豬博卡病毒研究進(jìn)展

余 蕊，張 會(huì)，高 藝，孫永科，楊玉艾，張 恒

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)，云南昆明 650210；2.山東信得科技股份有限公司，山東青島 266104；3.青島韋立國(guó)際集團(tuán)，山東青島 266000）

博卡病毒（bocavirus）是一類重要的人獸共患病病原體，最初發(fā)現(xiàn)于20世紀(jì)60年代。博卡病毒自發(fā)現(xiàn)以來(lái)，相繼在多種動(dòng)物中被檢出，例如犬[1]、牛等，人類中也有檢出[2]。2009年，瑞典研究人員采集患斷奶仔豬多系統(tǒng)衰弱綜合征（PMWS）病死豬的淋巴結(jié)，通過(guò)研磨及一系列處理后提取DNA，采用隨機(jī)多重置換擴(kuò)增、高通量測(cè)序及生物信息學(xué)分析方法，最終得到1條1 879 bp的新型細(xì)小病毒片段。因其序列與人博卡病毒序列相似，被命名為豬博卡病毒（porcine bocavirus，PBoV），這是PBoV首次進(jìn)入人們的視線[3]。

近年來(lái)，PBoV逐漸在世界各地蔓延開來(lái)，常常與豬流行性腹瀉病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）、豬圓環(huán)病毒2型（porcine circovirus 2，PCV2）等病毒共感染導(dǎo)致豬發(fā)病，且感染率逐年升高，給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)新的挑戰(zhàn)[4-6]。此外，在兒童[7]與水貂[8]中也檢測(cè)到PBoV，其跨物種傳播能力引發(fā)了新的擔(dān)憂，可能成為威脅人類健康的新型病原體。目前我國(guó)對(duì)于PBoV的研究及流行病學(xué)監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)較少，并且相關(guān)人員對(duì)PBoV的認(rèn)視也不足，因此養(yǎng)殖人員、獸醫(yī)、流行病學(xué)調(diào)查及科研人員全面了解該病原，對(duì)于防控該病傳播至關(guān)重要。本文從病原學(xué)、流行病學(xué)、致病機(jī)制、檢測(cè)方法及防控手段等5個(gè)方面進(jìn)行綜述介紹，以期為我國(guó)PBoV研究及其感染防控提供參考。

1 病原學(xué)

PBoV屬于細(xì)小病毒科細(xì)小病毒亞科，是博卡病毒屬的新成員。博卡病毒為無(wú)囊膜病毒，呈二十面體對(duì)稱，直徑為25～30 nm。博卡病毒基因組為不分段的線性單鏈DNA，長(zhǎng)度為4～6 kb，其中PBoV長(zhǎng)度約為5 kb，末端有發(fā)卡結(jié)構(gòu)[9]。

PBoV基因組含有3個(gè)開放閱讀框——ORF1、ORF2和ORF3，分別編碼4種蛋白，即NS1、VP1/VP2和NP1（圖1）。ORF1位于5'端，序列長(zhǎng)約1.9 kb，主要參與病毒復(fù)制。ORF1包含與滾環(huán)復(fù)制、解旋酶和ATP酶活性相關(guān)的保守基序，編碼非結(jié)構(gòu)蛋白NS1。ORF2位于3'端，編碼衣殼結(jié)構(gòu)蛋白VP1/VP2，其中VP1長(zhǎng)度約為2.1 kb，VP2約為1.6 kb，VP1與VP2的基因組序列重疊在一起。VP1/VP2衣殼結(jié)構(gòu)蛋白是PBoV的主要抗原蛋白，二者的抗原性在很大程度上決定了病毒的抗原性。VP1蛋白獨(dú)特區(qū)（VP1u）中存在鈣依賴性磷脂酶A2（PLA2）酶活性基序，增強(qiáng)了衣殼蛋白釋放到細(xì)胞質(zhì)中的能力，“HDXXY”基序是催化中心，而保守的“YLGPF”基序是PLA2的Ca2+結(jié)合環(huán)。VP2蛋白包括8個(gè)β折疊、1個(gè)αA螺旋、1個(gè)DE環(huán)和1個(gè)HI環(huán)，其與病毒衣殼蛋白的組裝、穩(wěn)定性及表面結(jié)構(gòu)有關(guān)[10]。VP1和VP2對(duì)SeV誘導(dǎo)的IFN-β啟動(dòng)子激活具有顯著增強(qiáng)作用，這與人博卡病毒（human bocavirus，HBoV）VP1/VP2的干擾素協(xié)同激活作用一致[11-13]。

