HS-SPME-GC-MS對(duì)百合中游離態(tài)和鍵合態(tài)揮發(fā)性成分分析

孫佳寧，連希希，孫伶俐，段正超，王聯(lián)芝

（湖北民族大學(xué) 化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，湖北 恩施 445000）

百合是百合屬多年生藥食兩用植物［1］，主要種植在甘肅、江蘇、湖南、浙江等省份［2］。百合鱗莖的藥用歷史悠久［3］，最早出現(xiàn)于《神農(nóng)本草經(jīng)》中［4］。傳統(tǒng)上，國(guó)人常把百合作為鎮(zhèn)靜劑、抗炎劑、止咳劑以及一般的補(bǔ)藥使用［5］。當(dāng)前，百合多用于治療失眠［6］、癌癥［7］及肺部疾病等［8］。百合中的化學(xué)成分主要包含揮發(fā)油類、皂苷類、多糖類、多酚類等。揮發(fā)油作為一類重要組成成分，具有抗菌、抗炎、抗氧化等多種藥理作用［9］，還可用于日化、保健、美容等領(lǐng)域。游離態(tài)的揮發(fā)性成分可以被人體直接感知，而鍵合態(tài)的揮發(fā)性成分因糖苷鍵的存在不易被人體感知，需要通過酸解或酶解釋放出糖苷配基，才能實(shí)現(xiàn)增香而被人體感知［10］。近年來，關(guān)于新鮮百合中皂苷類、多糖類、多酚類等物質(zhì)提取的報(bào)道逐漸增多，但對(duì)其揮發(fā)性成分的研究較少。其中，關(guān)于百合飲片揮發(fā)性成分的研究甚為少見，已有的報(bào)道多為對(duì)百合飲片游離態(tài)揮發(fā)性成分的檢測(cè)，對(duì)鍵合態(tài)揮發(fā)性成分的研究極為罕見。

此外，揮發(fā)油廣泛存在于中藥材中，是芳香中藥最具代表性的一類活性成分。我國(guó)中藥材資源豐富且歷史悠久，在預(yù)防和治療慢性疾病等方面具有潛在的開發(fā)價(jià)值。因此，深入研究揮發(fā)油對(duì)于中藥材的開發(fā)利用意義重大。

目前，揮發(fā)性成分的分析常采用氣質(zhì)聯(lián)用、電子鼻、氣相色譜-嗅聞等技術(shù)。頂空固相微萃取技術(shù)靈敏、快速、無污染［11］，克服了傳統(tǒng)采樣方法中成本偏高、耗時(shí)久和有機(jī)溶劑用量大等問題。然而，樣品加熱溫度、體積、萃取時(shí)間和樣品基質(zhì)等實(shí)驗(yàn)參數(shù)，特別是固相微萃取纖維的選擇性是影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重要因素。因此，多數(shù)情況下使用組合吸附劑效果較好，如DVB/CAR/PDMS［12］。HS-SPME技術(shù)自推出以來，廣泛應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域［13］，如：食品、香料、水體及環(huán)境污染物等的檢測(cè)［14-16］。HS-SPME常與氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用，成為了一種近乎完美的現(xiàn)代分析方法［17］。朱文政等［18］采用該方法對(duì)紅燒肉的揮發(fā)性成分進(jìn)行分析，共測(cè)定出93種揮發(fā)性物質(zhì)，醛類及酯類是其主要風(fēng)味物質(zhì)。劉金敏等［19］利用HS-SPME-GC-MS對(duì)姜科香辛料的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行了分析，檢測(cè)出7類揮發(fā)性成分，萜烯類是姜科香辛料的特征風(fēng)味物質(zhì)。余遠(yuǎn)江等［20］分析了水產(chǎn)原料的揮發(fā)性風(fēng)味成分，通過GC-MS鑒定出57種揮發(fā)性物質(zhì)，主要成分為醇類及醛類。

