維吾爾族成人急性髓系白血?。ǚ羌毙栽缬琢＜?xì)胞白血?。┕撬枘I母細(xì)胞瘤基因1和轉(zhuǎn)錄因子ETS-1表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系

阿依姆妮薩·阿卜杜熱合曼, 姑麗斯坦·阿不都熱西提, 阿斯亞·麥麥吐遜, 努爾比亞·阿布都熱西提

急性髓系白血?。ˋML）是一類高度異質(zhì)性疾病, 以髓系原始細(xì)胞增高為主要特征, 大多數(shù)AML病人病情急重, 預(yù)后兇險, 如不及時治療可危及生命[1-3］。腎母細(xì)胞瘤基因1（WT1）在生理及病理性造血過程中承擔(dān)著重要角色, 其表達(dá)水平與多種惡性血液疾病的發(fā)生、發(fā)展、治療密切相關(guān), WT1基因在絕大部分AML病人中均表現(xiàn)為異常高表達(dá), 其過度表達(dá)可作為“泛白血病”的分子標(biāo)志物, 具有十分重要的意義[4-7］。轉(zhuǎn)錄因子ETS-1屬于ETS轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一, 其在細(xì)胞增殖、分化及組織重構(gòu)等多種生物學(xué)過程中發(fā)揮著重要作用, 能夠調(diào)節(jié)尿激酶型纖維蛋白溶酶原活化物, 基質(zhì)金屬蛋白酶等一系列與細(xì)胞外基質(zhì)重建有關(guān)的基因表達(dá), 從而使細(xì)胞黏著性降低, 有利于腫瘤的浸潤生長和轉(zhuǎn)移[8-10］。目前, 國內(nèi)外對于轉(zhuǎn)錄因子ETS-1在維吾爾族成人新發(fā)AML（非M3）病人中的表達(dá)水平變化情況及意義的研究尚未見報道, 故本研究通過檢測WT1和ETS-1基因的表達(dá)水平, 旨在探討二者在AML（非M3）發(fā)生發(fā)展、療效評估中的意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2015年6月至2018年10月喀什地區(qū)第一人民醫(yī)院血液科收住的105例維吾爾族初診AML（非M3）病人為觀察組, 男60例, 女45例, 年齡（40.12±5.38）歲。選取同期于該院100例健康體檢者為對照組A, 及在該院治療的100例漢族初診AML（非M3）病人為對照組B。對照組A男61例, 女39例, 年齡（39.55±5.45）歲；對照組B男60例, 女40例, 年齡（39.74±5.62）歲。三組研究對象一般資料比較, 詳見下文“2.1”結(jié)果部分。

樣本量計算：利用PASS 15軟件, 設(shè)α=0.05, 把握度（power）=90%,OR=2, 雙側(cè)檢驗, 計算得到樣本量N1=N2=67例, 考慮可能有失訪人數(shù), 按20%算,N1、N2至少需要80例。因此, 本研究納入105例維吾爾族初診AML（非M3）病人為觀察組, 100例健康體檢者為對照組A、100例漢族初診AML（非M3）病人為對照組B。本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）病人均為初診者, 經(jīng)血常規(guī)、免疫分型及臨床癥狀等綜合診斷, 符合《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》[11］相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)且參照FAB分型標(biāo)準(zhǔn)；（2）病人均已成人；（3）所有研究對象及其近親屬知情同意, 并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）慢性粒細(xì)胞白血??；（2）合并惡性腫瘤；（3）合并嚴(yán)重感染；（4）入組前已接受相關(guān)治療者；（5）臨床資料不完整者。

1.3 治療方法AML（非M3）治療方法參照2011年版《成人急性髓系白血?。ǚ羌毙栽缬琢＜?xì)胞白血?。┲袊\療指南（2011年版）》[12］。根據(jù)病人年齡及體質(zhì)等具體情況接受相關(guān)誘導(dǎo)治療, 并在治療過程中檢測骨髓恢復(fù)情況對方案進(jìn)行相應(yīng)調(diào)整。

1.4 檢測指標(biāo)及方法

1.4.1 主要試劑與儀器 Real MasterMix試劑, 購自天根生化科技有限公司；日立超高速冷凍離心機(jī), 購自美國Thermo MicroMax公司；多功能酶標(biāo)儀, 購自上海首立實業(yè)有限公司。低溫高速離心機(jī), 購自美國Sigma公司；Trizol RNA提取試劑盒、TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒, 購自美國InvitRogen公司；實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）儀, 購自美國Bio-Rad公司；分光光度計, 購自上海舜宇恒科儀器有限公司；引物, 由上海生工生物工程股份有限公司合成等。