圖1 PBoV基因組結(jié)構(gòu)示意圖

ORF3位于ORF1與ORF2之間，是博卡病毒屬成員的特征序列，編碼非結(jié)構(gòu)蛋白NP1[10]。NP1蛋白是一種新的干擾素拮抗蛋白，通過(guò)干擾I型干擾素的產(chǎn)生與信號(hào)傳導(dǎo)來(lái)拮抗病毒的先天免疫。I型干擾素系統(tǒng)包括干擾素表達(dá)及其信號(hào)通路，它提供了強(qiáng)大的抗病毒先天免疫反應(yīng)[14]，其中干擾素的產(chǎn)生由IRF3和NF-κB共同調(diào)節(jié)，信號(hào)傳導(dǎo)由ISGF3復(fù)合物調(diào)節(jié)。NP1蛋白抑制先天免疫反應(yīng)的過(guò)程：阻斷SeV誘導(dǎo)的IFN-β啟動(dòng)子激活且呈劑量依賴性，并顯著抑制SeV誘導(dǎo)的IFN-α、IFN-β、ISG15和ISG56 mRNA的表達(dá)；在不影響IRF3表達(dá)、磷酸化與核轉(zhuǎn)移的情況下，競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合IRF3的DNA結(jié)合域（DBD），阻止IRF3 DBD與IFN-β啟動(dòng)子結(jié)合，從而負(fù)調(diào)控IFN-β的產(chǎn)生。除此之外，NP1蛋白通過(guò)與IRF9的DNA結(jié)合域（DBD）結(jié)合來(lái)阻斷ISGF3 DNA結(jié)合活性，以此拮抗IFN信號(hào)傳導(dǎo)，表現(xiàn)出廣譜抑制先天免疫反應(yīng)的能力[13，15]。進(jìn)一步的研究[16]發(fā)現(xiàn)：NP1蛋白在其N端和C端區(qū)域包含兩個(gè)功能獨(dú)立的域，其N端區(qū)域通過(guò)靶向IRF3和IRF9的下游來(lái)負(fù)調(diào)節(jié)IFN-β和ISRE的啟動(dòng)子活性；其C端區(qū)域通過(guò)增強(qiáng)p65的磷酸化和IκBα的降解來(lái)誘導(dǎo)NF-κB活化，從而促進(jìn)促炎細(xì)胞因子表達(dá)。NP1的核定位使其能夠更有效地誘導(dǎo)NF-κB活化。

目前PBoV的分型依據(jù)尚未確定。一些學(xué)者認(rèn)為VP1可以在很大程度上影響病毒的組織嗜性和致病性，因此應(yīng)以編碼VP1的基因序列相似性高低作為分類依據(jù)[17]。常用的分型方法有兩種：依據(jù)病毒VP1和NS1編碼基因序列進(jìn)行基因型劃分，均可分為3個(gè)基因群（G1、G2、G3）[18-19]，但這兩種分型方法在G3型分群上還存在一些差異[20]。選取NCBI上發(fā)布的比較完整的PBoV基因序列，截取VP1蛋白基因，使用軟件MEGA-X10.1中的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖2）。相對(duì)于G1群，G2群和G3群處于同一個(gè)進(jìn)化支上，說(shuō)明G2群和G3群可能由同一基因群進(jìn)化而來(lái)，經(jīng)過(guò)重組進(jìn)化后差異較大，最終分為兩個(gè)不同的基因群。G2、G3群與G1群在進(jìn)化上相距較遠(yuǎn)，可能來(lái)自兩個(gè)不同的祖先。

