空腸彎曲桿菌SYBR Green I熒光定量PCR檢測方法的建立

張風(fēng)榮，馮之航，王 艷，陳 翔，王 辰，楊新奧，楊金保

（1.山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)院，山東濰坊 261061；2.上海海關(guān)動植物與食品檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，上海 200135；3.上海海關(guān)，上海 200135；4.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)，山東青島 266109）

空腸彎曲桿菌（Campylobacter jejuni，C.jejuni）是一種重要的細(xì)菌性腸道病原菌，也是最常見的食源性傳染源之一[1]，能夠引起人的急性腸炎[2]和Guillain-Barri綜合征，還可導(dǎo)致牛和綿羊流產(chǎn)等，對公共衛(wèi)生安全和畜牧業(yè)生產(chǎn)安全具有很大危害。世界衛(wèi)生組織（WHO）將該病列為最常見的食源性疫病之一。

空腸彎曲桿菌為革蘭氏陰性的彎曲短桿菌，微需氧[3]，最適生長溫度為37～42 ℃，其抵抗力不強(qiáng)，對干燥、陽光和一般消毒劑敏感[4]?？漳c彎曲桿菌可定殖在多種動物腸道內(nèi)[5]，不引起被感染動物明顯癥狀，但可在其體內(nèi)長期存在。該菌可隨糞便排出，也可通過牛羊乳汁和其他分泌物排出[4]。

空腸彎曲桿菌的確診需要通過細(xì)菌分離鑒定。但該菌屬于微需氧菌，培養(yǎng)條件苛刻[6]，在25 ℃不生長，42 ℃生長良好，使得常規(guī)分離培養(yǎng)以及生化鑒定耗費(fèi)較多人力物力，且靈敏度不高[7]。近年來，利用PCR方法檢測空腸彎曲桿菌已經(jīng)取得了長足發(fā)展，但由于針對的靶基因和使用的PCR技術(shù)不同，建立的檢測方法也存在敏感性和特異性差異。本研究擬針對空腸彎曲桿菌的保守區(qū)域MapA基因設(shè)計(jì)特異性引物，建立一種基于SYBR Green I染料的熒光定量PCR方法，以期為空腸彎曲桿菌的快速檢測和流行病學(xué)調(diào)查提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)菌株

空腸彎曲桿菌菌株，購自ATCC（ATCC 33560）；胎兒空腸桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌，均由山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑及儀器

pBLME-T快速克隆試劑盒、氨芐青霉素、LB液體培養(yǎng)基、氨芐青霉素麥康凱瓊脂固體基礎(chǔ)培養(yǎng)基、感受態(tài)細(xì)胞（DH5α）、SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒、rTaqMix、TB Green Premix ExTaqII，均購自Takara公司；膠回收試劑盒，購自天根生物有限公司；哥倫比亞血瓊脂固體培養(yǎng)基、布氏肉湯液體培養(yǎng)基，購自杭州微生物試劑有限公司；DNA快速抽提試劑盒，購自生工生物工程（上海）股份有限公司；普通PCR儀、熒光定量PCR儀、凝膠電泳儀，均購自賽默飛世爾科技公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)空腸彎曲桿菌（ATCC 33560）在NCBI（GenBank登錄號CP012242.1）中的基因序列信息，針對其保守區(qū)域MapA基因，利用軟件Primer 5.0設(shè)計(jì)1對擴(kuò)增引物（mapA-F：5'-CTATTTTATTTTTGAGTGCTTGTG-3'；mapA-R：5'-GCTTTATTGCCATTTGTTTTATTA-3'），預(yù)計(jì)擴(kuò)增的目的片段大小為589 bp。將設(shè)計(jì)好的引物送華大基因科技有限公司合成。

1.4 DNA提取

將空腸彎曲桿菌接種于哥倫比亞血瓊脂固體培養(yǎng)基，厭氧培養(yǎng)36 h；挑取單個(gè)菌落接種于布氏肉湯液體培養(yǎng)基中，厭氧培養(yǎng)24～36 h，12 000 r/min離心收獲細(xì)菌；使用基因組DNA快速抽提試劑盒提取細(xì)菌DNA，將提取的DNA以50 μL TE Buffer溶解，然后置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建

以提取的空腸彎曲桿菌DNA為模板，使用引物mapA-F/R進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系：rTaqMix 1 μL、上下游引物各1 μL、DNA模板3 μL，最后以ddH2O補(bǔ)足至25 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，最后4 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定，以膠回收試劑盒回收并純化擴(kuò)增出的目的片段；將獲得的目的片段連接到pBLME-T載體，然后轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞（DH5α）進(jìn)行克??；提取質(zhì)粒，并對陽性重組子進(jìn)行PCR鑒定；將鑒定正確的陽性重組子（菌液+質(zhì)粒）送至華大基因科技有限公司測序，并對測序結(jié)果比對分析。將構(gòu)建成功的質(zhì)粒載體命名為pBLME-T-MapA。

