黃花倒水蓮內(nèi)生真菌生物活性評價及HNLF-44菌株鑒定

蘇秀麗， 李惠敏， 唐 輝， 李良波, 劉寶玉

( 1. 廣西壯族自治區(qū)中國科學(xué)院 廣西植物研究所， 廣西 桂林 541006； 2. 廣西植物功能物質(zhì)與資源持續(xù)利用重點實驗室， 廣西 桂林 541006； 3. 廣西師范大學(xué)珍稀瀕危動植物生態(tài)與環(huán)境保護(hù)教育部重點實驗室， 廣西 桂林 541006； 4. 廣西中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院， 南寧 530200 )

植物內(nèi)生真菌是指長期生活在健康植物體內(nèi)，但在體內(nèi)生活的這段時間不會引起宿主產(chǎn)生病害的一類真菌(隋麗等，2021)。藥用植物內(nèi)生真菌具有良好的抗氧化活性、抑菌活性等，在農(nóng)醫(yī)藥行業(yè)的活性產(chǎn)物開發(fā)中發(fā)揮重要作用。研究表明，鏈格孢屬、間座殼屬等內(nèi)生真菌具有良好的抗氧化活性，殷娜等(2022)從藥用植物馬利筋中發(fā)現(xiàn)具有抗氧化活性的鏈格孢屬和間座殼屬內(nèi)生真菌；程庭峰等(2021)從野生麻花艽的一株Cadophorasp.內(nèi)生真菌Gs-6發(fā)酵液中發(fā)現(xiàn)槲皮素等黃酮類物質(zhì)，DPPH清除自由基的IC50為0.039 9 mg?mL-1，具有較強(qiáng)的清除活性；寇曉琳等(2020)從青錢柳中發(fā)現(xiàn)3株能產(chǎn)生黃酮的鏈格孢屬真菌。此外，鐮刀菌屬、木霉屬等對病原菌具有良好的抑制作用，Zhao等(2020)研究發(fā)現(xiàn)1株內(nèi)生真菌Seimatosporiumsp. M7SB 41能夠增強(qiáng)宿主植物抵抗薔薇白粉病的能力，降低感染薔薇白粉病的風(fēng)險。Bucarei等(2019)將一種白僵菌(Beauveriabassiana)定殖在西紅柿和辣椒植株根部一段時間后發(fā)現(xiàn)，其能夠減輕由灰霉病菌(Botrytiscinerea)引起的灰霉病病害發(fā)生程度。此外，內(nèi)生真菌燕麥鐮刀菌(Fusariumavenaceum)和木霉屬(Trichoderma)的康寧木霉(T.koningii)和深綠木霉(T.atroviride)對柑橘青霉病，煙曲霉(Aspergillusfumigatus)和黑曲霉(A.niger)具有良好的防治作用(郭東升等，2020；Erfandoust et al., 2020)。因此，從藥用植物內(nèi)生真菌中獲得具有生物活性的次級代謝產(chǎn)物是可行的，藥用植物內(nèi)生真菌次級代謝產(chǎn)物為天然產(chǎn)物的開發(fā)提供了強(qiáng)大動力。

黃花倒水蓮(Polygalafallax)，別稱黃花遠(yuǎn)志，遠(yuǎn)志科(Polygalaceae)遠(yuǎn)志屬(Polygala)植物，是一種深受少數(shù)民族喜愛的藥用植物(翁穎妮等，2020)。其根部富含皂苷、黃酮、多糖類等物質(zhì)，具有抗衰老、降血糖等多種生物活性(姚志仁等，2020；李根等，2022)。目前，雖然國內(nèi)外已有許多有關(guān)黃花倒水蓮化學(xué)成分和藥理活性的研究，但未曾見到有關(guān)黃花倒水蓮內(nèi)生真菌及其次級代謝產(chǎn)物生物活性的研究。有研究表明，從藥用植物遠(yuǎn)志中分離得到的鏈格孢屬內(nèi)生真菌不僅具有抑菌活性，而且能夠產(chǎn)生皂苷類物質(zhì)、香豆素等抗氧化物質(zhì)，具有重要的研究價值(王玉君等，2009；付建紅和熊東蘭，2013)。據(jù)此，我們提出黃花倒水蓮內(nèi)生真菌也具有抗氧化活性、抑菌活性的推測。在內(nèi)生真菌與宿主有著相似活性的基礎(chǔ)上，以黃花倒水蓮內(nèi)生真菌為研究對象，以香蕉?；怄哏牭毒?Fusariunoxysporunf. sp.cubense)、香蕉具條葉斑病菌(Mycosphaerellafijiensis)、柑橘樹脂病菌(Diaporthecitri)、三七根腐病菌(Fusariumoxysporum)、茄病鐮刀菌(F.solani)、葉點霉菌為指示菌(Phyllostictazingiberi)，評價內(nèi)生真菌的抑菌效果，并通過測定內(nèi)生真菌發(fā)酵液DPPH清除自由基能力和總還原能力等指標(biāo)，評價其抗氧化活性，為下一步從高活性菌株中篩選活性化合物奠定基礎(chǔ)，也為民族用藥黃花倒水蓮資源的綜合利用提供了另一條途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1供試菌株 供試21株黃花倒水蓮內(nèi)生真菌：實驗室前期于2020年8—11月從廣西靈川、湖南永州、云南文山等地采集的野生黃花倒水蓮植株中分離得到。

