環(huán)狀RNA絲氨酸/蘇氨酸蛋白擾動樣激酶1和微小RNA-214在缺血性腦卒中病人中的表達及意義

龐彥媚, 鄧有琦, 鄔宗國, 吳薇

缺血性腦卒中（IS）是一種常見的腦血管疾病, 主要是由于腦血管動脈狹窄或阻塞而引發(fā)的腦供血不足, 導致局部腦組織發(fā)生缺血、缺氧性壞死, 具有較高的致死率、致殘率和復發(fā)率[1］。目前臨床上治療方式主要包括溶栓、取栓、藥物治療、康復訓練等, 但其預后效果仍不能令人滿意, 有部分病人預后效果較差, 嚴重影響身體健康和生活質量, 有研究證實, 炎癥反應是IS中的關鍵環(huán)節(jié)[2］。目前, 生物標志物是醫(yī)學研究的熱點, 尋找有效的生物標志物對IS疾病的早期診斷和預后評估有重要意義。

環(huán)狀RNAs（circular RNA, CircRNAs）是一種通過外顯子環(huán)化而產生的內源性非編碼RNA, 有研究表明, CircRNAs存在機體的多種器官中, 而在大腦中的最為豐富, 隨著生物信息技術的發(fā)展, 越來越多的研究證實CircRNAs與多種生理和病理相關[3］。環(huán)狀RNA絲氨酸/蘇氨酸蛋白擾動樣激酶1（circular RNA tousled-like kinase 1, Circ TLK1）是CircRNAs中的一種, 源自反向剪接TLK1 mRNA, 位于2號染色體, 具有促進癌細胞增殖、遷移的作用[4］。微小RNA（microRNA, miRNA）是一類長度為20～25 nt的內源性非編碼小RNA, 通過與靶基因的3'序列特異性互補, 降解靶基因mRNA或抑制其蛋白翻譯, 進而調控多種生理和病理過程[5］。有研究證實, miRNA在細胞增殖、分化、免疫調節(jié)、炎癥反應和新血管生成中發(fā)揮重要作用[6］。miR-214是miRNA中重要的一員, 有研究表明, miR-214可抑制血管內皮細胞增殖, 增加細胞凋亡和炎性因子的表達水平[7］。但miR-214在IS早期診斷和預后評估中的研究鮮少, 因此, 本研究選取97例IS病人為研究對象, 探究Circ TLK1和miR-214在IS病人中的表達及意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2019年4月至2021年4月在廣元市中心醫(yī)院治療的97例IS病人為觀察組, 病人均符合《中國急性缺血性腦卒中診治指南2018》中關于IS的診斷標準[8］。其中男性51例, 女性46例, 年齡（59.51±6.72）歲, 范圍為40～70歲, 體質量指數(shù)（BMI）為（23.62±3.14）kg/m2；另選取85例健康體檢者為健康組, 男性46例, 女性39例, 年齡（60.31±6.83）歲, 范圍為41～72歲, BMI為（24.39±3.26）kg/m2。兩組病人基線資料相比差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）, 具有可比性。納入標準：①病人為第1次發(fā)??；②發(fā)病72 h內；③資料完整且積極配合治療者。排除標準：①合并心、肝、腎嚴重器官疾病；②患有精神系統(tǒng)疾病；③伴有全身或局部感染者；④ 3個月內進行過大型手術者。對觀察組病人神經功能評估, 其按照美國國立衛(wèi)生研究院卒中量表（NIHSS）進行, ≤4分為輕度組, 有33例；5～20分為中度組, 有45例；＞20分為重度組, 有19例。本研究內容均經病人及其近親屬了解并簽署知情同意書, 且符合《世界醫(yī)學協(xié)會赫爾辛基宣言》相關要求。

1.2 主要試劑和儀器Trizol試劑購自源葉生物；RNA逆轉錄試劑盒購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司；2xSYBR Green PCR Master Mix試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；引物由上海生工生物工程股份有限公司合成；PCR儀購自Bio-Rad公司。

1.3 收集資料收集病人的臨床資料, 包括性別、年齡、BMI、飲酒史、吸煙史、糖尿病史、高血壓史、冠心病史、空腹血糖、同型半胱氨酸（Hcy）、三酰甘油、總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、梗死體積、入院時NIHSS評分、發(fā)病到住院的時間。

1.4 方法

1.4.1 樣品采集 所有病人入組次日清晨采集空腹靜脈血5 mL, 在3 000 r/min條件下離心10 min, 取上清液于EP管中, 并保存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應（qRTPCR）檢測病人血清Circ TLK1和miR-214水平 在所有血清樣品中加入Trizol試劑提取總RNA, 并檢測RNA純度是否符合標準, 采用RNA逆轉錄試劑盒逆轉錄為互補DNA（cDNA）, 進一步按照2×SYBR Green PCR Master Mix試劑盒試驗說明書進行qRTPCR, 反應條件為94 ℃ 90 s；95 ℃ 32 s, 61 ℃ 35 s, 45個循環(huán)；72 ℃ 10 min。Circ TLK1和miR-214的內參分別為GAPDH、U6, 見表1。采用2-ΔΔCt法計算Circ TLK1和miR-214的相對表達水平。