圖2 PBoV VP1蛋白編碼基因進(jìn)化樹構(gòu)建

2 流行病學(xué)

自2009年P(guān)BoV首次在瑞典被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，世界各國(guó)不僅在現(xiàn)有豬群中檢測(cè)PBoV，甚至回顧了之前采集的樣本。在回溯樣本時(shí)，中國(guó)[9]與克羅地亞[21]都在2006年采集的樣本中檢測(cè)出PBoV。此外，在羅馬尼亞2006—2007年和2010—2011年從野豬種群中收集的樣本中也檢測(cè)到PBoV，并且樣本中的感染率從9.14%（43/470）增加到17.74%（66/372）[22]。這提示2009年P(guān)BoV在瑞典被首次報(bào)道前，它就已經(jīng)存在于豬群中。

目前多種PBoV毒株在仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征、呼吸道綜合征及腹瀉病例中均被發(fā)現(xiàn)[23-24]；PBoV在臨床樣品中與RNA病毒，例如豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）、PCV2、豬瘟病毒（CSFV）等具有較普遍的共感染現(xiàn)象[4]，可通過(guò)呼吸道、消化道和血液水平傳播，也可通過(guò)胎盤垂直傳播[25]；目前PBoV已在世界范圍內(nèi)迅速蔓延，包括中國(guó)、北愛(ài)爾蘭[9]、美國(guó)[26]、斯洛文尼亞、克羅地亞[27]、泰國(guó)[28]、捷克、斯洛伐克[29]、德國(guó)[30]、烏干達(dá)、肯尼亞[31]，比利時(shí)[5]、馬來(lái)西亞[32]等國(guó)家。PBoV在我國(guó)出現(xiàn)后，其流行率有升高趨勢(shì)。2010年，PBoV在我國(guó)仔豬糞便樣本中的檢出率為12.59%[9]。2018年，對(duì)來(lái)自廣東省和吉林省的豬群樣本進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，PBoV檢出率為18.1%（84/463）[33]。2021年，我國(guó)中部地區(qū)腹瀉仔豬中檢測(cè)到PBoV感染為74.73%（210/281）[6]。從GenBank中發(fā)布的國(guó)內(nèi)外PBoV毒株序列信息可見(jiàn)（表1），自2010年我國(guó)發(fā)現(xiàn)PBoV以來(lái)，PBoV在我國(guó)的流行毒株種類不斷增加，但主要流行G1群。

表1 國(guó)內(nèi)外PBoV分離情況

PBoV的流行可能與豬齡相關(guān)。Zhang等[4]在腹瀉豬腸道病毒感染的發(fā)生與調(diào)查研究中發(fā)現(xiàn)，育肥豬中PBoV的感染率高于其他年齡豬。Mohan等[32]在研究中發(fā)現(xiàn)，PBoV流行率在斷奶仔豬和育肥豬中比新生仔豬高。同樣，在來(lái)自羅馬尼亞的樣本中，6～12月齡的豬PBoV感染率（77.06%，84/109）比12～36月齡（22.94%，25/109）高[22]。據(jù)報(bào)道[21，29]，在捷克和斯洛伐克，斷奶仔豬比其他年齡組的豬更容易感染PBoV。因此，有研究人員提出一個(gè)假設(shè)，母源抗體可能在仔豬預(yù)防PBoV感染中起重要作用[29]。

