從病毒性肝炎到肝細(xì)胞癌：外泌體microRNA的作用

毛元鵬， 于 哲， 宋阿倩， 魏紅山,

1 北京大學(xué)地壇醫(yī)院教學(xué)醫(yī)院 消化科， 北京 100015； 2 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京地壇醫(yī)院 消化科，北京 100015

1983年，Johnstone等[1]首先在綿羊成熟網(wǎng)織紅細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了外泌體的存在。隨著不斷地深入研究，人們發(fā)現(xiàn)外泌體并不只是簡單的細(xì)胞廢物碎片。細(xì)胞間物質(zhì)運輸既可完成細(xì)胞之間的物質(zhì)交換，同時也能充當(dāng)信息傳遞的方式。外泌體作為直徑40～100 nm的膜結(jié)合小囊泡，同時承擔(dān)著物質(zhì)運輸和信息傳遞雙重作用[2]。

microRNA(miRNA)是真核生物中的一類小型非編碼RNA，大小為19～25 nt，可在轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)基因表達(dá)[3]。有研究[4]發(fā)現(xiàn)，miRNA可以靶向糖基轉(zhuǎn)移酶mRNA，并誘導(dǎo)其進(jìn)行降解，進(jìn)而影響蛋白質(zhì)的糖基化修飾過程。外泌體中有著豐富的miRNA，不同細(xì)胞來源的外泌體，其所含有的miRNA種類也不盡相同。近年來，外泌體miRNA與人類疾病的聯(lián)系已逐步得到證實[5-6]。

肝細(xì)胞癌(HCC)是由肝實質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的惡性腫瘤，病毒性肝炎是HCC進(jìn)展的主要原因之一。HCC的早期診斷較為困難，近年來越來越多的研究集中于外泌體miRNA在HCC臨床診斷和治療中的作用。本文將主要介紹外泌體miRNA與病毒性肝炎相關(guān)HCC之間的聯(lián)系。

1 外泌體miRNA

1.1 外泌體的來源 目前已證實，外泌體能夠被各種類型的細(xì)胞釋放，如巨噬細(xì)胞、肝星狀細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、紅細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞等，并且存在于大多數(shù)生物體液中[7]。除了蛋白質(zhì)和脂質(zhì)外，在外泌體中還發(fā)現(xiàn)了各種核酸分子，包括DNA、mRNA、miRNA和其他非編碼RNA[8]。外泌體的產(chǎn)生源自細(xì)胞膜內(nèi)陷。細(xì)胞膜內(nèi)陷后形成早期內(nèi)體，早期內(nèi)體膜向內(nèi)出芽形成多泡體，并且同時加入了miRNA、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等選定物質(zhì)；而后，多泡體既可與細(xì)胞膜融合最終形成外泌體，也可與溶酶體融合進(jìn)行降解[9]。

1.2 外泌體miRNA的來源 miRNA從產(chǎn)生到進(jìn)入外泌體有著復(fù)雜精細(xì)的過程。細(xì)胞核中負(fù)責(zé)編碼miRNA的DNA序列在RNA聚合酶Ⅱ的催化下轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生初級miRNA(pri-miRNA)，生成的pri-miRNA在細(xì)胞核中被Drosha-DGCR8復(fù)合物切割繼而形成70～100 nt長度的前miRNA(precursor miRNA，pre-miRNA)。pre-miRNA在Exportin5的幫助下進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，經(jīng)Dicer復(fù)合物對其進(jìn)一步加工，而后成熟的雙鏈miRNA轉(zhuǎn)變?yōu)閱捂渕iRNA，隨即通過不同的分選方式進(jìn)入外泌體[10]。