1.4.2 WT1和ETS-1 mRNA表達(dá)水平檢測 無菌條件下常規(guī)抽取對照組及AML（非M3）病人骨髓1～2 mL, 乙二胺四乙酸抗凝, -80 ℃凍存, 以qRT-PCR法檢測骨髓中WT1和ETS-1表達(dá)水平。以TRizol RNA提取試劑盒提取樣本總RNA, 紫外分光光度法鑒定各樣本提取的RNA純度和完整性。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將血清RNA逆轉(zhuǎn)錄合成互補(bǔ)DNA（cDNA）。WT1正向引物：5＇-ATGGAGAAGGGTTACAGCAC-3＇, 反向引物：5＇-ATGCTTGAATGAGTGGTTGG -3＇；內(nèi)參ABL正向引物：5＇-AAGCTGGTGGGCTGCAAATC-3＇, 反 向 引 物：5＇-GTTCCAACGAGCGGCTTCA-3＇。ETS-1正向引物：5'-TGATGTGGGCTGTGAATGAG-3', 反向引物：5'-TGAAGTAATCCGAGGTGTAACG-3'；內(nèi)參GAPDH正向引物：5'-GCCTTCTCCATGGTGGTGAA-3', 反 向 引 物：5'-GGTCGGTGTGAACGGATTTG-3'。引物序列均由上海生工生物工程股份有限公司合成。qRT-PCR反應(yīng)體系20 μL：2.5×Real MasterMix 8 μL；正反向引物各0.4 μL；熒光探針0.8 μL；MGB Taqman探針10 μL；cDNA樣本2 μL；加雙蒸水至20 μL。選擇qPCR反應(yīng)程序上機(jī), 共40個PCR循環(huán), qPCR擴(kuò)增條件：42 ℃, 30 min；94 ℃, 5 min；94 ℃, 45 s；60 ℃, 80 s。以2-ΔΔCt法計算mRNA相對表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法運用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS 20.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。計數(shù)資料以例（%）表示, 比較采用χ2檢驗；符合正態(tài)分布計量資料以±s表示, 三組間比較行單因素方差分析, 差異有統(tǒng)計學(xué)意義時兩兩比較采用SNK-q檢驗；不符合正態(tài)分布計量資料采用中位數(shù)（第25、第75百分位數(shù)）[M（P25,P75）］表示, 組間比較采用Wilcoxon秩和檢驗；多因素logistic回歸分析AML（非M3）的影響因素；并采用Kaplan-Meier方法描述生存曲線。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料比較觀察組與對照組年齡及性別比較, 差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。觀察組和對照組B白細(xì)胞計數(shù)明顯高于對照組A, 血小板計數(shù)及血紅蛋白明顯低于對照組A, 均差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）；觀察組和對照組B病人白細(xì)胞計數(shù)、血小板計數(shù)及血紅蛋白比較, 差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 三組一般資料比較

2.2 三組骨髓WT1、ETS-1表達(dá)水平比較三組骨髓WT1和ETS-1表達(dá)水平相比, 差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。觀察組和對照組B骨髓WT1和ETS-1表達(dá)水平明顯高于對照組A（P＜0.05）, 觀察組病人骨髓WT1、ETS-1表達(dá)水平明顯高于對照組B（P＜0.05）。見表2。

表2 三組骨髓WT1、ETS-1表達(dá)水平比較

2.3 logistic回歸分析AML（非M3）的影響因素將是否發(fā)生AML作為因變量（否=0, 是=1）, 將白細(xì)胞計數(shù)、血小板計數(shù)、血紅蛋白、WT1、ETS-1（均為連續(xù)變量）作為自變量納入模型。logistic回歸分析顯示, WT1、ETS-1均是AML（非M3）的危險因素（P＜0.05）。見表3。

表3 logistic回歸分析AML（非M3）的影響因素

2.4 骨髓WT1和ETS-1與病人預(yù)后關(guān)系105例AML（非M3）病人均完成1療程的誘導(dǎo)治療, 1療程后完全緩解67.62%（71/105）, 部分緩解22.86%（24/105）, 未緩解9.52%（10/105）。對病人進(jìn)行為期3年的隨訪, 期間有31例病人死亡（完全緩解2例, 部分緩解19例, 未緩解10例）, 20例病人隨訪期間疾病進(jìn)展, 3年無進(jìn)展生存率為51.43%（54/105）。

以AML（非M3）病人WT1、ETS-1中位數(shù)為界, 以WT1值＞0.71為WT1高表達(dá)組（48例）, 以ETS-1值＞0.92為ETS-1高表達(dá)組（57例）。采用Kaplan-Meier分析顯示, WT1低表達(dá)組3年無進(jìn)展生存率（68.42%）明顯高于高表達(dá)組（31.25%）（χ2=4.80,P=0.028）, ETS-1低表達(dá)組3年無進(jìn)展生存率（75.00%）明顯高于高表達(dá)組（31.58%）（χ2=6.56,P=0.010）。見圖1。

圖1 維吾爾族成人急性髓系白血?。ǚ羌毙栽缬琢＜?xì)胞白血?。?05例骨髓腎母細(xì)胞瘤基因1（WT1）和轉(zhuǎn)錄因子ETS-1表達(dá)的生存曲線：A為WT1；B為ETS-1

