自噬在慢性腎病血管鈣化中的作用研究

康 婷毛海霞林佳如朱婷婷張麗玲張冬梅吳蔚樺歐三桃*

(1.西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院腎病內(nèi)科,四川 瀘州 646000; 2.四川省腎臟疾病臨床醫(yī)學研究中心,四川 瀘州 646000)

慢性腎病(chronic kidney disease, CKD)是心血管疾病獨立的風險因素,反過來心血管疾病也是CKD患者高死亡率的首要原因.有研究發(fā)現(xiàn)血管鈣化是導致CKD患者心血管疾病發(fā)病率和死亡率呈倍數(shù)增長的主要危險因素[1]。目前認為血管鈣化是一種血管平滑肌細胞由收縮表型向成骨樣表型轉(zhuǎn)分化的生物學過程[2]。CKD血管鈣化的發(fā)生機制非常復雜,近期有研究發(fā)現(xiàn)尿毒癥患者鈣化的腎動脈較移植腎的腎動脈自噬相關蛋白明顯增加,自噬可能參與了尿毒癥患者血管鈣化的形成[3]。由于自噬是一種動態(tài)的調(diào)節(jié)系統(tǒng),越來越多的研究發(fā)現(xiàn)自噬在血管鈣化中的作用會受疾病過程、誘發(fā)因素以及周圍微環(huán)境等多種因素的影響,甚至在血管鈣化中有保護性自噬和非保護性自噬兩種觀點,其機制尚不完全清楚[4]。目前,自噬與CKD血管鈣化的關系研究較少,自噬在血管鈣化中的作用很復雜,因此本研究旨在通過體內(nèi)、外實驗探討自噬在高磷誘導的CKD血管鈣化中的激活情況及其作用,為CKD血管鈣化的防治提供新策略。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

選用SPF級SD雄性大鼠30只,6周齡,體重250～280 g,購自西南醫(yī)科大學城北校區(qū)動物中心[SCXK(川)2018-0017],于西南醫(yī)科大學城北校區(qū)動物房飼養(yǎng)[SYXK(川)2018-0065]。該實驗經(jīng)西南醫(yī)科大學實驗動物倫理委員會審批(IACUCSWMU2020262),并遵守實驗動物的3R原則。

1.1.2 細胞

大鼠胸主動脈平滑肌細胞株(A7R5),購自中國科學研究院(上海細胞庫)。

1.2 主要試劑與儀器

腺嘌呤(V900471,美國Sigma公司);1.8%高磷飲食(北京科奧協(xié)力);鈣含量測定試劑盒(C004-2-1,南京建成生物有限公司);β-甘油磷酸鈉(βglycerophosphate, β-GP)及氯喹(chloroquine, CQ)(G9422,C6628,美國Sigma公司);雷帕霉素(rapamycin,RAP)及 3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine, 3-MA)(S1039,S2767,Selleck公司);α-SMA多克隆抗體(BS70000,南京巴傲得生物科技有限公司);兔抗RUNX2多克隆抗體(bs-20003R,北京博奧森生物技術有限公司);Beclin-1兔單克隆抗體、LC3B兔單克隆抗體及鬼筆環(huán)肽(Phalloidin)(#3495,#3868,#8953,美國CST公司)。光學顯微鏡(Nikon公司);全自動生化分析儀(西門子,德國)。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組及造模

將SD大鼠隨機分為對照組(Control,15只)和CKD血管鈣化模型組(CKD,15只)。模型組大鼠給予腺嘌呤混懸液(200 mg/(kg·d))灌胃+1.8%高磷飲食,而對照組大鼠予以相應等體積的生理鹽水及正常飲食,持續(xù)灌胃給藥6周。

1.3.2 取材

成模后用代謝籠收集24 h尿液用于檢測24 h尿蛋白,取材當天使用1%戊巴比妥鈉按照40 mg/kg劑量腹腔注射麻醉大鼠,取下腔靜脈血檢測生化指標;取右腎做常規(guī)石蠟包埋、切片;游離胸腹主動脈,部分做常規(guī)石蠟包埋切片,部分新鮮組織做鈣含量測定。

