PMA-PCR診斷技術(shù)研究進(jìn)展

石艷萍，陳弟詩(shī)，王 印，陳 斌，楊 悅，張鵬飛，李 春，邵 靚

（1.四川省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，四川成都 610041；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，四川成都 611130）

PCR是普遍應(yīng)用的病原微生物分子生物學(xué)檢測(cè)方法，可針對(duì)微生物的核酸片段進(jìn)行檢測(cè)，但無(wú)法區(qū)分樣本中微生物的活死狀態(tài)。21世紀(jì)初，Nogva等[1]和Rudi等[2]將疊氮溴化乙錠（ethidium monoazide bromide，EMA）與PCR技術(shù)相結(jié)合，用于活死微生物的區(qū)別鑒定，顯著提高了鑒定靈敏度和速度。后來(lái)的研究者發(fā)現(xiàn)，EMA會(huì)造成活微生物60%的基因組損失，所以選擇了替代物——疊氮溴化丙錠（propidium monoazide，PMA）。PMA類(lèi)似于碘化丙啶（propidium iodide，PI），因在菲環(huán)中加入疊氮基團(tuán)并使其具有雙正電荷，被認(rèn)為是第二代DNA插層染料。PMA不會(huì)進(jìn)入活細(xì)胞，也不會(huì)滲透到輕微受損的細(xì)胞中，因此在區(qū)分活死細(xì)胞方面更具特異性。本文對(duì)PMA-PCR檢測(cè)方法的基本原理、影響因素及其在動(dòng)植物疫病防控、食品安全、公共衛(wèi)生等領(lǐng)域的應(yīng)用進(jìn)行了初步探討。

1 PMA-PCR原理

PMA是一種具有高親和力的光敏反應(yīng)DNA結(jié)合染料，分子結(jié)構(gòu)式如圖1-A。它自身的熒光非常微弱，但在結(jié)合核酸后熒光信號(hào)顯著增強(qiáng)。PMA傾向于結(jié)合雙鏈DNA，其光敏性疊氮基團(tuán)生成高反應(yīng)性的氮賓基團(tuán)，與羥基化合物共價(jià)結(jié)合，形成穩(wěn)定的DNA修飾（圖1-B）。具有雙正電荷的PMA無(wú)法穿過(guò)有生物活性的細(xì)胞膜，而活死微生物最大的區(qū)別在于細(xì)胞膜的完整性?；钗⑸锏募?xì)胞膜具有選擇透過(guò)性，能夠?qū)MA排除在細(xì)胞膜外，而死微生物則不能。將微生物樣本懸液與PMA溶液混合后，PMA穿透死微生物受損的細(xì)胞膜與DNA結(jié)合，每分子的PMA可以和10～80 bp的DNA分子結(jié)合，在可見(jiàn)光（最大460 nm）照射下，分解產(chǎn)生一種氮烯類(lèi)物質(zhì)，其與DNA發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，這種共價(jià)交聯(lián)產(chǎn)物可以抑制DNA的PCR擴(kuò)增[3]。此外，這種共價(jià)交聯(lián)產(chǎn)物能夠在DNA提取過(guò)程中連同細(xì)胞碎片一同被除去。同時(shí)，殘留的PMA與反應(yīng)體系中的水分子反應(yīng)生成羥胺而失去反應(yīng)活性，不會(huì)對(duì)活細(xì)胞以及活細(xì)胞裂解后裸露的DNA造成影響。因此，通過(guò)這種機(jī)制，PMA可以插入死微生物的DNA中，通過(guò)抑制其PCR擴(kuò)增，從而達(dá)到只檢測(cè)活微生物的目的。