為了能夠更全面地了解百合中的揮發(fā)性成分，本實(shí)驗(yàn)采用水蒸氣蒸餾法和煎煮法兩種方法進(jìn)行成分提取，并通過HS-SPME-GC-MS對(duì)兩種方法提取的百合揮發(fā)性成分進(jìn)行定性分析，采用內(nèi)標(biāo)法對(duì)各組分進(jìn)行定量分析，以期為百合揮發(fā)性成分的進(jìn)一步開發(fā)利用提供參考。

1 材料與儀器

1.1 樣品與試劑

樣品：百合（產(chǎn)地湖南邵陽(yáng)），甘肅漢草品匯中藥飲片有限公司。

正戊烷、乙酸乙酯、甲醇、氯化鈉、檸檬酸、磷酸氫二鈉、二氯甲烷、乙醚、仲辛酮（AR級(jí)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；Almonds β-D-葡萄糖苷酶（美國(guó)Sigma-Aldric公司）；Amberlite XAD-2樹脂（20～60目，美國(guó)Supelco公司）；C7～C30正構(gòu)烷烴（分析純，美國(guó) Sigma-Aldrich 公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

6890N/5975MSD氣質(zhì)聯(lián)用儀（美國(guó)Agilent公司）；CONCEPT多功能自動(dòng)化樣品前處理自動(dòng)進(jìn)樣器（德國(guó)PAS公司）；50/30 μm DVB/CAR/PDMS 固相微萃取頭（美國(guó)Supelco公司）；20 mL帶隔墊（1.5 mm）頂空螺紋口樣品瓶和A型磁力攪拌子；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）。

2 方法

2.1 游離態(tài)揮發(fā)性成分檢測(cè)前處理

將百合粉碎，精確稱取兩份60 g樣品分別置于500 mL燒瓶中。分別采用水蒸氣蒸餾法和煎煮法提取12 h，分別收集提取液進(jìn)行抽濾。各取濾液40 mL，加入8 μL仲辛酮（內(nèi)標(biāo)物）及8 g NaCl混和均勻，均分成四等份置于頂空螺紋口樣品瓶中，進(jìn)行三次平行實(shí)驗(yàn)以檢測(cè)百合中游離態(tài)揮發(fā)性成分。

2.2 鍵合態(tài)揮發(fā)性成分檢測(cè)前處理

稱取50 g Amberlite XAD-2大孔吸附樹脂，用紗布包裹后放入索氏提取器中加熱回流。先后加入200 mL正戊烷、200 mL乙酸乙酯和200 mL甲醇，各回流12 h，甲醇中浸漬。以甲醇為溶劑，將預(yù)處理后的大孔吸附樹脂進(jìn)行濕法裝柱（Φ32 mm×457 mm），去離子水沖洗至無味。為使樣品與樹脂充分鍵合，取2.1節(jié)中水蒸氣蒸餾法提取后的濾液400 mL，以3 mL·min-1的流速流過該柱；采用600 mL去離子水沖洗色譜柱，除去水溶性糖和酸；采用600 mL乙醚-戊烷（1∶1，V/V）除去游離態(tài)揮發(fā)性成分；最后再用600 mL甲醇洗脫除去糖苷類物質(zhì)。收集洗脫液并旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至近干（水浴溫度為35℃），少量多次將其溶于30 mL pH為 5.2的0.1 mol·L-1檸檬酸-0.2 mol·L-1Na2HPO4緩沖液中。用90 mL二氯甲烷-戊烷（1∶1，V/V）分三次萃取以除去可能殘存的游離態(tài)揮發(fā)性成分；將Almonds β-D-葡萄糖苷酶600 mg加入萃取得到的水相中，放入恒溫箱中（37℃）酶解48 h［21］；隨后取40 mL酶解后的樣品，加入8 μL仲辛酮及8 g NaCl混合均勻，將其均分成四等份放入頂空螺紋口樣品瓶中，平行測(cè)定三次以檢測(cè)百合中鍵合態(tài)揮發(fā)性成分。

