酒精性脂肪肝小鼠肝組織蛋白表達譜檢測及白藜蘆醇干預作用機制的探討

韓 敏易 旭游紹偉

(1.貴州中醫(yī)藥大學,貴陽 550025;2.貴州中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院,貴陽 550003)

酒精性脂肪肝(alcoholic fatty liver disease,AFLD)是酒精性肝病逐漸發(fā)展和治療的關鍵病理前提[1-2]。盡管對酒精誘導脂肪肝的病理生理學進行了廣泛的研究,但在過去50年中,除了禁酒以及對癥處理和營養(yǎng)支持外,仍然沒有針對性的治療[3-4]。白藜蘆醇是一種存在于紅酒和葡萄的膳食多酚,研究顯示在減輕酒精性和非酒精性肝功能障礙、膽汁淤積性肝損傷、化學性肝毒性、肝缺血再灌注等方面具有獨特的藥理活性[5-8]。Tang等[9]發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇處理減少了油酸和酒精作用后的HepG2細胞內脂滴形成。類似地,Tang等[10]、Kasdallah-Grissa等[11]、Chen等[12]和Ma等[13]發(fā)現(xiàn),白藜蘆醇除可能通過誘導自噬對酒精性脂肪肝變性具有保護作用外,膳食補充或服用白藜蘆醇可降低酒精誘導的大鼠或C57BL/6J小鼠肝的氧化應激和凋亡,增加超氧化物歧化酶 (superoxide dismutase, SOD)、過氧化氫酶(catalase, CAT)和谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase, GPx)等抗氧化酶活性,上調肝缺氧誘導因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α, HIF-1α)蛋白表達,從而減少酒精性肝損傷。白藜蘆醇也作為蛋白質去乙酰化酶SIRT1的激動劑,可以通過上調肝中SIRT1-AMPK信號系統(tǒng)阻止乙醇喂養(yǎng)小鼠酒精性脂肪肝的發(fā)生[14-18]。盡管白藜蘆醇的有益作用已在各種酒精性肝病的動物和細胞模型中得到充分證實,但其具體作用分子機制仍不清楚。使用多種蛋白質質譜技術分別在一定程度上揭示了大鼠或小鼠肝組織在攝入不同程度酒精后的蛋白質表達變化[19-22]。遺憾的是,這些研究結果較零散,且對AFLD這一重要酒精性肝病病理初始階段的肝蛋白質表達譜變化缺乏了解[23-24]。因此,本文運用4D非標定量蛋白質組學技術檢測AFLD小鼠肝組織蛋白質表達情況,并由此探索白藜蘆醇介導的抗AFLD干預作用機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級雄性C57BL/6J小鼠9只,8～10周齡,體重(22±2)g,由北京唯尚立德生物科技有限公司提供[SCXK(京)2021-0010]。飼養(yǎng)于貴州醫(yī)科大學實驗動物中心(北校區(qū))帶有IVC系統(tǒng)的飼養(yǎng)房內[SYXK(黔)2018-0001],20～23℃。實驗前適應性喂養(yǎng)1周,自由進食SPF級鼠飼料和自由飲用滅菌自來水。實驗過程嚴格遵守3R原則。動物實驗由貴州中醫(yī)藥大學倫理委員會審批(20210093)。

1.2 主要試劑與儀器

BCA蛋白濃度測定試劑盒(中國碧云天公司,生產編號:P0011);胰蛋白酶(美國Promega,生產編號:V5117);乙腈(美國Thermofisher scientific,生產編號:204433);甲酸(美國Fluka,生產編號:A117-50);二硫蘇糖醇(美國Sigma,生產編號:D9163-25G)。除鹽柱(Phenomenex,貨號:8B-S100-EBJ);NanoElute液相色譜儀、Tims TOF Pro飛行時間質譜儀(美國bruker)。

1.3 實驗方法

1.3.1 藥物制備

運用高壓滅菌的30% koliphor HS15(BASF,30944788Q0)制備白藜蘆醇(sigma,R5010)溶液。

1.3.2 動物分組與處理

小鼠分為對照組(C)、AFLD組(M)及白藜蘆醇干預組(R),采用Lieber-DeCarli酒精液體飼料自由攝入+1次95%乙醇灌胃的NIAAA法制備小鼠AFLD模型和給予400 mg/kg白藜蘆醇灌胃處理,具體方法見以往發(fā)表文章[25]。最后1次用藥后24 h收集肝組織,以備蛋白組學檢測分析用。