供試植物病原真菌：香蕉專化尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporumf. sp.cubense)、茄病鐮刀菌(F.solani)、三七根腐病菌(F.oxysporum)、香蕉具條葉斑病菌(Mycosphaerellafijiensis)、葉點霉菌(Phyllostictazingiberi)、柑橘樹脂病菌(Diaporthecitri)，由廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院提供。

1.1.2 培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基和PDB培養(yǎng)基：購于北京暖溪匯智科技有限公司，前者100 mL的培養(yǎng)基中含有2 g馬鈴薯淀粉、0.6 g葡萄糖、2 g瓊脂；后者100 mL的培養(yǎng)基中含有2 g馬鈴薯淀粉、0.6 g葡萄糖。

1.2 方法

1.2.1 供試菌株抑菌活性測定 初篩和復(fù)篩過程均采用平板對峙法(楊帆等，2021)，區(qū)別在于初篩過程采用五點對峙法，復(fù)篩過程采用兩點對峙法。將對峙的PDA平板在光照培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)5～7 d后，測量對照組菌落的半徑(R)和實驗組病原真菌菌落朝內(nèi)生真菌方向生長的半徑(r)，抑菌率取3次重復(fù)的平均值。抑菌率(%)=(R-r)/R×100

1.2.2 供試菌株液體發(fā)酵培養(yǎng) 將抑菌活性復(fù)篩的13株內(nèi)生真菌在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)3 ～7 d后，用0.5 cm的無菌打孔器在菌落邊緣打取大小一致的菌塊，在含有100 mL PDB液體培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中加入菌塊3個，于25 ℃，140 r·min-1的恒溫?fù)u床中進(jìn)行培養(yǎng)15 d。培養(yǎng)結(jié)束后，利用抽濾的方法將菌絲體和發(fā)酵液分開，然后將獲得的發(fā)酵濾液依次用0.45、0.22 μm濾膜過濾，獲得無菌發(fā)酵濾液，保存于4 ℃冰箱備用。

1.2.3 供試菌株抗氧化活性測定 DPPH清除能力和總還原力是評價抗氧化活性的重要指標(biāo)，參照前人的研究方法(宋新月等，2018；金宏杰等，2019)對1.2.2中的無菌發(fā)酵濾液進(jìn)行DPPH清除能力和總還原力測定。

1.2.4 HNLF-44菌株的鑒定 采用透明膠帶法在萊卡顯微鏡下觀察HNLF-44菌株的菌絲體和孢子形態(tài)，根據(jù)真菌形態(tài)對照相關(guān)資料對菌株進(jìn)行初步鑒定。分子鑒定則根據(jù)真菌ITS序列的保守性來進(jìn)行，根據(jù)真菌DNA提取試劑盒說明書提取內(nèi)生真菌HNLF-44的總DNA，以引物ITS1(序列為TCCGTAGGTGAACCTGCGG)和引物ITS4(序列為TCCTCCGCTTATTGATATGC)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物的純度，將PCR產(chǎn)物送到上海生物工程有限公司進(jìn)行測序。對測序結(jié)果進(jìn)行處理，然后將處理好的序列上傳到NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST比對，尋找與其相似性最高的菌株序列，下載與其相似性最高的幾組序列作為參考序列，利用MEGA7.0軟件進(jìn)行序列對齊、鄰接法(neighbor-joining)構(gòu)建HNLF-44菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹，在分支上顯示Bootstrap重復(fù)1 000次的數(shù)值。

