Kruppel樣轉(zhuǎn)錄因子4在子宮內(nèi)膜癌中作用機(jī)制的研究進(jìn)展

陳婉儀，馬洋洋，蔣學(xué)風(fēng)*

子宮內(nèi)膜癌(endometrial carcinoma,EC)是女性生殖道三大惡性腫瘤之一，2018年全球女性發(fā)病率和死亡率為8.4/100 000和1.8/100 000[1],有數(shù)據(jù)顯示，近年我國EC患者的病死率增速超過發(fā)病率增速，且發(fā)病年齡逐漸年輕化,美國癌癥協(xié)會預(yù)計(jì)2022年美國子宮內(nèi)膜惡性腫瘤新發(fā)6.6萬余例，死亡1.2萬余例[2]。EC發(fā)生發(fā)展的調(diào)節(jié)機(jī)制仍舊不清， Kruppel 樣轉(zhuǎn)錄因子4(Kruppel-like factor 4,KLF4)是鋅指蛋白類轉(zhuǎn)錄因子家族中的一員，參與調(diào)控細(xì)胞的生長、增殖、分化等多個(gè)生命進(jìn)程。近年來研究發(fā)現(xiàn)，KLF4與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)以及預(yù)后密切相關(guān)，其異常表達(dá)是腫瘤細(xì)胞增生活躍的重要標(biāo)志。本文就KLF4對EC的影響以及二者之間關(guān)系的研究進(jìn)展作一綜述。

1 KLF4概述

1.1 KLF4結(jié)構(gòu)與功能

Kruppel樣轉(zhuǎn)錄因子家族(KLFs)是能夠結(jié)合富含GC序列的鋅指家族轉(zhuǎn)錄因子的成員，其作為全身重要功能的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，參與多種生理過程。1996年Shields JM等[3]在對小鼠進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)并分離了KLF4，人類KLF4基因位于染色體9q31，長5 631bp，具有5個(gè)外顯子，mRNA長約3.5kb，cDNA含有1 876個(gè)核苷酸，蛋白由513個(gè)氨基酸殘基組成，分子量為5 4671D，含有3個(gè)C2H2鋅指結(jié)構(gòu)。KLF4具有多個(gè)功能結(jié)構(gòu)域，主要包括：① N端富含酸性氨基酸的轉(zhuǎn)錄活化區(qū)域，為功能區(qū)，負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)；② C端DNA結(jié)合區(qū)域?yàn)殇\指結(jié)構(gòu)區(qū)域，易與CACCC序列元件和(或)富含GC序列的靶基因調(diào)節(jié)序列結(jié)合[4];③ 在鄰近鋅指結(jié)構(gòu)區(qū)域有核定位信號[5]。

KLF4的主要作用是維持細(xì)胞周期的完整性[6]，從而影響體細(xì)胞的生長、分化、增殖和程序性凋亡[7]，其促凋亡途徑包括激活CDKN1A啟動子-p53募集-激活p21WAF1/CiP1；抑制cyclin B1、cyclin D1基因啟動子-下調(diào)周期蛋白cyclin B1、cyclin D1表達(dá)[8-10]，或者直接作為控制蛋白，激活p21抑制細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制細(xì)胞增殖[11]。抑制凋亡途徑包括激活CDKN1C啟動子-抑制SAPK通路、直接抑制P53和BAX的表達(dá)，抑制p53依賴的凋亡通路[12-13]。

KLF4既可促進(jìn)細(xì)胞凋亡，也與細(xì)胞DNA損傷修復(fù)相關(guān)。在受放射損傷的小鼠腸道組織內(nèi)，DNA輕度損傷可修復(fù)時(shí)，p53轉(zhuǎn)錄激活KLF4，KLF4表達(dá)上調(diào)且與p53相互作用，進(jìn)一步激活基因p21，從而阻滯細(xì)胞周期并啟動修復(fù)程序，修復(fù)受損傷的DNA；相反，在DNA重度損傷不可修復(fù)時(shí)，KLF4與HuR(RNA結(jié)合蛋白)結(jié)合減少，KLF4-mRNA穩(wěn)定性下降，KLF4表達(dá)下降，致使p53激活基因BAX，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[14]。另外，KLF4在細(xì)胞分化、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程中也扮演著重要角色。在胚胎發(fā)育過程中，KLF4在胃腸道、皮膚組織中高表達(dá)[15]，參與皮膚組織的發(fā)生、發(fā)育與分化成熟[16]，也在T細(xì)胞發(fā)育和分化過程中發(fā)揮作用[17]。有研究發(fā)現(xiàn)KLF4在上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)過程中充當(dāng)上皮基因的轉(zhuǎn)錄激活者和間充質(zhì)基因的抑制劑[18]。不僅如此，KLF4還是人工誘導(dǎo)多能干細(xì)胞生成的一個(gè)核心轉(zhuǎn)錄因子，可以維持胚胎干細(xì)胞端粒酶活性，激活人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)和人端粒酶催化亞基的表達(dá)。