1.3.3 肝組織總蛋白質制備和胰蛋白酶水解

取適量-80℃保存的肝組織,用液氮研磨成粉末,加入40 μL體積含8 mol/L尿素、1%蛋白酶抑制劑、3 μmol/L去乙?；敢种苿?、50 mmol/L煙酰胺的裂解緩沖液,進行3次高強度超聲裂解。4℃,12 000 r/min離心10 min后,收集上清液,蛋白質濃度用BCA法測定。取等量蛋白質樣品和適量標準蛋白質混合物,加入終濃度為20% v/v的三氯乙酸,充分混合,4℃沉淀2 h。500 r/min離心5 min后,使用預冷丙酮洗滌和沉淀樣品。在最終濃度為200 mmol/L的四乙基溴化銨溶液中進行超聲分散,然后添加1/50比例的胰蛋白酶過夜處理,加入最終濃度為5 mmol/L的二硫蘇糖醇,然后在56℃下還原30 min。

1.3.4 液相色譜-質譜聯(lián)用分析

分別制備含有2%乙腈和0.1%甲酸的液相色譜流動相A溶液和含有100%乙腈和0.1%甲酸的B溶液,然后通過納米管UHPLC系統(tǒng)分離溶解在流動相A溶液中的肽。將流速設置為300 NL/min,按2%～5% B,0～1 min進行;5%～27% B, 1～76 min;27%～35% B,76～82 min和35%～85% B,82～86 min。分離的肽經毛細管離子源電離,電壓為1.75 kV,然后進行一次和二次(掃描范圍為100～1700)串聯(lián)質譜分析,動態(tài)排除時間掃描為30 s。

1.3.5 肝組織蛋白組學的生物信息學分析

(1)數(shù)據(jù)庫搜索

借助Maxquant (v1.6.15.0)進行二級質譜數(shù)據(jù)檢索,在Mus_musculus_10090_SP_20201214中有蛋白質序列。FASTA(17 063序列)蛋白質數(shù)據(jù)庫構建理論二級光譜數(shù)據(jù)庫,搜索質譜產生的二級光譜,并與理論二級光譜圖進行比較,通過算法評分和過濾得到匹配的理論肽序列,完成樣品蛋白質的識別,識別出的蛋白質特異性肽可以識別蛋白質信息。

(2)蛋白質的定量分析及差異表達蛋白的篩選

將肽段在不同樣本中的肽信號強度值通過中心化變化后得到相應的相對定量值,進一步采用中位數(shù)歸一化方法校正后用于計算蛋白的相對定量值。最后采用皮爾森相關性、主成分分析和相對標準差三種統(tǒng)計分析方法對蛋白質定量結果進行重復性檢驗,使定量結果具有統(tǒng)計學一致性。以重復定量值的平均值比值作為各蛋白質在AFLD組/對照組(M/C)、白藜蘆醇組/AFLD組(R/M)、白藜蘆醇組和對照組(R/C)3個樣本比較對中的表達差異倍數(shù),經過Log2對數(shù)轉換后進行t檢驗分析,并計算相應的P值,以此作為顯著性指標。以滿足P＜0.05和差異倍數(shù)≥1.5或≤0.67兩個條件進行顯著上調或下調的差異表達蛋白篩選,將同時在3個樣本比較組中顯著差異表達的蛋白視為差異共表達蛋白。

(3)差異表達蛋白的GO、KEGG分析及蛋白質互作網絡分析

對每個比較組的差異表達蛋白進行了基因本體論(GO)分類和KEGG通路分析。將3個比較組中共表達的差異蛋白進行GO功能富集及KEGG通路分析,然后將3個比較組中篩選出的差異共表達蛋白的蛋白序列與STRING(v.11.0)蛋白網絡互作數(shù)據(jù)庫比對,根據(jù)confidence score＞0.4提取得到差異蛋白互作關系,并對差異蛋白互作網絡進行可視化展示。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 26.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。組間蛋白差異倍數(shù)值比較采用Student’st檢驗,P＜0.05為差異具有顯著性。

2 結果

2.1 白藜蘆醇對AFLD小鼠肝脂肪變性的影響

經油紅“O”染色后鏡下觀察,發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇干預后AFLD小鼠肝細胞脂肪變性顯著減輕,具體結果可參見以往發(fā)表論文[24]。