1.3.3 生化指標檢測

采用自動生化分析儀檢測血尿素氮(BUN)、肌酐(Scr)、血鈣(Ca)、血磷(P)及24 h尿蛋白。

1.3.4 HE染色

常規(guī)脫蠟復水,蘇木素染5 min后,1%鹽酸酒精分色2 s,0.5%氨水返藍1 min,75%乙醇2 s,1%伊紅30 s,脫水透明封片。

1.3.5 茜素紅染色

石蠟切片常規(guī)脫蠟復水,滴加茜素紅S液染色30 min,用雙蒸水洗5 min共3次,常規(guī)脫水、透明、封片。

1.3.6 Masson染色

按照Masson染色試劑盒說明書進行操作。常規(guī)脫水、透明、封片,在光鏡視野下觀察拍攝。

1.3.7 鈣含量測定

大鼠主動脈組織勻漿后取上清液,按照試劑盒說明書加入工作液及上清液,混勻后使用酶標儀測定OD值,BCA法測定主動脈總蛋白濃度,主動脈鈣含量(mmol/g pro)=(測定OD值-空白OD值)/(標準OD值-空白OD值)×標準品濃度(1 mmol/L)/待測樣本蛋白濃度(mmol/g)。

1.3.8 免疫組化法檢測胸腹主動脈蛋白的表達

常規(guī)脫蠟水化,修復抗原,蒸餾水浸泡5 min,3% H2O2孵育15 min,山羊血清室溫封閉20 min。分別滴加一抗(RUNX2、α-SMA、LC3B、Beclin-1),4℃冰箱過夜,依次滴加相應的二抗、辣根酶標記鏈霉卵白素工作液,37℃孵育20 min,DAB顯色液,顯微鏡下觀察顯色情況,棕黃色或棕褐色為陽性表達。蒸餾水充分沖洗,蘇木素復染20 s,脫水,透明,封片。

1.3.9 細胞培養(yǎng)及分組

將大鼠胸主動脈平滑肌細胞(aortic smooth muscle cell, ASMC)培養(yǎng)在含有15%胎牛血清DMEM高糖完全培養(yǎng)基的基礎培養(yǎng)基中作為正常組(Normal),加入10 mmol/L β-GP刺激誘導細胞鈣化的細胞作為高磷組(β-GP)。干預分組:用25 μmol/L CQ干預自噬的降解過程,預處理30 min后再分別加入基礎培養(yǎng)基和含有10 mmol/L β-GP的培養(yǎng)基,分為氯喹組(CQ)、高磷+氯喹組(β-GP+CQ),并與正常組(Normal)、高磷組(β-GP)做對照。再分別用100 nmol/L RAP及5 mmol/L 3-MA干預自噬強弱,預處理細胞30 min后分別加入含有10 mmol/L β-GP的培養(yǎng)基,分為高磷+雷帕霉素組(β-GP+RAP)、高磷+3-甲基腺嘌呤組(β-GP+3-MA),并與正常組(Normal)、高磷組(β-GP)作對照。將不同時間點的不同組別細胞做好標記后置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3.10 細胞免疫組化

將細胞固定,破膜,滴加10%正常山羊血清封閉液室溫下20 min,,滴加α-SMA抗體或RUNX2抗體,于4℃冰箱孵育過夜,滴加二抗工作液,室溫孵育20 min,滴加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液,室溫孵育20 min, DAB溶液顯色,PBS沖洗后蘇木素復染細胞核5 min,PBS洗凈后吸水紙吸干爬片上的液體,封片。

1.3.11 細胞免疫熒光

將細胞固定,破膜,滴加10%山羊血清封閉30 min,滴加LC3B抗體,于4℃冰箱過夜,滴加10%山羊血清稀釋的熒光二抗孵育1 h,避光滴加鬼筆環(huán)肽染細胞質(zhì),再滴加DAPI細胞核,避光清洗后,封片,熒光顯微鏡下觀察。