2.3 HS-SPME-GC-MS分析揮發(fā)性成分

2.3.1 儀器條件

頂空固相微萃取條件：平衡時(shí)間和溫度分別為30 min和50℃；老化時(shí)間5 min；萃取時(shí)間和溫度分別為40 min和50℃；解析時(shí)間為1 min。

氣相色譜條件：J&W DB-5MS毛細(xì)管色譜柱（30 m × 250 μm × 0.25 μm）；進(jìn)樣口溫度250℃；程序升溫（起始溫度60℃，保持2 min；以8℃·min-1升溫至220℃；保持20 min）；載氣為氦氣；流速1 mL·min-1；不分流進(jìn)樣；掃描方式為全掃描；調(diào)諧文件為標(biāo)準(zhǔn)調(diào)諧。

質(zhì)譜條件：離子源溫度230℃；離子化方式電子轟擊（EI）；電子能量70 eV；質(zhì)量范圍45～550 u。

2.3.2 定性與定量分析方法

化合物的定性分析通過檢索NIST08數(shù)據(jù)庫(kù)，將測(cè)定的保留指數(shù)與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的保留指數(shù)進(jìn)行比對(duì)，參照標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖確定。

以仲辛酮的乙醇溶液（0.9761 g·L-1）作為內(nèi)標(biāo)物，采用內(nèi)標(biāo)法對(duì)百合揮發(fā)性成分進(jìn)行定量分析。根據(jù)仲辛酮的質(zhì)量濃度及各成分與仲辛酮峰面積之間的比值，采用下式計(jì)算揮發(fā)性成分的含量。

式中：xi為成分含量，單位為μg·L-1；fi為待測(cè)成分（i）對(duì)內(nèi)標(biāo)物（S）的質(zhì)量校正因子，令其為1；Ai為化合物的峰面積；As為內(nèi)標(biāo)物的峰面積；ms為內(nèi)標(biāo)化合物的質(zhì)量濃度，單位為μg·L-1。

3 結(jié)果與分析

3.1 水蒸氣蒸餾法提取百合揮發(fā)性成分分析

采用水蒸氣蒸餾提取百合中的揮發(fā)性成分，并通過Amberlite XAD-2大孔吸附樹脂對(duì)糖苷類物質(zhì)進(jìn)行鍵合，利用Almonds β-D-葡萄糖苷酶對(duì)其進(jìn)行酶解處理，并采用HS-SPME-GC-MS技術(shù)對(duì)百合揮發(fā)性成分進(jìn)行檢測(cè)，游離態(tài)和鍵合態(tài)揮發(fā)性成分的總離子流圖如圖1和圖2所示。通過質(zhì)譜定性分析和內(nèi)標(biāo)法定量分析，百合揮發(fā)性成分中游離態(tài)及鍵合態(tài)的HS-SPME-GC-MS 鑒定結(jié)果及各化合物的含量見表1和表2。

表1 百合（水蒸氣蒸餾法）游離態(tài)揮發(fā)性化合物Tab.1 Free volatile compounds from lily （steam distillation）

表2 百合（水蒸氣蒸餾法）鍵合態(tài)揮發(fā)性化合物Tab.2 Bonded volatile compounds from lily （steam distillation）

圖1 百合（水蒸氣蒸餾法）游離態(tài)香氣成分的總離子流圖Fig. 1 Total ion flow diagram of free aroma components in lily（steam distillation）

圖2 百合（水蒸氣蒸餾法）鍵合態(tài)香氣成分的總離子流圖Fig. 2 Total ion flow diagram of the bonded aroma components in lily （steam distillation）

采用水蒸氣蒸餾法提取技術(shù)共檢測(cè)出22種游離態(tài)成分，其中包括醛類、酮類、醇類、酯類、酚類及酸類，以酯類，醛類為主；7種鍵合態(tài)成分，包括酯類、酮類、醇類、酚類及呋喃類，以酯類為主。酚類和呋喃類化合物在百合中含量較低，酚類物質(zhì)僅在游離態(tài)中檢測(cè)出一種，呋喃類物質(zhì)僅在鍵合態(tài)中檢測(cè)出一種。