2.2 肝組織蛋白質表達質譜鑒定、定量及差異表達蛋白質篩選結果

各實驗組共鑒定出4513個蛋白質,其中定量蛋白質有3763個。M/C、R/M和R/C 3個樣本比較組共篩選出1228個顯著差異表達蛋白質。與對照組比較(P＜0.05),AFLD組、白藜蘆醇干預組小鼠肝組織中分別有324、40個蛋白表達顯著上調和分別有370、43個蛋白表達顯著下調。與AFLD組比較(P＜0.05),白藜蘆醇干預組小鼠肝組織分別有224、227個蛋白表達顯著上調和下調(如圖1)。白藜蘆醇干預后能夠將模型組中198個顯著上調、171個顯著下調表達的蛋白質分別相應地顯著下調和上調。運用火山圖分析3個樣本比較組之間蛋白質表達水平的差異(如圖2)。

圖1 三個樣本比較組差異表達蛋白質篩選Figure 1 Screening of differentially expressed proteins in three sample comparison groups

圖2 三個樣本比較組差異表達蛋白質的火山圖分析Figure 2 Volcanic map analysis of differentially expressed proteins in three sample comparison groups

2.3 差異表達蛋白的功能富集分析結果

1228個差異表達蛋白的GO功能富集分析顯示,M/C、R/M和R/C三個比較組對分別涉及19、10、11個生物過程、19、9、8個細胞組成和14、11、13個分子功能的變化(如圖3),此外,分別有13、15和17個KEGG通路顯著富集(如圖4)。

圖3 差異表達蛋白的GO分類分析結果Figure 3 GO classification analysis results of differentially expressed proteins

圖4 差異表達蛋白的KEGG富集通路分析結果Figure 4 Analysis results of KEGG enrichment pathway of differentially expressed proteins

2.4 差異共表達蛋白篩選及GO功能、KEGG通路分析

在M/C、R/C、R/M 3個比較組中篩選出11個差異共表達蛋白質,其中推測水解酶(putative hydrolase RBBP9, Rbbp9),白細胞彈性蛋白酶抑制劑A(leukocyte elastase inhibitor A, Serpinb1a),蛋氨酸-R-亞砜還原酶 B1(methionine-R-sulfoxide reductase B1, Msrb1),硫轉移酶家族胞質1B(sulfotransferase family cytosolic 1B, Sult1b1)等4個蛋白在模型組中顯著下調0.08～0.39倍,過氧化物酶體膜蛋白(peroxisomal membrane protein, Slc25a17),載脂蛋白A-IV(apolipoprotein A-IV, Apoa4),UDP-N-乙酰己糖胺焦磷酸化酶樣蛋白1( UDP-N-acetylhexosamine pyrophosphorylase-like protein 1, Uap1l1)內質網金屬肽酶1(endoplasmic reticulum metallopeptidase 1, Ermp1),甘油-3-磷酸酰基轉移酶3(glycerol-3-phosphate acyltransferase 3, Gpat3),環(huán)氧化物水解酶1(epoxide hydrolase 1, Ephx1),STIP1同源性含U盒蛋白1(STIP1 homology and U box-containing protein 1, Stub1)等7個蛋白顯著上調2.44～6.79倍,相應地,經白藜蘆醇干預后能夠分別上調1.6～6.0倍和下調0.26～0.63倍。GO功能富集分析顯示,除Rbbp9、Ermp1 2個蛋白質無分子功能外,其余9個蛋白質涉及9種分子功能(如表1)。此外,KEGG通路分析顯示其中Apoa4、Uap1l1、Slc25a17、Gpat3、Ephx1等5個蛋白質分別涉及脂肪消化和吸收、過氧化物、異生物質CYP450代謝和代謝等5條通路(如圖5)。

圖5 11個差異共表達蛋白的KEGG通路分析結果Figure 5 Analysis results of KEGG enrichment pathway of 11 differentially co-expressed proteins

表1 11個差異共表達蛋白質分子功能及差異倍數(shù)Table 1 Molecular functions and differential fold values of 11 differentially co-expressed proteins

2.5 差異共表達蛋白網絡互作分析結果

11個差異共表達蛋白網絡互作分析結果顯示,Sult1b1、Apoa4、Agpat9(Gpat3)、Ephx1等4個蛋白具有相互作用關系,其余7個蛋白Rbbp9、Msrbl、Ermpl、Stubl、Slc25a17、Serpinbla、Uap1l1無相互作用關系(如圖6)。

圖6 11個差異共表達蛋白質的網絡互作關系圖Figure 6 Network interaction diagram of 11 differentially co-expressed proteins

