穿孔素在婦產(chǎn)科疾病中的研究進(jìn)展

劉海飛，關(guān)德鳳，2，許靈波，張學(xué)紅，2*

高等生物的重要免疫防護(hù)機(jī)制是通過細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞如細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic T lymphocytes，CTL)細(xì)胞和NK細(xì)胞介導(dǎo)，誘發(fā)已病變的細(xì)胞發(fā)生凋亡來實(shí)現(xiàn)[1]。在體內(nèi)，細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞的途徑有兩種：① Fas/FasL途徑，由死亡受體介導(dǎo)；② 穿孔素(perforin，PRF)/顆粒酶(granzyme，Grz)途徑，由破損質(zhì)膜的PRF介導(dǎo)；其中PRF/Grz是主要的殺傷途徑[2]。隨著醫(yī)療科技水平的不斷發(fā)展，研究發(fā)現(xiàn)PRF參與人體多種病理生理過程，PRF的異常表達(dá)與子宮內(nèi)膜異位癥[3]、卵巢癌[4]、復(fù)發(fā)性流產(chǎn)[5]等疾病有關(guān)，本文就PRF在部分婦產(chǎn)科疾病中的研究進(jìn)展作一綜述，以期為PRF在婦產(chǎn)科疾病的診治方面提供新思路。

1 穿孔素簡介

1.1 穿孔素生物學(xué)特征

PRF是由PRF1基因編碼的一種糖蛋白，是細(xì)胞毒作用的效應(yīng)分子，與Grz協(xié)同作用，共同發(fā)揮免疫監(jiān)視、免疫調(diào)控的作用，屬于膜攻擊復(fù)合體/穿孔素(membrane attack complex/perforin，MACPF)家族[6]。PRF分子量約為56～75 KD，結(jié)構(gòu)類似于補(bǔ)體C9，由534個(gè)氨基酸組成，含有3個(gè)結(jié)構(gòu)域：N端MACPF結(jié)構(gòu)域、中間表皮生長因子結(jié)構(gòu)域及C端Ca2+結(jié)合結(jié)構(gòu)域[7]。PRF由CTL細(xì)胞、NK細(xì)胞、γδT細(xì)胞、巨噬細(xì)胞(macrophages，MΦ)及調(diào)節(jié)性T(regulatory T，Treg)細(xì)胞分泌，其中活化的CTL和NK細(xì)胞分泌占主要部分，并受多種細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)，IL-2、IL-4、IL-6、IL-7和干擾素(interferons，IFNs)等能促進(jìn)PRF表達(dá)；轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)可抑制PRF表達(dá)[8]。細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞主要通過PRF/Grz途徑發(fā)揮作用，一旦CTL和NK細(xì)胞受到抗原刺激與靶細(xì)胞結(jié)合，細(xì)胞毒性分泌顆粒就會(huì)流向免疫突觸，釋放大量PRF、Grz到突觸間隙，PRF結(jié)合到靶細(xì)胞膜上并寡聚形成孔隙允許Grz進(jìn)入，使靶細(xì)胞滲透壓改變，從而迅速觸發(fā)靶細(xì)胞凋亡性細(xì)胞死亡[9]。

1.2 穿孔素表達(dá)與疾病

PRF具有廣泛的生物學(xué)作用，在體內(nèi)骨髓、肺和淋巴等組織中均表達(dá)，生理情況下PRF表達(dá)水平低，但在病毒感染、腫瘤和移植排斥反應(yīng)時(shí)，PRF的表達(dá)明顯升高，這提示PRF與免疫密切相關(guān)，可能在不同的生理病理?xiàng)l件下發(fā)揮不同的免疫學(xué)功能。研究發(fā)現(xiàn)PRF表達(dá)異常減少或增多都會(huì)使機(jī)體免疫功能受損導(dǎo)致疾病的發(fā)生[10]。當(dāng)PRF表達(dá)減少時(shí)，可促進(jìn)子宮內(nèi)膜異位癥、卵巢癌等疾病的發(fā)展[3-4]；當(dāng)PRF異常增加時(shí)，會(huì)導(dǎo)致復(fù)發(fā)性流產(chǎn)等疾病的發(fā)生[5]。因此，從臨床的角度來看，能夠調(diào)節(jié)PRF的功能將非常有益，推測(cè)在PRF表達(dá)減少的疾病中添加PRF或增強(qiáng)其活性，在PRF表達(dá)增加的疾病中減少PRF表達(dá)或削弱其活性，將有利于疾病的治療。