2 外泌體miRNA在肝炎病毒復(fù)制與傳播過程中的作用

病毒性肝炎是世界范圍內(nèi)常見的疾病，主要由五種肝炎病毒引起：甲型、乙型、丙型、丁型、戊型。來源于感染肝炎病毒肝細(xì)胞的外泌體有助于病毒的傳播，并損害機(jī)體對病毒性肝炎的先天免疫反應(yīng)[11]。HAV能劫持宿主細(xì)胞內(nèi)體囊泡，并將其病毒顆粒包裝于所形成的外泌體中，以促進(jìn)自身復(fù)制和傳播[12]。早期有報道[13]稱，miR-199a-3p和miR-210(二者均可存在外泌體中)的表達(dá)上調(diào)，能夠有效抑制HBV復(fù)制。此外，在HBV感染者中，HBV編碼的miRNA(HBV-miR-3)能通過外泌體攜帶釋放進(jìn)入循環(huán)，而HBV-miR-3可抑制HBV復(fù)制和蛋白質(zhì)的產(chǎn)生[14]。

Ramakrishnaiah等[15]發(fā)現(xiàn)，HCV通過外泌體轉(zhuǎn)運，實現(xiàn)在肝細(xì)胞之間的傳播。Bukong等[16]也發(fā)現(xiàn)，從HCV及HCV感染者的肝細(xì)胞株Huh7.5分離的外泌體中存在HCV RNA，而外泌體miR-122能夠與進(jìn)入外泌體的HCV RNA、Ago2、HSP90結(jié)合形成復(fù)合物，增強(qiáng)HCV RNA穩(wěn)定性并促進(jìn)復(fù)制和傳播。此外，含有HCV的外泌體能夠通過STAT3-miR124軸誘導(dǎo)RUNXOR和RUNX1表達(dá)上調(diào)，從而幫助病毒逃避宿主免疫反應(yīng)[17]。機(jī)體感染HCV后，Toll樣受體3(TLR3)能夠激活肝巨噬細(xì)胞產(chǎn)生外泌體抗病毒miRNA，如miR-29。當(dāng)外泌體釋放并被其他肝細(xì)胞吸收后，其內(nèi)的抗病毒miRNA能夠誘導(dǎo)抗HCV反應(yīng)或直接靶向作用于HCV基因表達(dá)[18]。

3 外泌體miRNA對肝纖維化進(jìn)程的調(diào)控

隨著病毒性肝炎進(jìn)一步發(fā)展，肝臟出現(xiàn)纖維化表現(xiàn)，其特征是細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)過度沉積。肝星狀細(xì)胞(HSC)在肝纖維化過程中被激活，是整個纖維化過程的主要參與者。HSC能分泌外泌體，并且能被其他細(xì)胞釋放的外泌體激活。在靜止的HSC中，外泌體miR-214和miR-199a-5p在堿性螺旋-環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄因子1調(diào)節(jié)下高表達(dá)，能抑制結(jié)締組織生長因子(connective tissue growth factor, CCN)2的mRNA表達(dá)水平以及下游纖維化信號傳導(dǎo)，從而抑制纖維化進(jìn)展；而在激活的HSC中，外泌體miR-214和miR-199a-5p水平較低，CCN2表達(dá)升高，膠原蛋白1α沉積增加，從而促進(jìn)纖維化進(jìn)程[19-20]。通過使用棕櫚酸處理刺激肝細(xì)胞中外泌體的產(chǎn)生，發(fā)現(xiàn)外泌體中的miR-122、miR-24、miR-19b、miR3-4a和miR-192水平顯著增加；而HSC攝取棕櫚酸處理的肝細(xì)胞來源外泌體后，其纖維化相關(guān)基因表達(dá)顯著升高[21]。

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell, MSC)是一種多能干細(xì)胞，通過分泌多種細(xì)胞因子發(fā)揮作用。有報道[22]稱，MSC來源的外泌體miR-181-5p可以通過激活自噬來抑制肝纖維化進(jìn)展。最新的一項研究[23]表明，miR-618能通過外泌體從MSC轉(zhuǎn)移到肝星狀細(xì)胞系LX-2細(xì)胞內(nèi)，并且靶向負(fù)調(diào)控Smad4基因表達(dá)，抑制LX-2細(xì)胞的活力和遷移，從而緩解肝纖維化的進(jìn)展。與此類似的是，較早的研究[24]也發(fā)現(xiàn)，miR-192可以通過肝細(xì)胞衍生的HCV相關(guān)外泌體轉(zhuǎn)移至HSC內(nèi)，并上調(diào)轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGFβ1)水平進(jìn)而促進(jìn)HSC轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細(xì)胞。