3 討論

眾所周知,疾病往往伴隨著多個層面的蛋白質功能障礙[26-27]。蛋白質組學技術的進步使篩選與疾病發(fā)生、防治相關的蛋白標志物成為可能[28-30]。因此,全面了解AFLD相關信號通路中涉及的蛋白質分子可能會為AFLD的發(fā)生機制理解以及開發(fā)合適的臨床治療或新藥的方法提供有價值的見解。Song等[31]通過蛋白質組學方法分析了刺梨對高脂血癥小鼠肝組織蛋白質表達的影響,發(fā)現(xiàn)了15種與脂質代謝相關的蛋白質。類似的,Dai等[32]通過定量化學蛋白質組學分析發(fā)現(xiàn),從黃芩中提取的黃芩苷激活了肝肉堿棕櫚基轉移酶1,從而對代謝性疾病(如肝脂肪變性和肥胖)起到干預作用。Du等[33]利用蛋白質定量蛋白質組學發(fā)現(xiàn),賴氨酸丙二?；赡芘c2型糖尿病治療密切相關。Liu等[34]利用蛋白質翻譯后修飾技術發(fā)現(xiàn)泛素特異性蛋白酶14通過穩(wěn)定其底物脂肪酸合酶在非酒精性脂肪肝中發(fā)揮作用。白藜蘆醇作為治療酒精性肝病研究最廣泛、最有前途的膳食多酚[5-8],其具體作用分子機制仍不清楚。故本文采用更高檢測深度的4D非標定量蛋白質組學分析技術,從AFLD組中獲得了370個差異表達蛋白質,該結果提示慢性飲酒可導致肝組織蛋白質表達譜的顯著變化,也表明這些差異蛋白可能參與了AFLD的形成。白藜蘆醇干預后能分別將AFLD小鼠其中下調表達的蛋白質中的198個上調、將上調表達中的171個蛋白實現(xiàn)下調的結果表明,這些蛋白也可能與白藜蘆醇的AFLD干預作用可能密切相關。因此,慢性酒精攝入后引起肝組織蛋白質表達譜變化的結果為后續(xù)探討藥物干預機理和完善AFLD發(fā)生機制提供了重要的研究方向。進一步的差異表達蛋白質的功能富集分析也表明這些差異表達蛋白質與多種生物學效應有關,能夠通過多種途徑直接或間接影響小鼠攝入酒精后的肝病理學結局。

