遼寧絨山羊毛尾線蟲的分子鑒定與遺傳進化分析

鄭毓秀，于本良，王大為，劉宇明，李 冰，劉孝剛

（1.錦州醫(yī)科大學畜牧獸醫(yī)學院，遼寧錦州 121000；2.遼寧省動物疫病預(yù)防控制中心，遼寧沈陽 110164）

毛尾線蟲，也稱毛首線蟲、鞭蟲，隸屬于毛尾科（Trichuridae）毛尾屬（Trichuris），或毛首科（Trichocephalidae）毛首屬（Trichocephalus）[1]。毛尾線蟲的宿主范圍非常廣泛，可以寄生在牛、羊、駱駝、長頸鹿、豬、犬等多種動物以及人的盲腸內(nèi)，對人和動物均有很高的發(fā)病率[2-4]。該病目前呈世界性分布，主要在熱帶和亞熱帶的發(fā)展中國家流行，在我國流行也較為廣泛，是一種危害較大的人獸共患寄生蟲病，嚴重威脅著人類健康和畜牧業(yè)發(fā)展[5-6]。

毛尾線蟲的分離鑒定方法主要包括形態(tài)學鑒定和分子生物學鑒定。毛尾線蟲具有典型的外觀形態(tài)結(jié)構(gòu)，利用傳統(tǒng)的形態(tài)學鑒定方法很容易鑒定到屬，但是種內(nèi)鑒定需要對毛尾線蟲的蟲體大小、交合刺長度、交合刺鞘等微小形態(tài)學特征進行鑒定[10]。當遇到一些親緣關(guān)系較近或形態(tài)相似性較高的毛尾線蟲時，上述的形態(tài)學結(jié)構(gòu)特征也將出現(xiàn)一些微小的變化，這給傳統(tǒng)的形態(tài)學鑒定帶來了較大困難[11-12]。

ITS序列是位于18S與28S之間的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)，包括核糖體第一內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS1和核糖體第二內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS2兩段序列[13]。研究[14]發(fā)現(xiàn)，核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）序列在毛尾線蟲屬的分類學上是比較理想的分子遺傳標記。因ITS序列進化速度快，且有高度保守性，受外界環(huán)境因素影響較小，所以以ITS為遺傳標記進行PCR擴增及序列對比分析的方法，已被廣泛應(yīng)用于到多種寄生蟲的鑒定與分類研究工作中[15-17]。

羊是毛尾線蟲的重要宿主之一，感染毛尾線蟲后可發(fā)生盲腸慢性卡他性炎癥，嚴重感染時可導(dǎo)致盲腸黏膜出血性壞死、水腫、潰瘍等，引起下痢、貧血、消瘦，生長發(fā)育緩慢，甚至死亡[7-8]。遼寧絨山羊是世界上最優(yōu)秀的絨山羊品種，因其高品質(zhì)的羊絨質(zhì)量和穩(wěn)定的遺傳性能被譽為“中華國寶”，是我國政府明令禁止出境的極少數(shù)畜禽品種之一[9]。遼寧省東部地區(qū)是重要的絨山羊養(yǎng)殖區(qū)域，絨山羊飼養(yǎng)業(yè)是廣大農(nóng)民脫貧致富的重要產(chǎn)業(yè)之一。本研究旨在確定該地區(qū)絨山羊毛尾線蟲的蟲體種類及遺傳進化關(guān)系，為該病的診斷和防控等研究工作奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 蟲體樣本采集

10株蟲體樣本均采自于遼寧省東部地區(qū)10只遼寧絨山羊的盲腸，依次編號為LN-1～10。根據(jù)毛尾線蟲的形態(tài)結(jié)構(gòu)特征[1]，經(jīng)過形態(tài)學鑒定后，初步確定為毛尾屬線蟲。將10株蟲體樣本用生理鹽水反復(fù)清洗3次，置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試劑和儀器