2 穿孔素與婦產(chǎn)科疾病

2.1 穿孔素與子宮內(nèi)膜異位癥

子宮內(nèi)膜異位癥(endometriosis，EMs)是育齡期婦女常見的疾病，可導(dǎo)致痛經(jīng)、慢性盆腔痛、性交困難和不孕，臨床上因其癥狀不典型以及不能對(duì)所有患者都進(jìn)行有創(chuàng)的金標(biāo)準(zhǔn)腹腔鏡檢查而造成延遲診斷，導(dǎo)致EMs的診治效果不佳[11]。EMs病因及機(jī)制尚未完全闡明，研究證實(shí)EMs的發(fā)生有免疫學(xué)背景，如多克隆B淋巴細(xì)胞活化、T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞功能障礙、細(xì)胞凋亡受損以及NK細(xì)胞毒性異常，其中NK細(xì)胞毒性降低是造成機(jī)體免疫監(jiān)測(cè)失控、異位內(nèi)膜組織免疫逃逸的重要原因[12]。Yang HL等[3]研究通過模擬異位病灶局部免疫微環(huán)境，發(fā)現(xiàn)NK細(xì)胞PRF表達(dá)明顯減少，細(xì)胞毒作用降低；Schmitz T等[13]通過月經(jīng)杯采集月經(jīng)血，發(fā)現(xiàn)EMs患者月經(jīng)血中CD8+T細(xì)胞PRF的表達(dá)顯著下降，細(xì)胞毒性潛能降低；Lin X等[14]研究發(fā)現(xiàn),與在位子宮內(nèi)膜相比，異位病變血供不足，處于明顯缺氧環(huán)境中，缺氧可通過刺激TGF-β的分泌來抑制PRF表達(dá)，從而降低NK細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的細(xì)胞毒性，導(dǎo)致機(jī)體將異位子宮內(nèi)膜組織清除的能力降低。

以上研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)于癥狀不典型以及延遲診斷的EMs患者，可通過月經(jīng)杯采集檢測(cè)月經(jīng)血中細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞PRF的表達(dá)情況來輔助診斷EMs，推測(cè)細(xì)胞中PRF表達(dá)減少，細(xì)胞毒作用降低，導(dǎo)致EMs的發(fā)生發(fā)展。通過月經(jīng)血中細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞PRF表達(dá)來輔助診斷EMs的有效性和特異性有待進(jìn)一步考證，但為今后在EMs的診斷和治療上提供了新思路。

