高效液相色譜法測定不同產(chǎn)地拳參中沒食子酸、兒茶素、綠原酸的含量

任增良，唐連祥，王永兵

（湖州中科營養(yǎng)與健康創(chuàng)新中心，浙江省 湖州市 313000）

中藥拳參為蓼科多年生草本植物拳參（Polygonum bistortaL.）的根莖［1］，具有清熱解毒、消腫止血之功效，用于赤痢、熱瀉、肺熱咳嗽、癰腫、口舌生瘡、吐血、痔瘡出血、毒蛇咬傷等癥。研究表明，拳參主要藥理作用有抗炎抑菌［2］、抗氧化［3］、抗腫瘤［4］、保護心血管系統(tǒng)［5］等。拳參中含有豐富的酚類化合物，其中代表性的有沒食子酸、兒茶素、綠原酸等［6］，這些酚類成分大多具有抗病原微生物、抗氧化的作用［7，8］，可作為評價拳參質(zhì)量的指標性成分。

2020年版《中國藥典》中采用沒食子酸作為拳參含量測定的檢測指標成分。由于中藥成分的復(fù)雜性及藥理作用的多樣性，多成分的檢測更符合中藥整體作用的特點?；诖?，本研究建立同時測定拳參中沒食子酸、兒茶素和綠原酸3個指標性成分含量的高效液相色譜法，以期為拳參質(zhì)量評價提供參考。

1 儀器與試劑

島津LC-20A高效液相色譜儀（日本島津公司）；Shimadzu Inertsil ODS-SP色譜柱（4.6 mm ×150 mm， 5 μm）；BT 25S 十萬分之一分析天平（德國賽多利斯公司）；KH-500DB超聲提取器（昆山市超聲儀器有限公司）；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋（國華電器有限公司）。

沒食子酸對照品（批號：C17D10C105977，純度98%，上海源葉生物科技有限公司）；兒茶素對照品（批號：P21J11F118380，純度98%，上海源葉生物科技有限公司）；綠原酸對照品（批號：MUST-19030620，純度99.39%，成都曼斯特生物科技有限公司）；甲醇、乙腈、乙醇均為色譜純；磷酸為分析純；水為超純水。

從多個主產(chǎn)區(qū)收集得到18批拳參藥材，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)楊念云教授鑒定為蓼科植物拳參（Polygonum bistortaL.）的干燥根莖。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Shimadzu Inertsil ODS-SP （4.6 mm ×150 mm， 5 μm）；流動相：0.04%磷酸溶液（A）-乙腈（B）；梯度洗脫程序：0～5 min，0 → 1% B；5～10 min，1% → 5% B；10～40 min，5% → 8% B，柱后運行10 min回到起始梯度；流速：0.8 mL/min；檢測波長：0～32 min，270 nm；32～40 min，325 nm；進樣體積：5 μL；柱溫：40 °C。對照品溶液、供試品溶液色譜圖見圖1。

圖1 對照品溶液（A）和供試品溶液（B）的HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of reference solution（A）and sample solution（B）

2.2 對照品溶液的制備

分別精密稱取沒食子酸、兒茶素和綠原酸對照品適量，置于5 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，得到濃度分別為0.448 mg/mL、0.414 mg/mL和0.842 mg/mL的混合對照品儲備液。

2.3 供試品溶液的制備

精密稱定0.6 g拳參粉末（過60目篩），置于具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇20 mL，稱定重量，超聲處理（功率：140 W，頻率：100 kHz）40 min，冷卻至室溫后補足失重，搖勻，0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系考察

精密吸取“2.2”項下各對照品儲備液，用甲醇逐步稀釋，配成系列濃度梯度。精密吸取上述各溶液5 μL，按“2.1”項下色譜條件進行測定，記錄峰面積，以對照品的進樣濃度為橫坐標X，峰面積為縱坐標Y，繪制標準曲線，得回歸方程、相關(guān)系數(shù)（r）和線性范圍，將對照品溶液濃度稀釋至約3倍信噪比的濃度（S/N=3），即為檢測限（LOD）；約10倍信噪比的濃度（S/N=10）即為定量限（LOQ）。結(jié)果見表1。

表1 回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍及檢測限和定量限Tab.1 Regression equation， correlation coefficient， linear range， LOD and LOQ

由表5可知，沒食子酸在4.48～179.2 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，其檢測限和定量限分別為7.2 ng/mL和23.9 ng/mL。兒茶素在4.14～165.6 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，其檢測限和定量限分別為82.8 ng/mL和310.5 ng/mL。綠原酸在8.42～505.2 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，其檢測限和定量限分別為12.6 ng/mL和42.1 ng/mL。

2.4.2 精密度考察

精密稱取同一批拳參藥材粉末，按“2.3”項下方法制備樣品溶液，精密吸取供試品溶液5 μL，按“2.1”項下色譜條件進樣分析，進行不同日期，不同操作人員和不同色譜柱的精密度考察。測得沒食子酸、兒茶素和綠原酸含量的RSD均小于3%，表明精密度良好。

2.4.3 重復(fù)性考察

精密稱取同一批拳參藥材粉末，按“2.3”項下方法分別制備高、中、低3個濃度水平的樣品溶液，每個濃度平行3份。精密吸取供試品溶液5 μL，按“2.1”項下色譜條件進樣分析，測得3個濃度水平下沒食子酸、兒茶素和綠原酸含量的RSD均小于3%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.4 加樣回收試驗