1.2 KLF4在腫瘤中的作用

在胃癌、腸腺癌、前列腺癌、食管癌和肺癌中，KLF4的下調(diào)可能促進(jìn)惡性轉(zhuǎn)化和細(xì)胞過度增殖；在鱗狀細(xì)胞癌和乳腺癌中，KLF4卻呈現(xiàn)高表達(dá)，且與預(yù)后不良相關(guān)[19-21]。KLF4通過多種途徑調(diào)節(jié)腫瘤的發(fā)生發(fā)展，如通過抑制hTERT和MAPK信號傳導(dǎo)抑制肺癌生長、通過抑制Wnt/β-catenin通路抑制結(jié)腸癌早期形成[22-23]。然而，在乳腺癌中，KLF4卻起著促進(jìn)癌細(xì)胞分化的作用，70%的乳腺癌中KLF4表達(dá)升高，在體外實(shí)驗(yàn)中抑制KLF4的表達(dá)會影響腫瘤干細(xì)胞的自我更新，并可降低乳腺癌細(xì)胞遷徙能力[24]。

KLF4可參與肺癌、食管癌、胃癌、腸腺癌、前列腺癌、乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展，具體作為癌基因還是抑癌基因發(fā)揮作用，與其細(xì)胞所處微環(huán)境、染色質(zhì)狀態(tài)以及其他相關(guān)基因的表達(dá)情況有關(guān)，具體機(jī)制目前尚不明確[25]。

2 KLF4在EC的發(fā)生中扮演著抑癌基因的角色

2.1 脂代謝相關(guān)因子通過抑制KLF4因子促進(jìn)EC發(fā)生發(fā)展

脂質(zhì)代謝異常是導(dǎo)致慢性疾病和腫瘤發(fā)生的主要因素，腫瘤的惡性行為伴隨代謝途徑的變化而變化。在異常脂代謝過程中，一系列原癌性脂質(zhì)信號分子的合成，導(dǎo)致脂質(zhì)信使比例增加，如溶血磷脂酸，通過G蛋白偶聯(lián)受體家族信號，促使癌癥發(fā)生、發(fā)展[26]。已有研究證實(shí)，機(jī)體能量過剩時(shí)，血漿中游離脂肪酸(free fatty acid,FFA)水平增加，引起脂代謝失調(diào)[27]。FFA代謝為腫瘤細(xì)胞提供能量，促進(jìn)其生長，還可以充當(dāng)代謝調(diào)節(jié)信號分子的角色，通過參與酶轉(zhuǎn)錄和基因表達(dá)影響細(xì)胞的生長和炎癥反應(yīng)[28-29]。