圖1 PMA的分子式及作用機(jī)理

2 PMA-PCR與其他分子生物學(xué)檢測(cè)方法的比較

分子生物學(xué)檢測(cè)方法有傳統(tǒng)PCR、qPCR、數(shù)字PCR[4-5]、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增[6-8]、聚合酶交聯(lián)螺旋反應(yīng)、交叉引物擴(kuò)增[9-10]、重組酶聚合酶擴(kuò)增[11-13]，基于CRISPR的核酸檢測(cè)[14]以及高通量測(cè)序等技術(shù)。PMA-PCR與這些技術(shù)相比，可有效鑒別樣本中的活死病原微生物，這是其他幾種方法無(wú)可比擬的（表1）。

表1 PMA-PCR與其他分子生物學(xué)檢測(cè)方法的比較

3 PMA-PCR影響因素

在實(shí)際應(yīng)用中，PMA-PCR的檢測(cè)結(jié)果受樣本濁度、活死微生物的比例、PMA濃度、暗處理?xiàng)l件、曝光條件、樣本處理方法以及目的基因擴(kuò)增長(zhǎng)度的影響。

（1）不同來(lái)源樣本濁度不同，其中高濁度樣本常常含有影響PMA作用的物質(zhì)，不僅會(huì)降低染料的作用，還會(huì)干擾PMA與DNA的交聯(lián)反應(yīng)，因此適宜的樣本濁度對(duì)檢測(cè)結(jié)果極其重要。研究表明，當(dāng)樣本濁度低于10 NTU時(shí)，PMA的處理對(duì)于檢測(cè)結(jié)果幾乎沒(méi)有影響[15]。

（2）樣本中活死微生物的比例過(guò)低或者過(guò)高會(huì)使檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確。對(duì)于不同病原微生物，采用PMA-PCR方法檢測(cè)時(shí)活微生物含量的最低檢出限不一樣，比如地衣芽孢桿菌活菌膠囊中金黃色葡萄球菌的最低檢測(cè)閾值是1×104CFU/mL[16]，植物乳桿菌純培養(yǎng)物的最低檢測(cè)閾值為15拷貝/反應(yīng)體系[17]。此外，Nocker等[18]在運(yùn)用PMA-PCR方法測(cè)定污水中的大腸桿菌時(shí)發(fā)現(xiàn)，此方法更適用于測(cè)試低于10%活細(xì)胞的混合比例樣本，當(dāng)活細(xì)胞大于50%時(shí)，該方法不能有效區(qū)分細(xì)菌死活狀態(tài)。

（3）PMA濃度對(duì)于暗處理階段PMA與DNA的結(jié)合尤為重要。在此階段，PMA溶液的濃度過(guò)低，就不能完全結(jié)合DNA，濃度過(guò)高則可進(jìn)入活微生物內(nèi)造成假陽(yáng)性結(jié)果。

（4）暗處理溫度及處理時(shí)間也是重要的影響因素。暗處理溫度會(huì)影響細(xì)胞膜的流動(dòng)性和通透性。研究[19]證實(shí)，25 ℃為最佳處理溫度。合適的暗處理時(shí)間不僅能充分保證PMA與死微生物內(nèi)的DNA完全結(jié)合，還能夠阻止PMA與活微生物內(nèi)的DNA結(jié)合。不同微生物的暗處理時(shí)間不同，但大多數(shù)處理時(shí)間為5 min。

（5）曝光處理的光源和光處理時(shí)間也非常重要。不同光源的發(fā)射光譜不同，目前最常使用的光源為500～750 W的鹵素?zé)?，波長(zhǎng)為465 nm的發(fā)光二極管也能夠達(dá)到相同的效果。曝光時(shí)將樣品放置在離光源20～30 cm處，一般采用的光照時(shí)間為2～20 min，光照時(shí)間過(guò)短反應(yīng)不完全，光照時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致微生物死亡。另外，有研究發(fā)現(xiàn)，鹵素?zé)舢a(chǎn)生的熱量也會(huì)造成微生物死亡[20]。