4 外泌體miRNA對病毒性肝炎相關(guān)HCC增殖、轉(zhuǎn)移的影響

病毒性肝炎所致纖維化長期發(fā)展，最終可進(jìn)展成為肝硬化或HCC。

4.1 外泌體miRNA與HCC腫瘤微環(huán)境(tumor microenvironment, TME) TME由腫瘤細(xì)胞周圍的ECM、毛細(xì)血管、基底膜、活化的成纖維細(xì)胞和免疫細(xì)胞構(gòu)成，其有助于腫瘤的進(jìn)展。既往研究[25-26]已證實，TME中不同類型的基質(zhì)細(xì)胞可以通過轉(zhuǎn)移外泌體miRNA與腫瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞間通訊。在類似TME的活化LX-2細(xì)胞和HCC細(xì)胞共培養(yǎng)系統(tǒng)中，LX-2細(xì)胞中外泌體和miR-148a-3p水平均降低，促進(jìn)了HCC細(xì)胞的增殖和侵襲；而當(dāng)HCC細(xì)胞攝取過表達(dá)miR-148a-3p的外泌體后，腫瘤發(fā)展受到顯著抑制[27]。眾所周知，環(huán)境化學(xué)物質(zhì)可以誘導(dǎo)正常細(xì)胞向病理細(xì)胞的轉(zhuǎn)變。由亞砷酸鹽轉(zhuǎn)化的人肝上皮細(xì)胞L-02分泌的外泌體miR-155能夠誘導(dǎo)正常肝細(xì)胞中炎癥因子IL-6和IL-8高表達(dá)，而IL-6與亞砷酸鹽誘導(dǎo)的致癌作用密切相關(guān)[28]。

4.2 外泌體miRNA與癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞(cancer-associated fibroblasts, CAF) CAF可通過增加血管生成、增殖、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transformation, EMT)和逃避免疫監(jiān)視來促進(jìn)HCC進(jìn)展[29]?；罨腍SC是肝臟中CAF的主要來源。HCC細(xì)胞來源外泌體miR-21能直接靶向HSC內(nèi)腫瘤抑制基因PTEN，降低其翻譯產(chǎn)物磷酸化水平，導(dǎo)致HSC中PDK1/AKT信號通路激活，促進(jìn)HSC活化為CAF[30]。據(jù)報道[31]，高轉(zhuǎn)移性HCC細(xì)胞分泌的外泌體miR-1247-3p能直接靶向成纖維細(xì)胞內(nèi)的β-1,4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶Ⅲ(B4GALT3)，通過激活B4GALT3/β1-整合素/NF-κB軸，誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞活化為CAF，促進(jìn)HCC肺轉(zhuǎn)移。另外，由CAF分泌的外泌體miRNA也能夠影響TME內(nèi)HCC細(xì)胞的生長和表型[32]。一項研究[33]表明，CAF來源外泌體miR-150-3p的缺失極大地促進(jìn)了HCC的進(jìn)展，并且血漿低水平外泌體miR-150-3p的患者存活率顯著低于高水平患者。