1.6 SYBR Green I熒光定量PCR建立

1.6.1 引物設(shè)計(jì)與合成 針對構(gòu)建的pBLME-TMapA質(zhì)粒，利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)1對SYBR Green I熒光定量檢測特異性引物（fMapA2-F：5'-CTAGAGGAATAGTTGTGCTTGA-3'；fMapA2-R：5'-TGCTTGGTGCGGATTGTA-3'），預(yù)計(jì)擴(kuò)增的目的片段為181 bp。將設(shè)計(jì)的引物送華大基因科技有限公司合成。

1.6.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線構(gòu)建及熔解曲線獲得 以pBLME-T-MapA質(zhì)粒為標(biāo)準(zhǔn)品，測定其濃度。將pBLME-T-MapA質(zhì)粒進(jìn)行10倍倍比稀釋，以稀釋好的質(zhì)粒作為SYBR Green I熒光定量PCR檢測標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系20 μL：TB Green Premix ExTaqII 10 μL、fMapA2-F 1 μL、fMapA2-R 1 μL、pBLME-T-MapA質(zhì)粒8 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。根據(jù)擴(kuò)增Ct值構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，同時(shí)獲得熔解曲線。

1.6.3 敏感性試驗(yàn) 將pBLME-T-MapA質(zhì)粒進(jìn)行10倍倍比稀釋，利用建立的SYBR Green I熒光定量PCR方法進(jìn)行檢測。將Ct＜35且出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)“S”形擴(kuò)增曲線的最低濃度，視為該方法的檢測靈敏度。

1.6.4 特異性試驗(yàn) 將空腸彎曲桿菌、胎兒空腸桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌5種細(xì)菌DNA作為模板，利用建立的SYBR Green I熒光定量PCR檢測方法進(jìn)行擴(kuò)增，驗(yàn)證該方法的特異性。

1.6.5 重復(fù)性試驗(yàn) 將pBLME-T-MapA質(zhì)粒進(jìn)行10倍倍比稀釋，共設(shè)置5個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度設(shè)置3個(gè)重復(fù)孔，開展重復(fù)性試驗(yàn)。計(jì)算重復(fù)性試驗(yàn)中Ct值的變異系數(shù)（CV），評估檢測方法的穩(wěn)定性。

2 結(jié)果

2.1 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品鑒定

以重組質(zhì)粒pBLME-T-MapA為模板，使用引物mapA-F/R進(jìn)行常規(guī)PCR檢測。結(jié)果（圖1）顯示，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小約589 bp，片段大小與預(yù)期一致。結(jié)果表明重組質(zhì)粒pBLME-T-MapA構(gòu)建成功。

圖1 重組質(zhì)粒pBLME-T-MapA擴(kuò)增結(jié)果

2.2 SYBR Green I熒光定量PCR熔解曲線

重組質(zhì)粒pBLME-T-MapA的SYBR Green I熒光定量PCR擴(kuò)增結(jié)果（圖2）顯示，擴(kuò)增產(chǎn)物在78 ℃左右均出現(xiàn)單一波峰，無特異性擴(kuò)增峰及引物二聚體。結(jié)果表明該引物具有良好的特異性。

圖2 SYBR Green I熒光定量PCR熔解曲線

2.3 SYBR Green I熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線建立

通過Nanodrop核酸蛋白檢測儀測定重組質(zhì)粒pBLME-T-MapA的質(zhì)量濃度C=251.5 μg/mL。根據(jù)拷貝數(shù)（copies/μL）=，計(jì)算質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的拷貝數(shù)為6.42×1010copies/μL。

以6.42×（108～103）copies/μL的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒為模板，使用建立的SYBR Green I熒光定量PCR方法擴(kuò)增檢測，獲得“S”形擴(kuò)增曲線（圖3）。以讀取的Ct值為Y軸，標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒濃度為X軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖4），同時(shí)獲得SYBR Green I熒光定量PCR的擴(kuò)增相關(guān)系數(shù)R2為0.998 1，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=-3.366x+33.652。

圖3 SYBR Green I熒光定量PCR擴(kuò)增曲線

圖4 SYBR Green I熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4 敏感性試驗(yàn)

以6.42×（108～100）copies/μL的10倍倍比稀釋的重組pBLME-T-MapA質(zhì)粒為模板，使用本試驗(yàn)建立的SYBR Green I熒光定量PCR進(jìn)行檢測。結(jié)果（圖5）顯示，該方法的最低檢測濃度為6.42 copies/μL。

圖5 SYBR Green I熒光定量PCR敏感性試驗(yàn)結(jié)果

2.5 特異性試驗(yàn)

以空腸彎曲桿菌、胎兒空腸桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌等5種細(xì)菌DNA作為模板，使用本試驗(yàn)建立的SYBR Green I熒光定量PCR方法進(jìn)行檢測。結(jié)果（圖6）顯示，建立的SYBR Green I熒光定量PCR檢測方法僅對空腸彎曲桿菌有特異性擴(kuò)增，對其他病原均無擴(kuò)增。結(jié)果表明該方法具有良好的特異性。