1.2.1 主要試劑 血液/細胞/組織基因組 DNA 提取試劑盒（TIANamp Genomic DNA Kit），購自天根生化科技（北京）有限公司產(chǎn)品（貨號DP304-02）；DL 2 000 DNA Maker，購自寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司（貨號3427A）；2×EsTaqMaster Mix（Dye），購自康為世紀生物科技有限公司（貨號CW0682M）；綠色熒光核酸染料（10 000*），購自索萊寶生物科技有限公司（貨號G8140）。

1.2.2 主要儀器 YX-280手提式壓力蒸汽滅菌器，購自合肥華泰醫(yī)療設(shè)備有限公司；DYY-12型電泳儀，購自北京市六一儀器廠；Tanon 1600凝膠圖像分析，購自上海天能科技有限公司；TC1000-G梯度PCR儀，購自大龍興創(chuàng)試驗儀器北京有限公司；DK-98-1型電熱恒溫水浴鍋，購自天津市泰斯特儀器有限公司。

1.3 蟲體DNA提取

從-20 ℃冰箱中取出單個蟲體，放入滅菌的1.5 mL離心管中，加入雙蒸水反復(fù)吹打沖洗3次后，將蟲體放入新的離心管中；加入200 μL磷酸鹽緩沖液，用研磨棒充分研磨；加入20 μL蛋白酶K（Proteinase K）混勻后，56 ℃水浴放置1～3 h，直至組織徹底溶解；按照DNA 提取試劑盒使用說明提取蟲體DNA，DNA樣品于-20 ℃保存。

1.4 引物合成及PCR擴增

根據(jù) GenBank所登錄的羊毛尾線蟲內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS1基因序列（登錄號AJ310662），設(shè)計1對特異性引物——上游引物ITS1-F：5'-GGAGCAACCGTTCAGCCACAGC-3'；下游引物ITS1-R：5'-TCTTCAACGACCTACGAGCCAAG TGAT-3'。

PCR反應(yīng)體系（20 μL）：模板 DNA 5 μL，上下游引物各1 μL，2×EsTaqMaster Mix 10 μL，ddH2O 3 μL。PCR反應(yīng)條件：94℃ 5 min；94 ℃ 30 s，63 ℃ 30 s，74 ℃ 30 s，35個循環(huán)；74 ℃ 5 min。

將PCR產(chǎn)物分別用2%瓊脂糖凝膠進行電泳，用全自動凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果并保存圖片，然后進行克隆、測序驗證。

1.5 序列同源性與遺傳進化分析

將測序所得序列與GeneBank中收錄的其他9株毛尾線蟲分離株的ITS1序列進行比對分析，并以旋毛蟲（Trichinella spiralis）作為外群，通過MEGA 5.05軟件校對序列，然后用DNAstar中的MegAlign軟件，將樣品序列及GenBank中已收錄的其他毛尾線蟲ITS1序列進行分析，比較其同源性與差異性；利用 MEGA5.05軟件，以鄰接法（neighbor-joining method）將上述所有序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，分析其遺傳進化關(guān)系。供比對的其他9株毛尾線蟲分離株的ITS1序列信息見表1

表1 9株不同毛尾線蟲的ITS1序列信息

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)學鑒定

形態(tài)學觀察結(jié)果顯示：蟲體外觀呈乳白色，前部細長呈毛發(fā)狀，后部短粗，外形似鞭（圖1-A）；雄蟲尾部卷曲，雌蟲尾部平直，后端鈍圓（圖1-B）；雄蟲尾部有l(wèi)根交合刺，且有交合刺鞘（圖1-C）。10株蟲體外觀形態(tài)和鏡下結(jié)構(gòu)均符合毛尾屬線蟲的形態(tài)學特征[1]。

圖1 毛尾線蟲蟲體的形態(tài)結(jié)構(gòu)

2.2 ITS1擴增產(chǎn)物瓊脂糖電泳分析

分子生物學檢測結(jié)果（圖2）顯示：10份絨山羊毛尾線蟲樣品均成功擴增出約 445 bp的片段，與預(yù)期ITS1目的片段長度相符，無非特異性條帶，說明成功擴增出目的基因。