（6）樣本處理方法對(duì)檢測(cè)結(jié)果也有很大影響。例如，由于紫外線處理不會(huì)立即引起細(xì)胞膜破損[21]，PMA不能進(jìn)入死細(xì)胞內(nèi)，因此PMA-PCR檢測(cè)不適用于紫外處理后的活細(xì)胞檢測(cè)。

（7）目的基因擴(kuò)增長(zhǎng)度也會(huì)影響PMA-PCR結(jié)果，擴(kuò)增的長(zhǎng)度越長(zhǎng)，PCR的抑制率越高。

4 PMA-PCR的應(yīng)用

4.1 動(dòng)物疫病診斷

PMA-PCR方法可應(yīng)用于動(dòng)物疫病診斷、病原微生物活力鑒定、生物多樣性分析，并有助于在流行病學(xué)調(diào)查中通過(guò)鑒別各環(huán)節(jié)病原微生物的傳染性來(lái)精準(zhǔn)發(fā)現(xiàn)疫病的傳播途徑[22-24]。Farhan等[25]對(duì)13份細(xì)菌分離培養(yǎng)陰性的乳樣品進(jìn)行PMA-PCR檢測(cè)，并對(duì)純化的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行DNA測(cè)序，結(jié)果分析鑒定出7種類(lèi)型的病原菌。相對(duì)于常規(guī)細(xì)菌分離培養(yǎng)，PMA-PCR檢測(cè)更有利于乳汁中病原菌的檢測(cè)，從而有助于亞臨床乳腺炎的快速診斷。

為評(píng)估加熱對(duì)弓形蟲(chóng)卵囊活力的影響，Rousseau等[26]將未處理和熱殺死（99 ℃，5 min）的弓形蟲(chóng)卵囊與PMA結(jié)合后孵育，并通過(guò)共聚焦顯微鏡和流式細(xì)胞術(shù)分析卵囊的染料滲透性。同時(shí)，通過(guò)優(yōu)化PMA濃度、孵育溫度以及選定目標(biāo)基因和擴(kuò)增片段長(zhǎng)度等反應(yīng)條件和參數(shù)，建立了可識(shí)別特異性活弓形蟲(chóng)卵囊的PMA-qPCR方法。有研究[27]發(fā)現(xiàn)，PMA-PCR對(duì)布魯氏菌S2株的檢測(cè)敏感性比常規(guī)PCR方法高100倍，能夠快速評(píng)估體內(nèi)或者胞內(nèi)布魯氏菌的生存狀態(tài)，有助于疾病診斷。利用PMA不能穿透完整的病毒包膜結(jié)構(gòu)，但能非特異性修飾核酸分子，使其不能通過(guò)qPCR擴(kuò)增的特性，Zeng等[28]采用PMA結(jié)合qPCR檢測(cè)樣品中是否具有包膜結(jié)構(gòu)完整的非洲豬瘟病毒粒子，用于鑒別非洲豬瘟病毒的感染性。

此外，PMA-PCR也可應(yīng)用于生物多樣性分析。南美對(duì)蝦儲(chǔ)存樣品經(jīng)過(guò)PMA前處理與未經(jīng)過(guò)PMA前處理，在微生物群落結(jié)構(gòu)上存在明顯差異。例如：4 ℃條件下，微桿菌屬是樣品中最主要的微生物，未經(jīng)PMA處理的南美對(duì)蝦貯藏5 d后，微桿菌屬在樣品菌群中的比例可高達(dá)60%，而經(jīng)過(guò)PMA處理的蝦樣其比例僅為45%；在30 ℃條件下，弧菌屬是最主要的微生物群落組成成分，隨著貯藏時(shí)間的增加，其在未經(jīng)PMA處理對(duì)照組的比例變化趨勢(shì)為先減少后增加（2%～38%），而經(jīng)PMA處理在貯藏期間卻沒(méi)有顯著變化（30%～40%）[29]。

4.2 植物病原微生物檢測(cè)