2.2 穿孔素與卵巢癌

卵巢癌在婦科惡性腫瘤中病死率居首位，大多數(shù)患者早期缺乏癥狀，確診病情時(shí)已進(jìn)展至晚期，經(jīng)放化療后5年生存率仍然相對(duì)較低[15]。近年來，免疫治療成為卵巢癌的新興療法，旨在通過增強(qiáng)患者免疫系統(tǒng)識(shí)別和攻擊腫瘤細(xì)胞的能力來控制腫瘤的發(fā)展。宿主免疫系統(tǒng)在控制腫瘤生長方面起著重要作用，正常情況下人體免疫系統(tǒng)能夠識(shí)別并清除腫瘤細(xì)胞，但腫瘤細(xì)胞可采取多種方法“逃避”機(jī)體的殺傷，這一過程稱為腫瘤免疫逃逸[16]。腫瘤免疫抑制微環(huán)境的形成可促進(jìn)腫瘤免疫逃逸的發(fā)生，PRF參與這一過程，當(dāng)腫瘤細(xì)胞持續(xù)存在時(shí)可抑制機(jī)體細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞PRF的表達(dá)，造成慢性PRF缺乏，進(jìn)而導(dǎo)致機(jī)體免疫監(jiān)視和免疫調(diào)節(jié)功能受損，為癌癥的發(fā)生發(fā)展創(chuàng)造有利條件[17]。Tanyi JL等[18]研究在樹突細(xì)胞疫苗聯(lián)用貝伐珠單抗和環(huán)磷酰胺治療卵巢癌的基礎(chǔ)上，通過再添加乙酰水楊酸和低劑量IL-2提高疫苗特異性T細(xì)胞應(yīng)答，發(fā)現(xiàn)小鼠卵巢癌模型中表達(dá)PRF的T細(xì)胞增加，接受此方案治療的小鼠存活時(shí)間能夠明顯延長。王慧峰等[19]研究發(fā)現(xiàn)MUC16在大多數(shù)卵巢癌細(xì)胞上過表達(dá)，是一個(gè)潛在的免疫治療靶點(diǎn)，通過慢病毒感染的方式制備靶向MUC16的CARNK-92細(xì)胞(MUC-BBz)，對(duì)MUC16陽性的卵巢癌細(xì)胞及其移植瘤具有強(qiáng)烈的抑制作用，MUC-BBz表現(xiàn)出抗原依賴性的激活能力，在識(shí)別腫瘤細(xì)胞表面的MUC16后可以促進(jìn)干擾素-γ(IFN-γ)和PRF分泌，IFN-γ可以調(diào)節(jié)抗腫瘤免疫反應(yīng)，PRF則可以直接介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的裂解。

以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，免疫療法的研究大多集中在免疫細(xì)胞對(duì)癌細(xì)胞的反應(yīng)上，因此可以通過添加PRF或提高細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞PRF表達(dá)來改善腫瘤免疫抑制微環(huán)境、清除癌細(xì)胞、延長癌癥患者生存期。PRF作為細(xì)胞毒作用的效應(yīng)分子可推動(dòng)新的治療組合的發(fā)展，為卵巢癌患者的治療提供新契機(jī)。

2.3 穿孔素與復(fù)發(fā)性流產(chǎn)