3 致病機(jī)制

目前PBoV的確切致病機(jī)制尚不清楚。它難以分離培養(yǎng)，且常與其他豬腸道病毒共存，臨床上最常見(jiàn)共感染病毒為PCV-2，在PCV-2感染豬群中PBoV檢出率為83.8%，同時(shí)在健康豬中也可檢測(cè)到PBoV，因此有研究人員推測(cè)PBoV可能不直接導(dǎo)致豬發(fā)病，而是作為一種輔助病毒存在[19，34，41]。PBoV在多種組織中都被檢測(cè)到，例如淋巴結(jié)[3]、胃腸道[9]、扁桃體[28]、腦組織[30]、肺臟、腎臟、肝臟、脾臟[31]等，說(shuō)明PBoV具有廣泛的組織噬性。PBoV具有免疫抑制作用，廣譜干擾I型干擾素的產(chǎn)生以及干擾素的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。此外，PBoV通過(guò)激活NF-κB途徑來(lái)促進(jìn)炎癥反應(yīng)[13，15-16]。

臨床上PBoV常與多種其他豬腸道病原混合感染，呈現(xiàn)腹瀉和呼吸系統(tǒng)疾病癥狀[23，40]。仔豬感染PBoV后主要表現(xiàn)為精神沉郁、食欲下降，經(jīng)剖檢可見(jiàn)，胃腸黏膜充血，腸管腫脹，腸壁變薄，胃腸內(nèi)容物有未消化乳凝塊。組織病理學(xué)變化主要出現(xiàn)在空腸、回腸和十二指腸，主要表現(xiàn)為絨毛萎縮，有時(shí)出現(xiàn)絨毛腸上皮細(xì)胞輕度扁平和壞死，退化的腸細(xì)胞脫落進(jìn)入管腔，淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)到固有層，伴有凋亡碎片和血管充血[4，40]。PBoV在病豬的淋巴結(jié)、脾臟和扁桃體中的檢出率最高，表明這些器官可能是病毒的主要侵害部位[32]。2016年，Pfankuche等[30]研究發(fā)現(xiàn)，在患腦脊髓炎的豬中僅檢測(cè)到了PBoV。該結(jié)果與2013年Mori等[42]在腦炎病人的腦脊液中檢出HBoV的報(bào)道十分相似。由此推測(cè)，當(dāng)PBoV單獨(dú)感染時(shí)可能會(huì)導(dǎo)致豬的腦脊髓炎。

4 診斷與檢測(cè)

4.1 病原分離與鑒定

細(xì)胞培養(yǎng)分離是常用的病毒分離方法。自2009年P(guān)BoV首次被檢出以來(lái)，科研人員嘗試在各種體外細(xì)胞系中分離純化該病毒。Zeng等[36]2011年嘗試在常用體外細(xì)胞系——豬腎細(xì)胞（PK-15）、豬睪丸細(xì)胞（ST）、豬肺泡巨噬細(xì)胞（PAM）、猴腎細(xì)胞（MARC-145）和人胚胎腎上皮細(xì)胞（HEK293T）中分離純化PBoV，均未檢測(cè)到病毒生長(zhǎng)。目前僅McKillen等[41]使用豬原代腎細(xì)胞培養(yǎng)4代后發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞出現(xiàn)圓形病變，經(jīng)RT-PCR與IFA均證實(shí)PBoV被成功繁殖，成功構(gòu)建了PBoV原代細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)。

4.2 分子生物學(xué)方法

分子生物學(xué)診斷的主要技術(shù)有核酸分子雜交、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和生物芯片技術(shù)。PCR是PBoV的主要檢測(cè)方法，相較于其他檢測(cè)方法，其靈敏度更高，檢測(cè)速度更快。朱小甫等[43]針對(duì)VP1、VP2基因建立了檢測(cè)PBoV-1的nPCR方法，該方法檢測(cè)下限降低至4.742×10-2ng/μL，較其他研究[44]的靈敏度有所提高。TaqMan探針?lè)╭PCR已通過(guò)靶向VP1基因用于PBoV-2的檢測(cè)和定量，無(wú)需PCR后的檢測(cè)程序即可實(shí)時(shí)檢測(cè)病毒載量[33]。師乾凱等[45]參照GenBank登錄的PBoVNP1基因和PEDVM基因保守序列，建立了能夠同時(shí)快速定量檢測(cè)PBoV G1基因群和PEDV的雙重TaqMan熒光定量PCR方法，對(duì)臨床上兩者共感染病例的流行病學(xué)調(diào)查具有重要意義。