1.3.12 鈣含量測定

1.5 mL 0.6 mol/L鹽酸進行細胞脫鈣,24 h后收集細胞上清液,根據(jù)鈣測試盒說明書(微板法)測定鈣含量;PBS洗滌細胞后加入1.5 mL 1 mol/L NaOH/0.1% SDS裂解細胞,并提取細胞上清液,BCA法測定蛋白含量,結果以鈣含量/蛋白含量(mmol/g pro)表示。

1.3.13 Western blot

裂解并提取細胞蛋白,依照碧云天公司的BCA蛋白定量試劑盒說明書測定上清液蛋白濃度,SDSLoading buffer進行稀釋,干煮,配膠,上樣,在不同濃度的SDS-PAGE凝膠中電泳,轉(zhuǎn)膜,封閉,加入LC3B、Beclin-1、RUNX2及α-SMA孵育,在4℃冰箱過夜,再用二抗稀釋液室溫孵育1～2 h,顯色液顯色,曝光檢測。

1.3.14 電鏡

收集細胞后依次0.5%戊二醛、3%戊二醛、1%四氧化鋨固定,丙酮脫水,環(huán)氧樹脂滲透液進行滲透,包埋,制成超薄切片后,依次用醋酸鈾、枸櫞酸鉛染色,室溫下染15～20 min,透射電鏡下觀察。

1.4 統(tǒng)計學方法

用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學處理。計量資料用平均數(shù)±標準差(±s)表示,組間均數(shù)比較采用獨立樣本t檢驗或單因素方差分析,方差不齊時采用Kruskal-Wallis H檢驗,Pearson做兩個變量之間的相關性分析,以P＜0.05為有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩組大鼠生化指標比較

與對照組大鼠相比,CKD鈣化組大鼠Scr、BUN、P及24 h尿蛋白均有不同程度的升高,Ca降低,差異具有統(tǒng)計學意義。見圖1。

圖1 兩組大鼠生化指標的比較Figure 1 Comparison of biochemical indexes in two groups of rats

2.2 兩組大鼠腎病理改變

對照組大鼠腎小球大小正常,腎小管及腎間質(zhì)結構與形態(tài)無明顯異常。CKD鈣化組大鼠腎HE染色結果顯示腎小球及腎小管中可見大量的棕黃色物質(zhì)沉積,腎小球囊腔有輕度擴張,部分腎小管擴張,腎間質(zhì)纖維化;Masson染色結果顯示:腎小球基底膜增厚,同時可見少數(shù)的腎小球硬化,腎間質(zhì)廣泛藍染的膠原纖維。見圖2。

圖2 兩組大鼠腎HE及Masson染色Figure 2 HE and Masson staining of kidney in two groups of rats

2.3 兩組大鼠主動脈鈣化情況

HE染色可見對照組大鼠主動脈染色均勻,血管壁完整,彈性纖維連續(xù);而CKD鈣化組大鼠主動脈中膜層顏色加深,彈性纖維明顯斷裂,血管平滑肌細胞排列紊亂。茜素紅染色結果顯示與對照組相比,CKD鈣化組大鼠主動脈中膜層廣泛分布紅染的鈣結節(jié)沉積。此外,CKD組主動脈鈣含量也較對照組更高,差異具有統(tǒng)計學意義。見圖3。

圖3 兩組大鼠胸腹主動脈鈣化情況Figure 3 Calcification of thoracoabdominal aorta in two groups of rats