3 討論

AML是髓系造血干細(xì)胞惡性疾病, 以骨髓與外周血中原始和幼稚髓性細(xì)胞異常增生為主要特征, 目前認(rèn)為白血病的發(fā)生、發(fā)展與多種相關(guān)基因的表達(dá)失?；颍ê停┮职┗蚴Щ钣嘘P(guān), 可能是遺傳學(xué)和環(huán)境因素共同作用的結(jié)果, 臨床表現(xiàn)為貧血、出血、感染和發(fā)熱及代謝異常等, 多數(shù)病人病情急重, 如不及時治療?？晌＜吧黐13-14］。AML的治療難度大且易復(fù)發(fā), 其治療以化療和造血干細(xì)胞移植為主要手段, 與化療相比, 造血干細(xì)胞移植可有效地提高生存率, 并且在一定程度上有可能根治白血病[15-16］。

WT1最初是從腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞中分離出來的, 是抑癌基因也是一種癌基因, 可與多種造血調(diào)控因子相互作用, 具有增強(qiáng)或抑制目的基因轉(zhuǎn)錄的作用, 調(diào)控造血細(xì)胞的增殖、凋亡以及分化[17-18］。WT1在白血病的發(fā)病機(jī)制中起著癌基因的作用, 可導(dǎo)致細(xì)胞分化障礙, 誘導(dǎo)耐藥, 抑制凋亡, 在絕大多數(shù)AML病人的外周血或骨髓中存在高表達(dá), 但在正常人群中微量表達(dá), 且AML病人WT1 SNP rs16754不同基因型在性別分布上存在差異, 對AML其他臨床特征沒有影響[9］。AML過度表達(dá)可作為“泛白血病”的分子標(biāo)志, 臨床上, 其表達(dá)情況可用于判斷病人是否需要造血干細(xì)胞移植及微小殘留病灶（MRD）的療效, 而MDR1基因與白血病的多藥耐藥現(xiàn)象相關(guān), AML病人MDR1和WT1表達(dá)水平存在相關(guān)性[6］。竇翠云等[19］研究指出, WT1基因在AML病人的表達(dá)水平明顯高于正常骨髓, 與此研究結(jié)果相似, 本研究中, 觀察組骨髓WT1表達(dá)水平明顯高于對照組A和對照組B, 提示W(wǎng)T1基因可能參與AML（非M3）的發(fā)生及發(fā)展進(jìn)程, 在維吾爾族AML（非M3）病人中同樣表現(xiàn)為明顯的升高。

ETS-1是從鳥類白血病病毒E26中提取出來的原癌基因c-ETS-1的表達(dá)產(chǎn)物, 發(fā)揮著轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用, 故稱轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子, 是ETS家族具有代表性的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子, 也是其發(fā)現(xiàn)最早研究最多的成員之一。ETS-1主要是通過調(diào)節(jié)一些與基質(zhì)降解有關(guān)酶類等基因的表達(dá)來參與組織重構(gòu)過程, 是介導(dǎo)組織纖維化的重要轉(zhuǎn)錄因子, 在淋巴細(xì)胞發(fā)育、血管形成、炎癥、腫瘤的生長和侵襲轉(zhuǎn)移等方面具有重要作用, 相關(guān)研究表明, ETS-1是血管形成過程中必需的調(diào)節(jié)因子, 在乳腺癌等多種腫瘤疾病中表現(xiàn)為高表達(dá), 并證實其有促進(jìn)血管形成作用, 參與腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移過程[12, 20］。本研究結(jié)果顯示, 觀察組病人ETS-1表達(dá)水平明顯高于對照組A和對照組B, 表明ETS-1可能在AML（非M3）的發(fā)生發(fā)展中起著一定作用。本研究結(jié)果還顯示, 維吾爾族骨髓WT1、ETS-1表達(dá)水平高于漢族病人, 提示骨髓WT1、ETS-1表達(dá)可能存在一定的民族差異性, 導(dǎo)致民族差異的原因可能是由于不同群體有各自不同的優(yōu)勢等位基因從而造成遺傳學(xué)上存在一定的差異, 但由于WT1、ETS-1在AML中的研究較少, 其在不同種族之間的表達(dá)仍需更多的研究驗證。logistic回歸分析顯示, WT1、ETS-1均是影響AML發(fā)生危險因素, 提示兩者可能也存在調(diào)控作用, 參與AML的發(fā)生、發(fā)展過程, 臨床檢測應(yīng)該對兩者給予一定重視。另應(yīng)用K-M分析顯示, WT1、ETS-1低表達(dá)組生存率高于高表達(dá)組, 說明WT1、ETS-1異常高表達(dá)可能與病人預(yù)后有關(guān), 提示兩者可能作為評估預(yù)后生物標(biāo)志物。

綜上所述, 維吾爾族成人AML（非M3）病人骨髓WT1和ETS-1水平呈高表達(dá), 二者與疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān), 可能作為臨床治療和療效評估的參考指標(biāo)。但由于本研究選取時間較短, 今后還需擴(kuò)大樣本容量, 深入探討WT1和ETS-1的相互關(guān)系及其參與AML（非M3）的具體調(diào)控機(jī)制。