表1 實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應（qRT-PCR）引物序列

1.5 治療方法在病人入院后給予抗血小板聚集劑、抗凝藥、腦保護劑和改善腦部循環(huán)等藥物治療, 并搭配康復治療, 在病情穩(wěn)定后出院。

1.6 隨訪對觀察組病人進行90 d的隨訪觀察, 隨訪方式采用電話、微信或門診。按照改良Rankin量表（modified rankin scale, mRS）對病人病情進行評估, mRS評分≤2分為預后良好組, mRS評分＞2為預后不良組。

1.7 統(tǒng)計學方法數(shù)據(jù)分析采用軟件SPSS 23.0進行, 以±s表示計量資料, 兩組間行獨立樣本t檢驗, 多組間比較采用單因素方差分析, 組間有差異進一步采用SNK-q檢驗。用例（%）表示計數(shù)資料, 并采用χ2檢驗。以多因素logistic回歸分析缺血性腦卒中病人預后的影響因素。以受試者操作特征曲線（ROC曲線）分析Circ TLK1和miR-214對缺血性腦卒中病人預后的預測價值。當P＜0.05時, 其差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩組病人血清Circ TLK1和miR-214的水平比較與健康組相比, 觀察組血清Circ TLK1（1.83±0.22比1.03±0.12）和miR-214（2.64±0.49比1.07±0.13）均顯著性上調（t=29.85、28.66, 均P＜0.001）。

2.2 不同神經功能的缺損程度病人血清CircTLK1和miR-214的水平比較與輕度組相比, 中度組和重度組病人血清Circ TLK1和miR-214均顯著性上調（P＜0.05）；與中度組相比, 重度組病人血清Circ TLK1和miR-214水平顯著上升（P＜0.05）。見表2。

表2 不同神經功能的缺損程度缺血性腦卒中97例血清Circ TLK1和miR-214的水平比較/±s

表2 不同神經功能的缺損程度缺血性腦卒中97例血清Circ TLK1和miR-214的水平比較/±s

注：Circ TLK1為環(huán)狀RNA絲氨酸/蘇氨酸蛋白擾動樣激酶1, miR-214為微小RNA-214, GAPDH、U6為內參基因。①與輕度組相比,P＜0.05。②與中度組相比,P＜0.05。

組別輕度組中度組重度組F值P值例數(shù)33 45 19 Circ TLK1/GAPDH 1.55±0.17 1.88±0.23①2.21±0.31①②51.35＜0.001 miR-214/U6 2.42±0.37 2.67±0.51①2.96±0.63①②7.33 0.001

2.3 不同預后病人臨床資料比較觀察組病人90 d預后隨訪結果顯示, 預后良好組63例, 預后不良組34例。兩組病人性別、年齡、BMI、吸煙史、飲酒史、冠心病史、高血壓史、糖尿病史、空腹血糖、總膽固醇、HDL-C、LDL-C之間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）, 與預后良好組相比, 預后不良組病人三酰甘油、Hcy、梗死體積、發(fā)病到住院的時間、入院時NIHSS評分、Circ TLK1、miR-214水平均顯著升高（P＜0.05）。見表3。

表3 不同預后缺血性腦卒中97例臨床資料比較

2.4 多因素logistic回歸分析IS病人預后的影響因素以有統(tǒng)計學意義的三酰甘油、Hcy、梗死體積、發(fā)病到住院的時間、入院時NIHSS評分、Circ TLK1、miR-214水平為自變量, 以IS病人是否發(fā)生預后不良為因變量進行多因素logistic回歸分析, 結果顯示, 入院時NIHSS評分高、發(fā)病到住院的時間長、Circ TLK1、miR-214高水平是IS病人預后不良的獨立危險因素（P＜0.05）, 見表4。

表4 多因素logistic回歸分析缺血性腦卒中97例預后的影響因素

2.5 ROC曲線分析Circ TLK1和miR-214對IS病人預后的預測價值ROC曲線分析結果顯示, Circ TLK1和miR-214對IS病人預后評估價值的曲線下面 積（AUC）分 別 為0.86、0.83, 靈 敏 度 分 別 為91.20%、67.60%, 特異度分別為74.60%、90.50%, 見表5。