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(recurrent spontaneous abortion，RSA)病因復(fù)雜多樣，除已知的遺傳、解剖、內(nèi)分泌異常外，約50%的RSA原因不明，多認(rèn)為與免疫異常有關(guān)，又稱不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(unexplained recurrent spontaneous abortion，URSA)，主要與母胎界面免疫耐受失衡有關(guān)[20-21]。母體對(duì)胚胎的免疫耐受在胚胎種植及生長發(fā)育中起到至關(guān)重要的作用，蛻膜自然殺傷(decidual natural killer，dNK)細(xì)胞、MΦ及T細(xì)胞有利于母胎界面免疫耐受的形成。dNK細(xì)胞約占蛻膜常駐淋巴細(xì)胞的70%，可通過分泌PRF和Grz B發(fā)揮細(xì)胞毒作用參與母胎界面免疫耐受的調(diào)控過程[22]；PRF作為dNK細(xì)胞激活后釋放的一種重要細(xì)胞毒性介質(zhì)，使dNK細(xì)胞能夠發(fā)揮雙重作用，一方面對(duì)抗宮內(nèi)感染，另一方面在無危險(xiǎn)信號(hào)時(shí)不具有細(xì)胞毒性，有助于為胎盤形成創(chuàng)造有利環(huán)境[23]。蛻膜MΦ占蛻膜淋巴細(xì)胞的20%～30%，根據(jù)其表型可分為M1和M2型，正常情況下M2型占絕大多數(shù)，可通過分泌IL-10、TGF-β抑制PRF的過表達(dá)來發(fā)揮免疫抑制功能，有利于母胎界面免疫耐受的形成[24]。T細(xì)胞占蛻膜總淋巴細(xì)胞的10%～15%，其中CD4+T細(xì)胞受到抗原刺激后分化為Th0細(xì)胞，Th0進(jìn)一步分化為Th1、Th2、Th17和Treg細(xì)胞，Th1、Th17發(fā)揮免疫效應(yīng)，Th2、Treg發(fā)揮免疫抑制和調(diào)節(jié)作用[25]；若免疫抑制作用減弱，Th1/Th2與Th17/Treg比例上升，Th17分泌IL-17以及Th1分泌IL-2和IFNγ增多可導(dǎo)致PRF表達(dá)異常增加，細(xì)胞毒作用增強(qiáng)，母胎界面免疫耐受微環(huán)境平衡被打破導(dǎo)致流產(chǎn)的發(fā)生[26-27]。此外，NKT細(xì)胞是兼有NK和T細(xì)胞特征的一類免疫活性細(xì)胞，研究發(fā)現(xiàn)外周血NK(peripheral natural killer，pNK)細(xì)胞、NKT細(xì)胞可作為RSA患者免疫狀態(tài)的監(jiān)測(cè)指標(biāo)，當(dāng)機(jī)體pNK、NKT細(xì)胞異常時(shí)可導(dǎo)致免疫排斥，引發(fā)流產(chǎn)[28-29]。樸海蘭等[30]研究證實(shí)母胎界面滋養(yǎng)層細(xì)胞與蛻膜基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)體系能夠上調(diào)pNK細(xì)胞抑制型受體KIR2DL1的表達(dá)，下調(diào)殺傷性受體NKP44的表達(dá)，使pNK細(xì)胞PRF表達(dá)及其細(xì)胞毒性降低，形成母胎耐受；Huang Q等[31]通過實(shí)驗(yàn)證明PRF1是miR-30e的靶基因，上調(diào)miR-30e可以負(fù)向調(diào)控PRF1，降低PRF的表達(dá)，使pNK和dNK細(xì)胞的毒作用降低，有利于母胎耐受的形成；周鳴等[5]研究發(fā)現(xiàn)α-半乳糖基神經(jīng)酰胺(α-galactosylceramide，α-GC)可上調(diào)蛻膜NKT細(xì)胞PRF的表達(dá)導(dǎo)致流產(chǎn)，而α-GC刺激并不能引起PRF基因敲除小鼠胚胎丟失率的增高，表明過多的PRF可能是α-GC導(dǎo)致小鼠胚胎吸收率增高的原因。

以上研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PRF過表達(dá)導(dǎo)致流產(chǎn)的機(jī)制尚未闡明，一種可能的機(jī)制是蛻膜NKT細(xì)胞以PRF依賴性模式殺傷胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞從而導(dǎo)致流產(chǎn)，PRF是這一機(jī)制中的必要因素。因此推測(cè)PRF在控制滋養(yǎng)層細(xì)胞浸潤蛻膜組織、母胎界面免疫微環(huán)境建立及避免妊娠失敗等方面發(fā)揮了重要作用。

3 小結(jié)

綜上所述，機(jī)體免疫失衡PRF表達(dá)異常與子宮內(nèi)膜異位癥、卵巢癌、RSA等常見婦產(chǎn)科疾病有關(guān)，但在各種類型疾病中PRF的表達(dá)有所差異，免疫抑制因素過度抑制PRF表達(dá)可造成機(jī)體對(duì)致病原如異位子宮內(nèi)膜、卵巢癌細(xì)胞的殺傷清除能力減弱；PRF過度表達(dá)可導(dǎo)致機(jī)體對(duì)胚胎的細(xì)胞毒作用增強(qiáng)引發(fā)流產(chǎn)。分子生物學(xué)和免疫學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展讓我們更好地理解PRF表達(dá)與調(diào)控過程，也有越來越多的研究證實(shí)PRF的異常表達(dá)參與了多種婦產(chǎn)科疾病的發(fā)生發(fā)展，但目前多數(shù)研究停留在PRF與疾病的相關(guān)性上，并未涉及內(nèi)在的分子機(jī)制，使PRF治療疾病的有效性受到限制。因此，今后需要對(duì)PRF與婦產(chǎn)科疾病的發(fā)生機(jī)制方面進(jìn)行深入研究，不僅能進(jìn)一步加深對(duì)婦產(chǎn)科疾病的認(rèn)識(shí)，還可為PRF作為新的免疫治療靶點(diǎn)提供理論基礎(chǔ)。