4.3 免疫學(xué)方法

免疫學(xué)診斷的主要技術(shù)有凝集試驗(yàn)、沉淀反應(yīng)、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)、中和反應(yīng)及免疫標(biāo)記技術(shù)。常規(guī)的凝集試驗(yàn)、中和反應(yīng)等方法因PBoV不能在體外細(xì)胞系中分離純化，尚無(wú)應(yīng)用案例。目前間接ELISA是PBoV的常用檢測(cè)手段之一，即通過(guò)抗原抗體的特異性結(jié)合，使用熒光抗體檢測(cè)相應(yīng)抗原。該方法對(duì)實(shí)驗(yàn)人員的技術(shù)要求更高，靈敏度高于細(xì)胞培養(yǎng)分離法，但低于分子生物學(xué)方法，特異性相較其他兩種方法更強(qiáng)，目前尚無(wú)商品化的診斷試劑盒面世。張晶[46]用重組VP1蛋白作為包被抗原，初步建立PBoV間接ELISA抗體檢測(cè)方法，其與Western blot結(jié)果符合率為81.25%，批內(nèi)和批間重復(fù)試驗(yàn)變異系數(shù)均小于10%。Shi等[47]構(gòu)建了基于PBoV重組NP1蛋白的間接ELISA方法。該方法針對(duì)PBoV G1群檢測(cè)的準(zhǔn)確率高，重復(fù)性好，且與PEDV、豬傳染性胃腸炎病毒（transmissible gastroenteritis of swine，TGEV）、PCV2、PPV、PRRSV的抗血清均無(wú)交叉反應(yīng)。

5 防控手段

目前還沒(méi)有關(guān)于PBoV疫苗研發(fā)的相關(guān)報(bào)道。張韜等[48]利用原核表達(dá)系統(tǒng)大量表達(dá)了 VP1 蛋白，成功制備了針對(duì)PBoV VP1蛋白的兔多克隆抗體，這給亞單位疫苗的研發(fā)工作帶來(lái)了突破性進(jìn)展。由于PBoV在臨床上的共感染現(xiàn)象十分嚴(yán)重，目前還沒(méi)有針對(duì)該病的特效藥。因此，在生豬養(yǎng)殖中需要加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，注意生物安全，采取科學(xué)的免疫預(yù)防措施，重視保健防疫措施。常用防控手段包括：從健康豬群中引種，堅(jiān)持全進(jìn)全出的管理模式；按規(guī)定程序接種CSFV、偽狂犬病病毒、細(xì)小病毒等常用疫苗；在飼料或飲水中添加一些保健預(yù)防藥物，例如柴胡、金銀花等中獸藥制劑。

6 結(jié)語(yǔ)

PBoV的相關(guān)基礎(chǔ)研究較少。該病毒在國(guó)內(nèi)外的檢出率逐年升高，臨床上共感染現(xiàn)象十分嚴(yán)重，難以在體外細(xì)胞系中分離鑒定及純化，目前致病機(jī)制尚未明確，疫苗研發(fā)也尚未成功。最近PBoV突破物種屏障感染人類與水貂，給公共衛(wèi)生帶來(lái)新的挑戰(zhàn)。深入了解PBoV病原學(xué)特點(diǎn)，特別是對(duì)其致病機(jī)制進(jìn)行深入研究，對(duì)生豬養(yǎng)殖及公共衛(wèi)生安全具有重要意義。