2.4 大鼠主動脈成骨樣分化及自噬相關蛋白表達

免疫組化結果顯示:對照組大鼠主動脈平滑肌細胞質(zhì)中可見α-SMA蛋白均勻分布,而RUNX2無明顯表達。CKD大鼠動脈血管壁中膜彈性纖維斷裂,中膜層平滑肌細胞可見α-SMA蛋白表達明顯減少,而RUNX2蛋白表達增加,差異具有統(tǒng)計學意義。LC3B、Beclin-1是目前最常用的自噬相關蛋白標記物,可用于靜態(tài)觀察自噬的激活情況。免疫組化結果顯示:對照組大鼠動脈血管壁各層細胞中均有少量的LC3B、Beclin-1蛋白表達,而CKD大鼠動脈血管壁中膜層平滑肌細胞排列紊亂,棕黃色染色明顯加深,LC3B、Beclin-1蛋白表達增強,差異具有統(tǒng)計學意義。見圖4。

圖4 兩組大鼠主動脈免疫組化染色Figure 4 Immunohistochemical staining of aorta in two groups of rats

2.5 相關性分析

Pearson相關分析顯示,大鼠主動脈鈣含量與Beclin-1及LC3B蛋白表達呈正相關關系,RUNX2蛋白與Beclin-1及LC3B蛋白表達也呈正相關關系。見圖5。

圖5 主動脈鈣含量及蛋白的相關性分析Figure 5 Correlation analysis of calcium content and protein in aorta

2.6 β-GP誘導大鼠ASMC鈣化及成骨樣分化

使用10 mmol/L β-GP刺激ASMC 3、5、7 d后,茜素紅染色結果顯示β-GP組較正常組(Normal)有明顯的橘紅色鈣化結節(jié),且隨時間的的延長逐漸增多。免疫組化結果也顯示,隨著時間的延長,β-GP組較正常組細胞質(zhì)內(nèi)α-SMA表達逐漸減少,而分布在細胞核內(nèi)的RUNX2表達則逐漸增加,以上結果提示β-GP成功誘導了ASMC鈣化,并逐漸向成骨樣分化,且具有時間依賴性。見圖6。

圖6 兩組大鼠ASMC不同時間點茜素紅染色及免疫組化結果Figure 6 Alizarin red staining and immunohistochemical results of ASMC in two groups at different time points

2.7 β-GP誘導大鼠ASMC自噬增強

β-GP刺激大鼠ASMC 48 h后,免疫熒光結果顯示:兩組細胞紅色熒光信號的平滑肌細胞質(zhì)骨架及藍色熒光信號的細胞核結構清晰,β-GP組較正常組綠色熒光信號LC3B表達明顯增強,Merge后顯示LC3B呈斑點狀分布在細胞質(zhì)中(見圖7A)。透射電鏡檢測結果顯示:與正常組相比,β-GP組大鼠ASMC細胞質(zhì)中可見溶酶體與自體吞噬體融合,自噬小體明顯增多,提示β-GP誘導的ASMC鈣化模型中存在明顯的自噬(見圖7B)。Western blot結果顯示:β-GP組較正常組LC3BII蛋白相對表達量增加,加入溶酶體抑制劑CQ抑制自噬的降解過程,可見β-GP+CQ組較β-GP組LC3BII表達明顯增多,同時β-GP+CQ組較CQ組LC3BII表達也明顯增多(見圖7C)。以上結果提示β-GP對大鼠ASMC的刺激促進了自噬激活過程。