3.2 煎煮法提取百合揮發(fā)性成分分析

采用煎煮法提取百合中的揮發(fā)性成分，并采用HS-SPME-GC-MS技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，游離態(tài)揮發(fā)性成分的總離子流圖如圖3所示。通過質(zhì)譜定性分析和內(nèi)標(biāo)法定量分析，HS-SPME-GC-MS鑒定結(jié)果及各化合物的含量見表3。

表3 百合（煎煮法）游離態(tài)揮發(fā)性化合物Tab.3 Free volatile compounds from lily （decoction method）

圖3 百合（煎煮法）游離態(tài)香氣成分的總離子流圖Fig. 3 Total ion flow diagram of free aroma components in lily（decoction method）

采用煎煮法提取技術(shù)共檢測(cè)出19種游離態(tài)成分，包括烷烴、烯烴、炔烴、醇類、醛類、酮類、酯類及酸酐共8類物質(zhì)。其中檢測(cè)出醇類化合物2種，烷烴類物質(zhì)3種，是游離態(tài)中最主要的成分。酯類物質(zhì)則含量很少。

3.3 不同提取方法所得的百合揮發(fā)性成分的對(duì)比分析

本實(shí)驗(yàn)采用GC-MS對(duì)水蒸氣蒸餾和煎煮法提取百合中的揮發(fā)性成分進(jìn)行分析，并對(duì)兩種方法所提取的揮發(fā)性化合物進(jìn)行對(duì)比。百合揮發(fā)性成分中不同類別成分的含量及相對(duì)含量見表4。

表4 各類物質(zhì)的含量及相對(duì)含量Tab.4 The content and relative content of various substances

通過檢測(cè)百合中游離態(tài)及鍵合態(tài)的揮發(fā)性成分，發(fā)現(xiàn)采用水蒸氣蒸餾法提取共確定了26種化合物，包括酯類（5種）、醛類（9種）、醇類（4種）、酮類（3種）、酚類（2種）、酸類（2種）及呋喃類（1種）。其中游離態(tài)揮發(fā)性化合物22種，鍵合態(tài)揮發(fā)性化合物7種。采用煎煮法提取共確定了19種化合物，包括醇類（2種）、烷烴類（3種）、醛類（3種）、酸酐類（1種）、酮類（4種）、醚類（2種）、烯烴類（1種）、炔烴類（2種）及酯類（1種）。說明百合中游離態(tài)及鍵合態(tài)揮發(fā)性成分的檢測(cè)采用HS-SPME-GC-MS方法可行。HS-SPME是一種不需要溶劑的萃取方法，結(jié)合GCMS分析百合中的揮發(fā)性成分有較好的效果。

從揮發(fā)性成分的分析結(jié)果來看，采用水蒸氣蒸餾法提取的百合飲片中游離態(tài)和鍵合態(tài)成分中均含有倍半萜醇類物質(zhì)柏木腦。柏木腦具有獨(dú)特的香氣，常被應(yīng)用于香料、食品、化妝品、室內(nèi)清香劑和消毒劑［22］，多項(xiàng)研究表明柏木腦還具有抑菌［23］、抗腫瘤［24］、抗焦慮［25］、抗炎及鎮(zhèn)痛［26］等藥理活性。很多酯類都具有果香氣味，在檢測(cè)到的揮發(fā)性成分中，有一定含量的鄰苯二甲酸二丁酯及鄰苯二甲酸二異丁酯，此類成分常被用作增塑劑，推測(cè)分析結(jié)果中的這類物質(zhì)可能是環(huán)境或包裝等方面的殘留物［20］。正己醛是游離態(tài)中的一種主要成分，其主要由亞油酸氧化產(chǎn)生，呈清香的青草香味，其具有抗炎、鎮(zhèn)痛的藥理作用［27］。壬醛主要來源于油酸的氧化，呈清香、果香味等氣味。而反式-2，4-癸二烯醛（11%）有青香、柑桔、脂肪等的香氣。2，3-二氫苯并呋喃是鍵合態(tài)中的一種主要成分，其具有抗炎、抗腫瘤、抗病毒及抗真菌等活性［28］，一直被藥理學(xué)家及合成化學(xué)家重點(diǎn)研究。從中華卷柏中分離得到的具有許多藥理活性的新木脂素類化合物同樣含有2，3-二氫苯并呋喃，從米蘭葉子中分離出的化合物也含有該成分，研究發(fā)現(xiàn)2，3-二氫苯并呋喃具有抗腫瘤活性［29］。