圖2 遼寧絨山羊毛尾線蟲ITS1擴增產(chǎn)物的瓊脂糖電泳分析結(jié)果

2.3 ITS1序列差異性對比分析

ITS1序列差異性對比分析結(jié)果（圖3）顯示：10株絨山羊毛尾線蟲間序列同源性較高，為95.5%～100%。與GenBank中收錄的2株中國巖羊毛尾線蟲分離株（登錄號：MG573308.1和MG573306.1）的同源性分別為95.5%～100%和93.7%～98.7%，與其他7株毛尾線蟲分離株（登錄號：AM992998.1、AM992997.1、FN543172.1、FN543171.1、HE608854.1、HE608854.1、KX669086.1）同源性為49.4%～76.4%，種內(nèi)差異（0～2.1%）遠小于種間差異（23.6～50.6%）。同源性分析結(jié)果說明，本次從遼寧省東部地區(qū)遼寧絨山羊體內(nèi)分離得到的10株蟲體均為毛尾線蟲。

圖3 遼寧絨山羊毛尾線蟲ITS1序列差異性對比結(jié)果

2.4 分離株系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

系統(tǒng)發(fā)育樹（圖4）表明，分離到的10株遼寧絨山羊毛尾線蟲高度相似，與GenBank中報道的其他2株中國巖羊毛尾線蟲（T.73 DS-2018和T.skrjabini）聚在同一分支，與GenBank中收錄的其他動物毛尾線蟲分支較遠。構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹進一步證實，在遼寧省東部地區(qū)遼寧絨山羊體內(nèi)分離得到的蟲體是毛尾線蟲。

圖4 遼寧絨山羊毛尾線蟲分離株系統(tǒng)發(fā)育樹

3 討論

毛尾屬線蟲具有典型的形態(tài)學特征，所以通過形態(tài)學鑒定方法很容易鑒定到屬，但對親緣關(guān)系較近的毛尾線蟲則很難準確鑒定到種[18]。近年來，寄生蟲分子鑒定和分子遺傳學分析技術(shù)在寄生蟲種類鑒定方面取得了很大進展，為寄生蟲的種屬鑒定提供了新的有效手段，在精準性方面明顯優(yōu)于傳統(tǒng)的形態(tài)學鑒定方法。核糖體中的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS1和ITS2兩部分序列具有種內(nèi)高度保守性，其中ITS1序列可為各種寄生蟲的分類鑒定提供可靠的遺傳標記，已被廣泛應(yīng)用于線蟲種類的分類鑒定[19]。

本研究首先采用傳統(tǒng)的形態(tài)學鑒定方法，對遼寧省東部山區(qū)的10株遼寧絨山羊源線蟲進行了鑒定。結(jié)果顯示：10株蟲體外觀形態(tài)學特征一致，蟲體呈乳白色，前部細長呈毛發(fā)狀，后部短粗，外形似鞭。10株蟲體中有6株確認為雌蟲，4株確認為雄蟲；雌蟲外觀尾部平直，后端鈍圓；雄蟲外觀尾部卷曲，顯微鏡下觀察具有l(wèi)根交合刺，并具有交合刺鞘。10株蟲體外觀形態(tài)和鏡下結(jié)構(gòu)均符合毛尾屬線蟲的形態(tài)學特征[1]。

在形態(tài)學鑒定基礎(chǔ)上，本研究以ITS1為遺傳標記，采用PCR擴增及序列對比分析方法對10株遼寧絨山羊源線蟲進行了分子生物學鑒定。PCR擴增結(jié)果顯示，蟲體ITS1序列長度基本一致，約為445 bp；序列對比分析結(jié)果顯示，10株蟲體與GenBank中登錄的2株中國巖羊毛尾線蟲同源性最高，分別為95.5%～100%和93.7%～98.7%；系統(tǒng)進化樹分析顯示，10種蟲體與2株中國巖羊毛尾線蟲聚集在同一分支上，種內(nèi)差異（0～2.1%）遠小于種間差異（23.6～50.6%）。研究結(jié)果說明，本次從遼寧絨山羊體內(nèi)分離到的線蟲為毛尾線蟲，同時也證實其核糖體ITS序列種內(nèi)相對保守，可以作為毛尾線蟲的分子鑒定及遺傳進化研究的目的基因。