精密稱取同一批已知含量的拳參藥材粉末0.25 g，分為高、中、低3個水平，每個水平平行3份。分別按照拳參中沒食子酸、兒茶素和綠原酸含量的50%、100%、150%加入對照品，按“2.3”項下方法平行制備9份供試品溶液。精密吸取供試品溶液5 μL，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，計算3種成分的加樣回收率及RSD值，結(jié)果見表2～4。

由表2～4可知，沒食子酸、兒茶素和綠原酸的加樣回收率范圍均在85%～105%之間，其RSD值均≤3%，說明該方法加樣回收率良好。

表2 沒食子酸的回收率Tab.2 Recovery rate of gallic acid

表3 兒茶素的回收率Tab.3 Recovery rate of catechin

表4 綠原酸的回收率Tab.4 Recovery rate of chlorogenic acid

2.5 穩(wěn)定性考察

取同一批拳參樣品，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，分別于制備后 0 h，12 h，24 h和 48 h，按“2.1”項下色譜條件測定各成分含量，計算3個指標成分的含量，結(jié)果見表5。

表5 穩(wěn)定性試驗結(jié)果Tab.5 Results of stability test

由表5可知：48 h內(nèi)拳參樣品中沒食子酸、兒茶素和綠原酸含量平均值分別為1.806 mg/g，1.990 mg/g和12.61 mg/g，RSD分別為0.54%，0.24%和0.39%，表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6 樣品分析

取不同批次的拳參樣品，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，精密吸取供試品溶液5 μL，按“2.1”項下色譜條件測定各成分含量，計算3個指標成分的含量，測定6次，取平均值，結(jié)果見表6。

由表6可知：（1）3個成分中綠原酸含量最高，平均含量為7.16 mg/g，沒食子酸和兒茶素較低，平均含量分別為0.98 mg/g和1.09 mg/g；（2）成分含量存在產(chǎn)地差異，來自甘肅的藥材各成分含量明顯高于其余產(chǎn)地。

表6 不同產(chǎn)地拳參含量測定結(jié)果Tab.6 Contents of gallic acid， catechin and chlorogenic acid in P. bistorta from different habitats （mg/g）

為進一步探討產(chǎn)地對成分含量的影響，以沒食子酸、兒茶素及綠原酸的含量及總含量為指標，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入統(tǒng)計軟件SIMCA 14.0（瑞典Umetrics公司）對18批次拳參的產(chǎn)地與含量進行主成分分析（Principal component analysis， PCA），結(jié)果見圖2。圖中每個點代表一個樣本，以不同形狀區(qū)分不同的產(chǎn)地。從圖上作直觀分析，可知同一產(chǎn)地的拳參樣品能相對聚集，而不同產(chǎn)地的樣品相對分離，表明成分含量存在顯著產(chǎn)地差異。

圖2 不同產(chǎn)地拳參主成分分析圖Fig.2 Principal component analysis of P. bistorta from different habitats

3 討論

本研究采用單因素分析方法對拳參樣品的提取條件，例如提取溶劑（甲醇、70%甲醇、50%甲醇、乙醇、70%乙醇、50%乙醇），提取時間（20min、40 min、60 min、120 min），提取方式（超聲提取、熱回流提取、冷浸提取），提取溶劑體積（20 mL、50 mL、75 mL、100 mL），提取次數(shù)等進行了考察。最終確定樣品制備條件為：精密稱定0.5 g拳參粉末（過60目篩），置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇20 mL，稱定重量，超聲處理（功率：140 W，頻率：100 kHz）40 min，冷卻至室溫后補足失重，搖勻，0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

本研究對色譜條件進行了一系列優(yōu)化。采用紫外全波長檢測器對沒食子酸、兒茶素和綠原酸進行全波長掃描，沒食子酸的最大吸收波長為270 nm，兒茶素的最大吸收波長為278 nm，綠原酸的最大吸收波長是325 nm。結(jié)合3個成分的保留時間，使用可變波長檢測器（Variable wavelength detector，VWD）將吸收波長定位 0～32 min為 270 nm，32～40 min為325 nm，以便能更準確地對3個成分進行同時檢測。此外，對色譜柱、流動相、柱溫、流速等參數(shù)進行了優(yōu)化，最終確定色譜條件如下：流動相為0.04%磷酸溶液（A）-乙腈（B）；洗脫梯度為0～5 min，0 → 1% B；5～10 min，1% → 5% B；10～40 min，5% → 8% B；流速為0.8 mL/min；柱溫40 ℃；檢測波長為270 nm（0～32 min）和325 nm（32～40min）。

含量測定結(jié)果顯示，所測3個酚類成分之間含量差異較大，其中綠原酸含量最高，為1.269～15.601 mg/g。各成分之間含量差異也較大，18批樣品中，沒食子酸含量最大值為3.107 mg/g，可達最小值0.15 mg/g的20倍，兒茶素的含量最大值可達最小值的4倍，綠原酸的含量最大值可達最小值的12倍。不同產(chǎn)地拳參中成分含量差異大，可能與生長地理位置、生長環(huán)境、氣溫、土壤、光照、雨量、采收時期、加工運輸?shù)纫蛩赜嘘P(guān)。

4 結(jié)論

2020年版《中國藥典》［1］中拳參含量測定項規(guī)定含沒食子酸不得少于0.12%，本研究中18批樣品沒食子酸含量為0.15～3.107 mg/g，均符合藥典標準，表明該方法可作為綜合評價拳參質(zhì)量的參考。對3個指標成分及總量進行主成分分析，發(fā)現(xiàn)拳參中主要成分存在顯著產(chǎn)地差異。