通過煎煮法提取的百合飲片游離態(tài)成分中，醇類是其最主要的成分，其可從脂氧合酶等途徑產(chǎn)生［30］，正丙醇相對(duì)含量達(dá)50.58%，可應(yīng)用于香料添加、日化用品、醫(yī)藥工業(yè)等方面；對(duì)甲基苯甲醛（10.66%）具有溫柔的花香和杏仁香氣味，可廣泛應(yīng)用于藥物、精細(xì)化工等領(lǐng)域；烴類揮發(fā)性物質(zhì)具有清香和甜香，正十七烷（6.03%）廣泛應(yīng)用于化妝品領(lǐng)域、異丁烷（5.35%）可用于催化等領(lǐng)域［31］。

通過水蒸氣蒸餾法及煎煮法提取得到的百合揮發(fā)性成分?jǐn)?shù)量相近，但在種類上有所差異。煎煮法主要提取出了烷烴類、烯烴類、炔烴類、酸酐類、醚類物質(zhì)，而用水蒸氣蒸餾法則沒有提取出這些類物質(zhì)，推測(cè)可能與樣品的處理方式不同有關(guān)。水蒸氣蒸餾法提取的溫度較高，一些易揮發(fā)和熱不穩(wěn)定的成分可能會(huì)因此損失掉，提取種類較少；但水蒸氣蒸餾法提取得到的揮發(fā)性成分藥理活性較豐富，應(yīng)用范圍較廣泛。分析百合揮發(fā)性成分時(shí)，煎煮法提取較簡(jiǎn)便，這兩種方法各具優(yōu)勢(shì)，兩者互補(bǔ)，亦可采用兩種方式提取，以獲得更全面完整的揮發(fā)性成分信息。

與新鮮百合花中揮發(fā)性化合物相比，百合飲片中揮發(fā)性化合物數(shù)量較少，二者在組成上有很大差異。孫春陽(yáng)等［32］對(duì)新鮮百合花中的揮發(fā)油進(jìn)行提取，共鑒定出37種化合物，主要成分為醇類、酮類、烷類、酯類等。張輝秀等［33］對(duì)不同品種的百合花揮發(fā)性成分進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)不同香型的百合花揮發(fā)性成分存在較大差異，其中β-羅勒烯和芳樟醇為濃香型百合花致香的關(guān)鍵成分。與本實(shí)驗(yàn)中百合飲片揮發(fā)性成分相比，化合物的類別基本相同，但新鮮百合花的揮發(fā)性成分更多，推測(cè)是因?yàn)槟承┓悬c(diǎn)較低、易揮發(fā)的物質(zhì)在由新鮮百合到百合飲片的加工過程中極易損失。

4 結(jié)論

通過對(duì)水蒸氣蒸餾法及煎煮法提取百合中揮發(fā)性成分的比較分析，發(fā)現(xiàn)兩種方法提取得到的百合揮發(fā)性成分有很大差異。因此在分析百合揮發(fā)性成分時(shí)，可以采用兩種方法提取，將獲得的GC-MS分析結(jié)果相結(jié)合，可以獲得更全面具體的揮發(fā)性成分信息。本文首次對(duì)百合中的鍵合態(tài)揮發(fā)性成分進(jìn)行研究報(bào)道，以期為百合進(jìn)一步的開發(fā)利用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為改進(jìn)百合飲片的制作工藝提供參考。