群之間的差異可能比直接進(jìn)行動(dòng)物組織采樣檢測(cè)差異更大[18]。與動(dòng)物組織樣品相比，環(huán)境樣品中的目標(biāo)病原DNA/RNA陽(yáng)性很可能來(lái)自非活病原的污染源，例如熱處理產(chǎn)品中的滅活病原體，因此eDNA檢測(cè)陽(yáng)性并不代表宿主動(dòng)物感染了目標(biāo)病原。

基于eDNA檢測(cè)的實(shí)際應(yīng)用效果取決于樣本收集和處理方法（如體積過(guò)濾、PCR抑制劑的存在和去除）、生物過(guò)程（如脫落率、時(shí)間變化）和非生物因素（如分析物降解、水動(dòng)力因素）。對(duì)這些因素進(jìn)行經(jīng)驗(yàn)評(píng)估非常重要，這樣才能正確解釋結(jié)果。只有清楚地了解這些因素如何影響病原體檢出的概率，基于eDNA的檢測(cè)才能在各種環(huán)境中被可靠地使用。

目前我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)量呈不斷上升趨勢(shì)[51]，而水生動(dòng)物疫病是制約水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)量的主要因素。eDNA方法可以有助于增強(qiáng)水生動(dòng)物疫病主動(dòng)監(jiān)測(cè)，尤其是宿主在疫病入侵或宿主感染病原體后沒(méi)有臨床癥狀的情況下。通過(guò)eDNA方法可以有效了解病原體的傳播機(jī)制并可及時(shí)制定暴發(fā)時(shí)的控制措施。對(duì)于稀有或有價(jià)值的水生動(dòng)物等，環(huán)境采樣優(yōu)于動(dòng)物采樣，且eDNA檢測(cè)方法符合動(dòng)物福利國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)的需求。eDNA檢測(cè)作為一種具有應(yīng)用前途的工具，在水生動(dòng)物疫病監(jiān)測(cè)方面有重要意義。