4.3 外泌體miRNA與HCC細(xì)胞EMT 包括HCC在內(nèi)的癌轉(zhuǎn)移是一個多步驟過程。EMT是腫瘤細(xì)胞獲得轉(zhuǎn)移、侵襲能力的重要條件，其特征是上皮樣特征的喪失和間充質(zhì)樣屬性的獲得。外泌體miRNA能通過影響EMT過程間接影響HCC發(fā)展。miR-320a是一種抗腫瘤miRNA。Xie等[34]研究發(fā)現(xiàn)，miR-320a在HCC樣本和HCC細(xì)胞系中均顯著下調(diào)，而促癌基因c-Myc卻表達(dá)上調(diào)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，c-Myc是miR-320a的直接靶點，miR-320a能通過抑制c-Myc表達(dá)來抑制HCC的增殖和轉(zhuǎn)移[34]。miR-320a與HCC細(xì)胞EMT也有著重大關(guān)聯(lián)。近期的一項研究[35]發(fā)現(xiàn)，外泌體miR-320a可以通過與其直接下游靶標(biāo)PBX3結(jié)合來抑制絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路的激活，進(jìn)而抑制EMT過程，最終使HCC細(xì)胞的增殖、遷移受到抑制。該團(tuán)隊進(jìn)一步研究[35]發(fā)現(xiàn)，CAF來源外泌體中miR-320a水平顯著降低，miR-320a-PBX3-MAPK信號通路受到抑制，誘導(dǎo)了EMT發(fā)生以及細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶2和基質(zhì)金屬蛋白酶2的表達(dá)，促進(jìn)了HCC細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移。此外，使用TGFβ誘導(dǎo)HCC細(xì)胞系Hep3B細(xì)胞EMT發(fā)生，發(fā)現(xiàn)Hep3B細(xì)胞來源外泌體中miR-374a-5p水平顯著增加，并且促進(jìn)了HCC癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移；而在干擾miR-374a-5p表達(dá)后會抑制HCC癌細(xì)胞的增殖和遷移[36]。

4.4 外泌體miRNA與HCC腫瘤組織新生血管形成 成熟癌細(xì)胞往往通過循環(huán)途徑轉(zhuǎn)移至其他組織或器官，新生血管的形成對于癌組織的生長和轉(zhuǎn)移至關(guān)重要。Lin等[37]發(fā)現(xiàn)，HCC患者血清中miR-210水平與HCC組織中的微血管密度相關(guān)。進(jìn)一步的體內(nèi)、體外研究[38]發(fā)現(xiàn)，HCC細(xì)胞分泌的外泌體miR-210可以運輸至血管內(nèi)皮細(xì)胞中，靶向抑制SMAD4和STAT6基因，導(dǎo)致二者蛋白產(chǎn)物水平降低，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤組織血管生成。此外，HCC細(xì)胞分泌的外泌體miR-103也可以進(jìn)入血管內(nèi)皮細(xì)胞中，通過靶向抑制內(nèi)皮細(xì)胞-細(xì)胞接觸黏附分子VE-Cad、p120-catenin (p120)和ZO-1的表達(dá)，破壞內(nèi)皮細(xì)胞連接的完整性，從而增加血管通透性，促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移。

總而言之，外泌體miRNA在病毒性肝炎所致HCC的起始、形成、成熟和轉(zhuǎn)移整個過程中都有著重要作用(表1，圖1)。

表1 部分外泌體miRNA對HCC的影響

圖1 外泌體miRNA與病毒性肝炎相關(guān)HCC的關(guān)系

5 小結(jié)和展望

關(guān)于外泌體治療HCC的策略已經(jīng)有了大量研究，然而對于外泌體miRNA在病毒性肝炎所致HCC發(fā)生發(fā)展中的作用研究尚為有限，尤其是其在炎-癌轉(zhuǎn)化過程中的作用仍然需要進(jìn)一步探索。其他細(xì)胞來源外泌體在被病毒性肝炎感染的肝細(xì)胞攝取后，其內(nèi)所含miRNA對肝細(xì)胞內(nèi)糖基轉(zhuǎn)移酶基因及其mRNA表達(dá)水平的調(diào)節(jié)，可能是影響感染肝細(xì)胞向癌細(xì)胞轉(zhuǎn)變過程中表型和功能發(fā)生改變的重要因素。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：毛元鵬負(fù)責(zé)擬定寫作思路，撰寫論文；于哲、宋阿倩參與收集文獻(xiàn)，分析資料；魏紅山負(fù)責(zé)課題設(shè)計，指導(dǎo)撰寫論文并最終定稿。