KLF4是脂肪細(xì)胞分化早期所需的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子之一，與細(xì)胞的脂質(zhì)攝入及脂肪酸的β氧化呈正相關(guān)，低表達(dá)的KLF4可以導(dǎo)致脂肪酸蓄積。高水平的FFA可能通過抑制KLF4表達(dá)導(dǎo)致EC的發(fā)生發(fā)展。有研究表明，具有酪氨酸蛋白激酶活性的原癌基因C-erbB-2、參與維持有絲分裂的DNA結(jié)合蛋白ki-67、抑癌基因P53在EC組織中過度表達(dá)[30]，同時(shí)，另有研究表明，血漿中FFA與C-erbB-2、ki-67、突變型P53表達(dá)呈正相關(guān)，與KLF4呈負(fù)相關(guān)，由此可見，肥胖過程中高水平FFA可能通過抑制KLF4表達(dá)、促進(jìn)C-erbB-2、ki-67、突變型P53表達(dá)，導(dǎo)致EC的發(fā)生和發(fā)展[31]。另一方面，已有文獻(xiàn)提示高濃度的棕櫚酸(palmitic acid,PA)也對脂肪細(xì)胞KLF4表達(dá)具有抑制作用[32]。體外實(shí)驗(yàn)顯示：在EC細(xì)胞中下調(diào)KLF4表達(dá)后，抑癌基因P53的表達(dá)水平顯著降低，ki-67、MMP2的表達(dá)水平顯著增加，并促進(jìn)EC細(xì)胞增殖、侵襲和遷移。而在PA刺激EC細(xì)胞的同時(shí)下調(diào)KLF4表達(dá)后，抑癌基因P53的表達(dá)水平顯著降低，而ki-67、MMP2的表達(dá)水平顯著增加。提示PA可能通過抑制KLF4的表達(dá)，導(dǎo)致下游癌基因、抑癌基因表達(dá)紊亂，最終促進(jìn)EC的發(fā)生和發(fā)展。由此可見，F(xiàn)FA和PA均通過抑制KLF4促進(jìn)EC細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展，但FFA和PA如何抑制KLF4，以及KLF4和C-erbB-2、ki-67、P53、MMP2之間相互作用的具體機(jī)制尚不明確，有待進(jìn)一步研究。

近年來大量研究表明，肥胖過程中脂代謝紊亂可導(dǎo)致脂肪細(xì)胞中代謝相關(guān)基因啟動子區(qū)DNA甲基化狀態(tài)發(fā)生變化，繼而影響基因表達(dá)[33]。還有研究顯示FFA可以通過影響甲基轉(zhuǎn)移酶的水平，促進(jìn)疾病的發(fā)生發(fā)展[34-35]。吳金秀[36]通過研究表明EC患者癌組織中DNMT1、DNMT3b的表達(dá)顯著高于非癌對照組子宮內(nèi)膜組織。同時(shí)，高濃度的PA可以促進(jìn)EC細(xì)胞中DNMT1、DNMT3b mRNA及蛋白的表達(dá)水平顯著升高，而當(dāng)下調(diào)DNMT1/3b后，KLF4的表達(dá)水平與單純PA刺激組相比顯著增加。由此可見，高濃度PA可能通過上調(diào)甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMT1/3b)的表達(dá)，從而抑制轉(zhuǎn)錄因子KLF4的表達(dá)，導(dǎo)致下游癌基因、抑癌基因表達(dá)紊亂，進(jìn)而影響EC的發(fā)生發(fā)展。

2.2 KLF4可能介導(dǎo)孕激素受體抑制EC細(xì)胞的增殖

孕激素受體(progesterone receptor,PR)的激活可抑制各種生殖組織中的細(xì)胞增殖。然而，孕激素調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖的分子機(jī)制仍不明確。KLF4可誘導(dǎo)上皮細(xì)胞中的細(xì)胞周期停滯，一項(xiàng)使用了人子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的研究分析了KLF4在細(xì)胞增殖過程中是否充當(dāng)PR激活的靶標(biāo)。PR激動劑、孕激素和地諾孕素被發(fā)現(xiàn)可以使KLF4 mRNA 表達(dá)持續(xù)增加，然后減少cyclin D1 mRNA，并抑制細(xì)胞增殖，同時(shí)使G0/G1停滯。使用KLF4小干擾RNA 敲低KLF4，則消除了PR激動劑對細(xì)胞增殖的抑制作用。此外，KLF4的高表達(dá)抑制細(xì)胞周期蛋白D1啟動子的反式激活，這些結(jié)果表明PR激動劑誘導(dǎo)KLF4表達(dá)，然后抑制周期蛋白D1表達(dá)，從而抑制人子宮內(nèi)膜細(xì)胞中的細(xì)胞增殖，就人類生殖組織而言，KLF4可能直接響應(yīng)PR激活[37]。孕激素在早期EC保留生育功能治療中是否起到同樣作用值得進(jìn)一步研究。同樣，左炔諾孕酮宮內(nèi)緩釋系統(tǒng)(LNG-IUS)是早期EC保留生育功能的重要方法。一項(xiàng)相關(guān)研究表明，與對左炔諾孕酮(LNG)敏感的內(nèi)膜癌細(xì)胞株相比，耐LNG可能具有更大的致癌風(fēng)險(xiǎn)，且耐LNG細(xì)胞KLF4mRNA表達(dá)顯著上調(diào)，這可能成為LNG-IUS治療早期EC的生物標(biāo)志物[38]。在未來的研究中，需要更深入挖掘EC與PR、KLF4的機(jī)制，并且進(jìn)行更詳細(xì)的調(diào)查或臨床研究，為臨床EC的預(yù)防和治療提供新的理論支持。