圖6 SYBR Green I熒光定量PCR特異性試驗(yàn)結(jié)果

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

以5個(gè)稀釋度的重組質(zhì)粒pBLME-T-MapA為模板，分別進(jìn)行組內(nèi)和組間重復(fù)性試驗(yàn)，各設(shè)置3個(gè)重復(fù)。結(jié)果（表1）顯示，組內(nèi)Ct值的CV為0.55%～1.66%，組間為1.07%～2.16%，均小于2.50%，表明該方法具有良好的可重復(fù)性。

表1 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

空腸彎曲桿菌為一種人獸共患病病原，是引起人類細(xì)菌性腹瀉的最重要病原菌之一，可通過食物鏈傳遞給人類并引起發(fā)病。人感染后的最典型癥狀是發(fā)熱及急性胃腸炎等，免疫力極低者會進(jìn)一步出現(xiàn)心內(nèi)膜炎、關(guān)節(jié)炎、骨髓炎、腦炎、敗血癥等全身性疾病[8]。因此，建立一種快速而特異的檢測方法有助于對該病的預(yù)防和控制。目前已建立了多種PCR檢測技術(shù)，如韓偉等[9]針對16s RNA序列，建立了快速鑒定彎曲桿菌的PCR方法，并將之與自動酶聯(lián)免疫熒光分析方法結(jié)合，使其檢測靈敏度可達(dá)到25 cfμ/mL；Docherty等[10]建立的磁免疫PCR法，能檢測空腸彎曲桿菌、結(jié)腸彎曲桿菌和海鷗彎曲桿菌；Guangming等[11]針對彎曲桿菌flaA和hipO基因，首次建立了針對空腸彎曲桿菌的磁捕獲-熒光聚合酶快速檢測方法。

熒光定量PCR具有快速、靈敏、省時(shí)的優(yōu)勢，是鑒定微生物的強(qiáng)大工具，已被廣泛應(yīng)用于臨床病原體檢測[12-13]。目前，有各種基于熒光的化學(xué)方法用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測，主要分為四類：水解探針、發(fā)夾探針、熒光標(biāo)記雜交探針和DNA結(jié)合染料。雖然基于探針的化學(xué)試劑為PCR引物提供了額外的序列特異性，但通常引物設(shè)計(jì)比較困難且難以優(yōu)化，因而顯著增加了試驗(yàn)總體成本。相比之下，SYBR Green I作為DNA結(jié)合染料，與DNA雙鏈結(jié)合后發(fā)出熒光信號，而未結(jié)合的SYBR染料分子不會發(fā)射任何熒光信號，保證了熒光信號的增加同步于PCR產(chǎn)物。此外，該染料產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度可隨DNA濃度變化而相應(yīng)變化（DNA濃度越高，熒光越強(qiáng)），從而提供了一種靈活的方法，即通過熒光強(qiáng)度檢測雙鏈DNA含量，且不需要單獨(dú)的探針設(shè)計(jì)和條件優(yōu)化。該方法檢測成本低，操作便捷，易于標(biāo)準(zhǔn)化，可用于高通量檢測。本研究針對空腸彎曲桿菌的保守區(qū)域MapA基因設(shè)計(jì)熒光定量PCR特異性引物，建立了基于SYBR Green I熒光染料的空腸彎曲桿菌熒光定量PCR方法，可為空腸彎曲桿菌臨床樣品的快速檢測、流行病學(xué)調(diào)查以及定量研究提供技術(shù)支持。

隨后，本研究對建立的SYBR Green I熒光定量PCR檢測方法進(jìn)行了敏感性、特異性和重復(fù)性驗(yàn)證。敏感性試驗(yàn)結(jié)果顯示，該方法最低檢測濃度為6.42 copies/μL，可達(dá)到臨床檢測要求；特異性試驗(yàn)結(jié)果顯示，建立的方法僅對空腸彎曲桿菌有特異性擴(kuò)增，對其他病原均無擴(kuò)增，表明該方法具有良好的特異性；以5個(gè)稀釋度的重組質(zhì)粒為模板分別進(jìn)行的組內(nèi)和組間重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果顯示，組內(nèi)和組間Ct值CV均小于2.50%，說明該方法具有良好的可重復(fù)性。

本研究通過構(gòu)建空腸彎曲桿菌MapA基因的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒，在優(yōu)化各反應(yīng)條件的基礎(chǔ)上，基于SYBR Green I染料建立了快速檢測空腸彎曲桿菌的熒光定量PCR方法，其檢測靈敏度可達(dá)6.42 copies/μL，且具有良好的特異性及重復(fù)性，可用于進(jìn)出境試驗(yàn)動物等空腸彎曲桿菌的快速鑒別診斷以及流行病學(xué)調(diào)查。