細(xì)菌和真菌感染會(huì)對(duì)植物生長(zhǎng)造成不良影響。目前，PMA-PCR技術(shù)不僅應(yīng)用于柑橘黃龍病菌、黃瓜細(xì)菌性角斑病菌、獼猴桃潰瘍病菌、胡蘿卜和玉米細(xì)菌性枯萎病菌的活菌檢測(cè)，還可以用來(lái)檢測(cè)多種花和果實(shí)中的病菌，以及田間和土壤中存活的孢子等[30-36]。Da Cunha等[37]建立了PMA-qPCR方法以評(píng)估巴西固氮螺菌在玉米根中的活力，通過(guò)比較qPCR、PMA-qPCR和平板計(jì)數(shù)的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)玉米根中qPCR計(jì)數(shù)高于PMA-qPCR計(jì)數(shù)和平板計(jì)數(shù)。與依賴(lài)培養(yǎng)的方法相比，PMA-qPCR法在定量檢測(cè)活細(xì)胞方面更快速、準(zhǔn)確。由青枯菌引起的桑青枯病是我國(guó)的一種毀滅性作物病害。曹夢(mèng)琪[38]從患有青枯病的桑樹(shù)根部組織中分離到青枯菌菌株，用PMA對(duì)其進(jìn)行預(yù)處理，發(fā)現(xiàn)可完全抑制107CFU/mL死菌中的DNA，且不會(huì)對(duì)活菌DNA擴(kuò)增造成影響，能從活死菌混合體系中有效分辨出活菌。目前也構(gòu)建了橡膠樹(shù)白粉病PMAqPCR檢測(cè)體系，為及時(shí)高效檢測(cè)橡膠樹(shù)白粉菌分生孢子活菌量提供了技術(shù)支撐[39]。

4.3 食品行業(yè)檢測(cè)

PMA在食品行業(yè)的應(yīng)用已取得了一定發(fā)展，可以用來(lái)檢測(cè)各種食物樣品中大腸桿菌、單增李斯特菌、沙門(mén)氏菌、副溶血性弧菌等的活菌含量[40-46]。PMA-qPCR方法可以在牡蠣樣品中計(jì)數(shù)活的大腸桿菌，雖然可能有假陽(yáng)性，但與使用依賴(lài)培養(yǎng)的方法相比，其操作更簡(jiǎn)便，結(jié)果所需時(shí)間更短[47]。周陽(yáng)等[48]研究證實(shí)，1.0 mg/mL質(zhì)量濃度的PMA在單增李斯特菌的檢測(cè)中能有效提高活菌檢出率。海德堡腸道沙門(mén)氏菌能夠引起食源性感染。利用PMA-qPCR方法，可鑒別區(qū)分海德堡沙門(mén)氏菌和其他沙門(mén)氏菌，并顯示出100%的特異性[49]。PMA-qPCR還能夠?qū)π迈r和加工肉類(lèi)樣品中活的但不可培養(yǎng)的金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌和腸桿菌科細(xì)菌進(jìn)行定量檢測(cè)[50]。此外，曹瀟等[51]發(fā)現(xiàn)，當(dāng)PMA溶液質(zhì)量濃度為3 μg/mL時(shí)，在650 W鹵素?zé)羝毓? min的條件下，PMA能夠完全抑制1.2×107拷貝/mL的死食源金黃色葡萄球菌核酸擴(kuò)增。PMA-PCR也可用于檢測(cè)黃酒釀造過(guò)程中5種乳桿菌的活菌數(shù)[52]，以及檢測(cè)人工添加奶粉、米粉、酸奶樣品和凍干樣品中的植物乳桿菌[17]。

4.4 公共衛(wèi)生檢測(cè)