圖7 β-GP誘導自噬在ASMC中的激活情況Figure 7 β-GP induced autophagy activation in ASMC

2.8 增強及抑制自噬對大鼠ASMC鈣化的影響

為進一步研究自噬對ASMC鈣化表型的影響,加入自噬抑制劑3-MA及激活劑RAP干預7 d后觀察其變化。結果見圖8,Western blot顯示β-GP組較正常組ASMC中LC3BII、Beclin-1蛋白表達升高,加入3-MA后LC3BII、Beclin-1蛋白表達下降,說明3-MA成功地抑制了自噬過程;反之,加入RAP后LC3BII、Beclin-1表達明顯升高,說明RAP成功地誘導了自噬增強。同時,β-GP組較正常組α-SMA蛋白表達減少,RUNX2蛋白表達升高,β-GP+3-MA組與β-GP組比較,α-SMA蛋白表達明顯進一步減少,而RUNX2蛋白表達明顯進一步升高;反之,β-GP+RAP組與β-GP組比較α-SMA蛋白表達明顯升高,而RUNX2蛋白表達明顯減少(見圖8A)。免疫組化顯示β-GP組較正常組ASMC內(nèi)α-SMA蛋白表達減少,而細胞核內(nèi)RUNX2蛋白增多,加入3-MA后α-SMA蛋白表達明顯進一步減少,RUNX2蛋白仍有大量表達,而加入RAP后α-SMA蛋白有所增加,RUNX2蛋白表達減少(見圖8B)。茜素紅染色結果顯示正常組未見明顯鈣化結節(jié),β-GP組可見均勻分布的橘紅色鈣化結節(jié),β-GP+3-MA組橘紅色鈣化結節(jié)明顯增多,而β-GP+RAP組只散在分布少許的鈣化結節(jié)(見圖8C)。鈣含量測定結果也與此一致,與正常組相比,β-GP組大鼠動脈平滑肌細胞鈣含量增多,加入3-MA后鈣含量進一步升高,而加入RAP后鈣含量明顯降低(見圖8D)。以上結果表明抑制自噬可以加劇β-GP誘導的大鼠ASMC鈣化及成骨樣分化,而增強自噬則可以減輕鈣化及成骨樣分化。

圖8 3-MA及RAP干預自噬對ASMC鈣化的影響Figure 8 Effects on ASMC calcification after 3-MA and RAP intervention on autophagy

3 討論

CKD血管鈣化最初被認為僅發(fā)生在終末期腎病,近期有研究發(fā)現(xiàn)CKD早期也可發(fā)生血管鈣化[5-6]。一項研究納入439例中度CKD但無心血管疾病的患者,亞組分析發(fā)現(xiàn),血磷每升高1 mg/dL,冠狀動脈鈣化風險增加21%,胸主動脈鈣化增加33%,主動脈瓣鈣化增加25%,二尖瓣鈣化增加62%[7]。大量研究表明,血磷已成為CKD血管鈣化的關鍵調(diào)節(jié)因子,能以多條途徑啟動和推進血管鈣化的發(fā)生[8]。因此將高磷作為血管鈣化誘導因素對研究CKD血管鈣化機制具有重要的意義。由于單用磷酸鹽造模周期長且模型不穩(wěn)定,腺嘌呤可以在體內(nèi)通過黃嘌呤氧化酶生成難以溶解的代謝產(chǎn)物沉積在腎小管和腎小球,破壞腎的濾過功能,影響磷酸鹽的排泄,進而加重高磷血癥。故本研究采用高磷飲食聯(lián)合腺嘌呤誘導CKD血管鈣化大鼠模型,生化結果顯示模型組大鼠較對照組腎功能顯著下降,血磷及24 h尿蛋白定量等顯著升高,腎病理提示腎間質(zhì)纖維化改變,主動脈中膜α-SMA表達減少而RUNX2表達增加,鈣含量明顯增加。細胞實驗采用β-GP刺激大鼠ASMC,可見隨著時間的延長,細胞鈣化及成骨樣分化越明顯。提示成功建立CKD血管鈣化大鼠模型及ASMC鈣化模型。