表5 Circ TLK1和miR-214對缺血性腦卒中97例預后的預測價值

3 討論

隨著人口老齡化的加速, IS發(fā)病率不斷上升, IS及其并發(fā)癥已成為了全世界高死亡率和高致殘率的主要原因[9］。該疾病會導致大多數(shù)病人語言及智力障礙, 嚴重者甚至會造成死亡, 嚴重威脅人們的生命健康和生活質量[10］。因此, 早期準確診斷及預后評估對改善病人的預后情況是十分有必要的。

CircRNAs是一種新型的非編碼RNA, 通過5'和3'末端的連接共價閉合構成環(huán)狀結構, 在多種器官中表達, 尤其在大腦中豐富表達并調節(jié)生理病理過程, CircRNAs可能在IS疾病中參與神經炎癥、神經膠質細胞活化、血腦屏障破壞的過程[11］。Wu等[12］研究表明, 局灶性腦缺血再灌注小鼠腦組織中Circ TLK1水平顯著升高, Circ TLK1海綿化miR-335-3p起到抑制miR-335-3p活性的作用, 導致TIPARP表達增加以及神經元損傷發(fā)生惡化, 敲除Circ TLK1可明顯減少梗死體積、緩解神經元損傷。吳芳芳[13］研究發(fā)現(xiàn), Circ TLK1在小鼠缺血皮層組織中表達明顯升高, 進一步敲低Circ TLK1表達可顯著緩解腦神經功能損傷, 減少腦梗死體積, 并且改善梗死周圍區(qū)神經元可塑性。Song等[14］研究發(fā)現(xiàn), Circ TLK1在心肌缺血/再灌注損傷（IRI）小鼠模型中顯著上調, 當對小鼠進行沉默Circ TLK1之后, 受損的心功能指標顯著減輕, 梗死面積也相應地減少, 且表明上調的Circ TLK1可以通過靶向miR-214/受體相互作用蛋白激酶1介導的TNF信號通路加重心肌IRI。

miRNA是一類高度保守的非編碼小RNA, 其總量只占人類基因組的2%, 但可以調控人類約30%的基因, 調控多種疾病的發(fā)生發(fā)展[15］。miR-214位于人類1號染色體q24, 3的發(fā)動蛋白3基因中, 在炎癥反應、免疫調控、血管生成、腫瘤發(fā)展中占據(jù)重要地位[16］。miR-214不僅參與惡性腫瘤細胞的增殖、遷移、侵襲等過程, 在神經系統(tǒng)疾病中也發(fā)揮了重要作用[17］。張祎明等[18］研究表明, 七氟醚麻醉后的小鼠海馬組織中miR-214的表達明顯升高, 通過抑制miR-214表達能夠減輕小鼠海馬區(qū)的炎癥反應, 進而減輕小鼠認知功能的損傷。李春琴等[19］通過研究腦卒中大鼠模型發(fā)現(xiàn), 模型組miR-214表達水平較假手術組升高, 而針刺組炎癥和纖維化現(xiàn)象減輕, 且針刺組腦梗死體積減小, 針刺腦卒中大鼠可通過抑制miR-214及下游信號通路來減輕大腦冠狀部炎癥損傷。有學者發(fā)現(xiàn), miR-214在冠狀動脈疾病病人的血漿中表達豐富, 急性心肌梗死病人血漿miR-214濃度在發(fā)病早期較健康組顯著增加, 且血漿miR-214水平與病人的冠狀動脈狹窄嚴重程度呈正相關[20］。結合本研究, 與健康組相比, 觀察組血清Circ TLK1和miR-214均顯著性上調, 且其水平隨著IS神經功能的缺損程度的加重而升高, 提示Circ TLK1和miR-214可能參與了IS的發(fā)生和病理發(fā)展過程。觀察組和健康組病人三酰甘油、Hcy、梗死體積、發(fā)病到住院的時間、入院時NIHSS評分、Circ TLK1、miR-214水平之間差異有統(tǒng)計學意義, 且進一步多因素logistic回歸分析顯示, 入院時NIHSS評分高、發(fā)病到住院的時間長、Circ TLK1、miR-214高水平是IS病人預后不良的獨立危險因素, 提示對發(fā)生上述危險因素的病人應加強監(jiān)測, 及時干預治療, 預防不良預后情況的發(fā)生。ROC曲線分析結果顯示, Circ TLK1和miR-214對IS病人預后評估價值的AUC分別為0.86、0.83, 靈敏度分別為91.20%、67.60%, 特異度分別為74.60%、90.50%, 提示Circ TLK1和miR-214對IS病人預后情況有一定的評估價值, 可作為IS預后評估的輔助檢查指標。

綜上所述, Circ TLK1和miR-214在IS病人血清中呈高表達, 二者與病情發(fā)展和病人預后情況存在密切的關系, Circ TLK1和miR-214是IS病人預后不良的獨立危險因素, 對病人的預后具有一定的評估價值。因研究時間有限, 本研究樣本量較小, 未來還需大樣本來證實本研究結果。