隨著PMA-PCR在其他領(lǐng)域的成功應(yīng)用，這種方法也被應(yīng)用于一些人類(lèi)疾病的診斷。PMA-PCR能夠被應(yīng)用于植入假體造成關(guān)節(jié)感染時(shí)葡萄球菌、腸球菌屬和痤瘡皮桿菌的活菌鑒定，在PMA質(zhì)量濃度為10 μg/mL、暗培養(yǎng)5 min、光激活10 min時(shí)，該方法的敏感性為79%，特異性為89%，與普通PCR相比，特異性和敏感性顯著提高[53]。郁震等[54]發(fā)現(xiàn)，PMA 質(zhì)量濃度范圍在5～10 μg/mL時(shí)，可以區(qū)分卡介苗死菌和活菌，并且能夠被檢測(cè)到的最小活菌濃度是3×104CFU/mL；當(dāng)卡介苗濁度小于10 NTU時(shí)，PMA能有效抑制死細(xì)胞DNA的PCR擴(kuò)增，而當(dāng)濁度大于50 NTU時(shí)，PMA失去效果。而霍亂弧菌在12.5 μg/mL的PMA質(zhì)量濃度時(shí)與qPCR技術(shù)相結(jié)合，可抑制106CFU/mL霍亂弧菌死菌的DNA擴(kuò)增[55]。李聰聰[21]發(fā)現(xiàn)，當(dāng)大腸桿菌活菌/總菌＞1%時(shí)，經(jīng)PMA預(yù)處理，可以消除膜損傷菌DNA的干擾，實(shí)現(xiàn)對(duì)活菌的定量檢測(cè)。劉丹丹等[56]通過(guò)優(yōu)化PMA預(yù)處理?xiàng)l件，建立了新型冠狀病毒PMA-RT-qPCR檢測(cè)方法；用建立的檢測(cè)方法對(duì)采用含氯消毒劑滅活和不同溫度熱滅活的病毒進(jìn)行檢測(cè)，評(píng)估其檢測(cè)病毒活性的效果，為判斷樣本中病毒的感染性提供了輔助手段。此外，PMA-qPCR可用于檢測(cè)水環(huán)境中的病原。過(guò)濾水樣經(jīng)PMA處理后，通過(guò)降低受損細(xì)菌的信號(hào)來(lái)避免qPCR的假陽(yáng)性結(jié)果，有助于健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和微生物風(fēng)險(xiǎn)定量評(píng)估，例如用PMA-qPCR可快速檢測(cè)游泳池中銅綠假單胞菌[57]。

5 結(jié)語(yǔ)

PMA-PCR 作為一種能夠有效區(qū)分活死微生物的新型核酸擴(kuò)增方法，現(xiàn)階段已被初步應(yīng)用于動(dòng)植物疫病防控、食品安全、公共衛(wèi)生等多個(gè)領(lǐng)域。PMA除了與PCR交聯(lián)使用，還能夠與其他分子生物學(xué)技術(shù)聯(lián)合用于活死微生物區(qū)分。如：PMA結(jié)合環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（PMA-LAMP）檢測(cè)結(jié)核桿菌和金黃色葡萄球菌，其靈敏度及特異性明顯優(yōu)于PMA-PCR。而將鈣黃素聯(lián)合PMA-LAMP檢測(cè)食品中活微生物的方法直觀、快速，又準(zhǔn)確[58]。雖然PMA-PCR檢測(cè)方法在檢測(cè)病原微生物狀態(tài)時(shí)具有其他方法不可比擬的優(yōu)勢(shì)，但其精確性和靈敏度還有待進(jìn)一步提高；因不同病原微生物理化特性不同，需要分別對(duì)其PMA預(yù)處理?xiàng)l件進(jìn)行摸索；病原感染性由病原自身致病力、宿主免疫狀態(tài)、宿主生存環(huán)境等多方面決定，運(yùn)用該方法鑒定病原感染性時(shí)需綜合評(píng)估。隨著對(duì)該技術(shù)特異性、敏感性、適用性等方面的不斷探索，相信未來(lái)該技術(shù)具有更廣闊的應(yīng)用前景。