作為真核生物中普遍存在的對細胞內(nèi)物質(zhì)及成分進行降解再利用的基本過程,自噬在各種生理和病理過程中均有發(fā)生,生理范圍內(nèi)的自噬發(fā)揮保護作用,但病理性自噬可能產(chǎn)生過多或過少的活化,參與人體多種病理過程如感染、癌癥、神經(jīng)變性和衰老以及心臟、肝和腎系統(tǒng)等疾病[9]。巨自噬是自噬的經(jīng)典途徑,也是本研究所涉及的自噬類型。在典型的自噬過程中,Beclin 1與多個分子形成復合體誘導自噬體形成,LC3B系統(tǒng)參與自噬體的運輸和成熟。自噬相關蛋白已經(jīng)成為疾病干預的新的候選靶標,Beclin 1及LC3B已成為自噬相關蛋白常用的標記物。本研究發(fā)現(xiàn)與對照組相比,CKD血管鈣化大鼠主動脈在發(fā)生血管鈣化及成骨樣分化時,存在LC3B及Beclin 1的表達明顯增加。相關性分析結果顯示自噬與鈣化可能呈正相關關系。曾有研究者在含有0.9%磷飲食及0.75%腺嘌呤誘導的大鼠腹主動脈鈣化中檢測到LC3B熒光斑點及LC3B蛋白表達增加[10],這與我們的發(fā)現(xiàn)一致。為進一步明確自噬在CKD血管鈣化中的激活情況,本研究通過免疫熒光染色和電鏡發(fā)現(xiàn)β-GP誘導ASMC發(fā)生鈣化同時其LC3B表達及自噬小體較對照組明顯增多。為證實鈣化組是否有自噬流的增強,即LC3B或自噬小體的增加不是自噬降解過程障礙所致,而是由于自噬起始過程誘導增強,我們采用監(jiān)測自噬流的常用方法即用溶酶體抑制劑CQ抑制自噬降解過程后觀察LC3BII蛋白表達情況[11],結果發(fā)現(xiàn)β-GP可以誘導大鼠動脈平滑肌細胞自噬流增強。這提示血管鈣化的同時存在明顯的自噬增強。

目前對于自噬增強究竟是促進還是抑制鈣化存在爭議。既往有研究發(fā)現(xiàn)3-MA抑制自噬后加劇維生素D3和尼古丁誘導的血管壁鈣沉積[12];二甲雙胍可通過AMPK-mTOR途徑激活自噬從而減輕β-GP誘導的ASCM鈣化[13]。然而也有研究發(fā)現(xiàn)自噬激活可能是尿毒癥毒素硫酸吲哚酚誘導CKD血管鈣化的關鍵機制之一[14]。黃芪甲甙通過ERK抑制自噬并減輕β-GP誘導的ASCM鈣化[15]。自噬增強會促進AGEs誘導的人血管平滑肌細胞成骨樣轉(zhuǎn)化和凋亡[16]。為了進一步探索自噬在β-GP誘導的ASMC中的具體作用,本研究通過抑制或者促進自噬,觀察其對鈣化的影響。通過免疫組化、Western blot、鈣含量測定以及茜素紅染色等發(fā)現(xiàn)RAP促進自噬后,高磷刺激下的大鼠ASMC的鈣沉積減少,鈣含量水平明顯降低,RUNX2蛋白表達減少,α-SMA蛋白表達增多,而3-MA抑制自噬后其結果與之相反。這表明自噬參與β-GP誘導的動脈平滑肌細胞的鈣化及成骨樣分化,可能作為一種內(nèi)源性保護作用的反饋機制而被β-GP誘導增強,與既往支持自噬激活可以減輕血管鈣化的發(fā)現(xiàn)一致。我們推測自噬對血管鈣化的抑制作用可能與自噬可降解特異性蛋白有關。既往有研究發(fā)現(xiàn)自噬可降解肺動脈平滑肌細胞表面的BMPR2[17]。Frauscher等[18]通過體內(nèi)、體外實驗發(fā)現(xiàn)自噬主要通過減少RUNX2并增加α-SMA、SM22α蛋白轉(zhuǎn)錄水平從而抑制成骨轉(zhuǎn)分化。此外,自噬可能還與減少釋放基質(zhì)小泡、抑制細胞凋亡等有關[10,19]。

總之,本研究通過體內(nèi)、外研究發(fā)現(xiàn)高磷誘導血管鈣化同時存在自噬的激活,自噬的發(fā)生與鈣化密切相關;自噬在CKD血管鈣化中可能具有內(nèi)源性保護作用,增強自噬可以抑制血管鈣化,為未來將自噬作為治療CKD患者血管鈣化新的手段又增添了一個有力的依據(jù)。今后將進一步探討自噬影響CKD血管鈣化的具體機制,為血管鈣化的防治提供新的思路。