有趣的是,運用PPI分析,我們從11個差異共表達蛋白質中發(fā)現(xiàn)了4個具有相互作用關系的蛋白質,即環(huán)氧化物水解酶1(Ephx1)、載脂蛋白A-IV(Apoa4)、甘油-3-磷酸?；D移酶3(Gpat3)和硫轉移酶家族胞漿1B成員(Sult1b1),然而與酒精性肝病關系尚不明確。本文檢測結果顯示,酒精攝入后小鼠肝組織Ephx1、Apoa4、Gpat3的表達水平均分別顯著上調3.38、6.79和3.98倍,經白藜蘆醇干預后均分別顯著下調了0.54、0.26和0.53倍。相反地,Sult1b1在酒精攝入后顯著下調0.21倍,經白藜蘆醇干預后顯著上調2.87倍。GO分類和KEGG通路功能富集分析顯示Ephx1通過細胞色素P450代謝外源性物質途徑發(fā)揮作用。Ephx1為在肝中廣泛表達的解毒酶和水解酶折疊酶[35],Gautheron等[36]通過小鼠3T3-L1前脂肪細胞的Ephx1敲除實驗,證明了Ephx1敲除促進細胞的氧化應激和衰老。然而也有研究證明Ephx1與細胞色素P450酶偶聯(lián)[37],Davydov等[38]使用化學交聯(lián)質譜法確證了Ephx1和細胞色素P450 2E1的相互作用關系。微粒體Ephx1活性的增加可能通過增加細胞色素P450活性加速酒精向其有毒代謝物乙醛的轉化[39]?；诩毎豍450 2E1與AFLD發(fā)生的密切相關性認知[40-41],這些結果表明了白藜蘆醇可能通過調節(jié)Ephx1表達水平進而影響細胞色素P450活性,從而達到小鼠AFLD的保護作用。脂肪生成和分解代謝的不平衡會導致脂肪肝等代謝性疾病[42]。Apoa4是主要表達于腸上皮細胞中的交換性載脂蛋白家族成員之一,它在促進腸脂質吸收、調節(jié)脂質和葡萄糖代謝中起關鍵作用[43-45]。Li等[42]發(fā)現(xiàn)Apoa4缺乏會降低小鼠肝脂肪分解相關限速酶的表達,Apoa4會促進脂肪分解和能量代謝。此外,肝Apoa4蛋白的過度表達在肝纖維化初期和非酒精性脂肪性肝炎相關肝癌中得到證實[46-47]。Kang等[48]使用微陣列分析鑒定了參與肝脂肪代謝的人亮氨酸拉鏈蛋白(LZIP)誘導基因,發(fā)現(xiàn)LZIP和Apoa4在人類脂肪變性樣品中均高度表達,并促進小鼠肝中的肝脂肪變性。近期Tryndyak等[49]利用飲食誘導的肝細胞脂肪變性體外模型,也證明了Apoa4表達的顯著上調。一致地,我們的蛋白質組學數(shù)據(jù)也顯示AFLD小鼠肝組織Apoa4蛋白的上調表達和白藜蘆醇干預后的下調表達。提示白藜蘆醇可能通過干預Apoa4的表達,調節(jié)腸道脂肪消化吸收途徑參與小鼠AFLD的保護作用,不過需要進一步的驗證。Gpat3是甘油-3-磷酸?；D移酶的一種亞型酶,在脂肪組織中高度表達,有研究證明Gpat3的敲低不僅減少甘油三酯的合成,還會損害脂肪的生成[50]。Gao等[51]通過Seipin/Gpat3敲除小鼠體內實驗,也發(fā)現(xiàn)Gpat3的缺乏能夠緩解嚴重先天性全身性脂肪營養(yǎng)不良小鼠模型中的胰島素抵抗和肝脂肪變性。Pagac等[52]在運用3T3-L1前脂肪細胞,發(fā)現(xiàn)敲低Gpat3顯著增強了脂肪細胞分化,而Sim等[53]通過Gpat3過表達3T3-L1細胞實驗發(fā)現(xiàn)增強的Gpat3活性將積極調節(jié)脂肪細胞分化。Khatun等[54]發(fā)現(xiàn)Gpat3敲除小鼠表現(xiàn)出減弱的血漿甘油三酯偏移和腸細胞中積聚的脂質等結果證明了Gpat3是參與腸脂代謝的新型酶,腸道Gpat3是脂質吸收的次要途徑。因此,研究這個蛋白是否通過脂肪細胞分化、腸道脂質吸收失衡來參與酒精誘導的脂肪肝及作為藥物干預作用靶點將會是非常有意義的。綜合我們的蛋白質組學定量數(shù)據(jù)和功能富集分析結果,提示,通過調節(jié)Gpat3對肝脂質穩(wěn)態(tài)代謝通路的影響也可能是白藜蘆醇發(fā)揮抗AFLD的重要途徑。作為SULT家族成員之一的Sult1b1是小腸中表達并參與人體異源解毒的主要酶,與SULT1A3/4一起主要構成組織中硫轉移酶蛋白質[55-56]。Lian等[57]近期通過生物信息學分析和qRT-PCR鑒定、驗證了Sult1b1在結直腸癌細胞中表達水平的顯著降低,確定了是結直腸癌轉移的新型生物標志物。然而Sult1b1雖然在藥物、環(huán)境毒素和內源性類固醇的代謝中起重要作用已經被證實[58],但是很少有研究顯示Sult1b1表達或活性在酒精攝入后肝病理條件下的變化。我們研究結果表明了AFLD小鼠肝組織中Sult1b1的顯著表達下調和白藜蘆醇干預后的顯著上調。GO功能富集分析結果顯示該蛋白涉及催化活性和轉移酶活性兩種分子功能,提示通過上調Sult1b1表達增強其發(fā)揮清除外源性物質、加強酒精代謝可能參與白藜蘆醇的小鼠的AFLD保護作用,有必要深入了解具體的分子作用機理。

綜上所述,我們研究了AFLD小鼠肝組織中蛋白質表達譜的變化及其與白藜蘆醇干預作用的可能相關性。白藜蘆醇至少通過正向或負向調節(jié)Sult1b1、Apoa4、Gpat3、Ephx1等4個蛋白質的表達,發(fā)揮調節(jié)腸道脂肪消化、細胞色素P450代謝外源性物質途徑和代謝途徑來減輕小鼠肝的酒精性脂肪變性,有望成為新的治療AFLD的靶點,值得進一步探討。