2.3 二甲雙胍可能通過促進(jìn)KLF4表達(dá)降低EC發(fā)生發(fā)展的風(fēng)險(xiǎn)

越來越多的研究證實(shí)，二甲雙胍(metformin,MET)能夠降低糖尿病患者多種癌癥的發(fā)病率，然而，MET在患有EC的非糖尿病女性中發(fā)揮的作用仍未可知。在人類Ishikawa子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中，MET處理降低了細(xì)胞數(shù)目，并引起了KLF9、PR、PR-B、KLF4和其他腫瘤標(biāo)志物mRNA水平的明顯變化。同時(shí)，在KLF9表達(dá)降低(通過siRNA靶向)的情況下，MET迅速放大了PR、PR-B和KLF4的轉(zhuǎn)錄水平。該研究證實(shí)MET直接作用于EC細(xì)胞以改變類固醇受體表達(dá)和信號網(wǎng)絡(luò)，并可能構(gòu)成針對高危非糖尿病女性EC的預(yù)防策略[39]。

3 EC中KLF4基因的調(diào)節(jié)作用

miRNA是近年來研究較多的一類與腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)的小分子RNA。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，miR-200b可通過調(diào)節(jié)KLF4的表達(dá)，影響子宮內(nèi)膜細(xì)胞的侵襲性和轉(zhuǎn)移。另外，也有研究表明，miR-200b可能是通過下調(diào)KLF4，繼而下調(diào)其下游p21和上調(diào)Cyclin-D1表達(dá)，從而影響EC細(xì)胞的增殖和細(xì)胞周期，促進(jìn)EC細(xì)胞增殖[47]。

KLF4基因的調(diào)節(jié)在EC發(fā)生發(fā)展中起調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)化作用，其可調(diào)控受體細(xì)胞的信號通路及蛋白質(zhì)表達(dá)，隨著相關(guān)研究的不斷深入，KLF4基因的調(diào)節(jié)作用對EC侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響機(jī)制會越來越清晰，這對于深化EC的臨床治療研究大有裨益。

綜上，KLF4作為轉(zhuǎn)錄因子，功能復(fù)雜，且通過多種機(jī)制參與癌癥的形成，腫瘤的發(fā)生發(fā)展并非獨(dú)立的過程，但KLF4通過何種通路影響EC的發(fā)生仍需進(jìn)一步探討。例如，腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cells,CSCs)是近年來腫瘤學(xué)研究的一個(gè)熱點(diǎn)。目前認(rèn)為,CSCs是存在于腫瘤組織中的一小部分具有干細(xì)胞特性的細(xì)胞群體,它們具有自我更新能力,形成不同分化程度的腫瘤細(xì)胞。由于對常規(guī)化療藥物和現(xiàn)有的靶向治療耐藥,造成腫瘤增殖、轉(zhuǎn)移和耐藥。雖然對CSCs重要性的認(rèn)識不斷加深,但是對于其細(xì)胞起源仍存在爭議,究竟是源于正常干細(xì)胞發(fā)生的惡性轉(zhuǎn)化,還是已分化的腫瘤細(xì)胞獲得的自我更新能力目前還不清楚。KLF4在EC的發(fā)生發(fā)展中作為抑癌基因發(fā)揮重要的作用，推測KLF4低表達(dá)可使腫瘤細(xì)胞獲得類似于干細(xì)胞的特性,促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移和耐藥，這也為EC患者術(shù)后以及輔助化療、放療后的復(fù)發(fā)提供了一個(gè)探討依據(jù)和思路，目前暫無關(guān)于EC與干性轉(zhuǎn)化、KLF4之間的相關(guān)機(jī)制研究，其中的關(guān)系仍需進(jìn)一步證實(shí)。另外，腫瘤微環(huán)境對其影響也是有待探討的問題，而對其機(jī)制進(jìn)行深入研究，可進(jìn)一步研究藥物作用的新靶點(diǎn)，為EC的預(yù)防和治療提供新的方向和思路。隨著LNG-IUS、MET的廣泛應(yīng)用，還可為早期EC保留生育功能耐藥病例的研究提供一個(gè)方向。