2 結(jié)果與分析

2.1 供試菌株抑菌活性初篩測定

黃花倒水蓮供試菌株抑菌初篩結(jié)果如表1所示，供試菌株對6種植物病原真菌具有不同程度的拮抗作用(圖1)。從抑制的病原菌來看，HNLF-7、HNLF-26、HNLF-44、YNLF-32對香蕉?；怄哏牭毒囊种菩Ч^強(qiáng)，其中HNLF-44對香蕉專化尖孢鐮刀菌的抑制效果最好，抑菌率為69.3%。除HNLF-9和LCRXY-26對柑橘樹脂病菌的抑菌率分別為49.1%和45.9%外，其余菌株的抑菌率均超過50.8%。HNBA-9對香蕉具條葉斑病菌抑制效果最強(qiáng)，抑菌率為69.1%。HNLF-44對三七根腐病菌具有58.9%的抑菌率。LCPH-5對茄病鐮刀菌抑制效果最好，抑菌率為59.0%。所有供試菌株均對葉點霉菌具有較強(qiáng)的抑菌效果，抑菌率均超過53.6%。綜上表明，HNLF-44對6種植物病原真菌都具有較強(qiáng)的抑菌活性，抑菌率均超過51.3%。

表 1 黃花倒水蓮內(nèi)生真菌初篩抑菌率的測定Table 1 Determination of inhibition rate primary screening of endophytic fungi of Polygala fallax

A. 葉點霉菌; B. 茄病鐮刀菌; C. 柑橘樹脂病菌; D. 香蕉?；怄哏牭毒?。A. Phyllosticta zingiberi; B. Fusarium solani; C. Diaporthe citri; D. Fusarium oxysporum f. sp. cubense. 1. LCLF-7; 2. YNLF-32; 3. LCRXY-26; 4. HNLF-10; 5. HNLF-44; 6. LCSY-43; 7. LCPH-1; 8. LCSXY-9. 圖 1 供試菌株對病原真菌的抑菌作用Fig. 1 Antifungal activity of endophytic fungi isolated from Polygala fallax

其中，對葉點霉菌的抑制效果最強(qiáng)，為70.7%；其次是對香蕉轉(zhuǎn)化尖孢鐮刀菌，抑制率為69.3%；對茄病鐮刀菌的抑制效果較弱，抑菌率僅為51.3%。

2.2 內(nèi)生真菌抑菌活性復(fù)篩測定結(jié)果

黃花倒水蓮供試菌株抑菌活性復(fù)篩結(jié)果如表2所示，HNLF-5、HNLF-44對6種植物病原真菌的抑制效果比較好，抑菌率在50.3%以上，其余菌株的抑菌效果較差。從抑制的病原菌來看，對香蕉?；怄哏牭毒种菩Ч顝?qiáng)的是HNLF-44(91.4%)(圖2)，其次是HNLF-5(54.0%)。HNLF-44對香蕉具條葉斑病菌的抑制效果最強(qiáng)(67.0%)，其次是HNLF-5(59.4%)。對柑橘樹脂病菌、葉點霉菌抑制效果最好的均為HNLF-5，抑菌率分別為73.2%和70.3%；其次是HNLF-44，抑菌率分別為67.7%和67.0%。HNLF-44對三七根腐病菌、茄病鐮刀菌的抑制效果最好，抑制能力均達(dá)到60.7%以上。

表 2 黃花倒水蓮內(nèi)生真菌復(fù)篩抑菌率的測定Table 2 Determination of inhibition rate re-screening of endophytic fungi of Polygala fallax

A. 葉點霉菌; B. 香蕉具條葉斑病菌; C. 柑橘樹脂病菌; D. 香蕉?；怄哏牭毒? E. 茄病鐮刀菌; F. 三七根腐病菌。A. Phyllosticta zingiberi; B. Mycosphaerella fijiensis; C. Diaporthe citri; D. Fusarium oxysporum f. sp. cubense; E. F. solani; F. F. oxysporum.圖 2 HNLF-44對6種植物病原真菌的影響Fig. 2 Effects of HNLF-44 on six phytopathogenic fungi

2.3 抗氧化活性分析

內(nèi)生真菌發(fā)酵液的總還原能力測定結(jié)果如圖3所示，菌株HNLF-26、HNLF-44、HNLF-45、LCPH-9、LCSXY-43、LCRXY-26、LCBA-85、YNLF-32的發(fā)酵液還原力的吸光值均大于0.5，其余菌株發(fā)酵液的吸光值小于0.4?？傔€原能力強(qiáng)弱與吸光值大小成正比，由此可知，還原能力最強(qiáng)的菌株是LCBA-85，其次是YNLF-32。

圖 3 發(fā)酵液總還原力測定Fig. 3 Determination of total reducing power of fermentation broth

內(nèi)生真菌發(fā)酵液清除DPPH自由基的結(jié)果如圖4所示，DPPH清除率都很高，除HNLF-7的清除率為86.90%外，其余菌株的清除率均達(dá)90%以上。DPPH清除率越大，抗氧化能力越強(qiáng)，表明供試內(nèi)生真菌發(fā)酵液中含有清除DPPH自由基的物質(zhì)，具有較強(qiáng)的抗氧化活性。

圖 4 發(fā)酵液DPPH清除能力測定Fig. 4 Determination of DPPH scavenging ability of fermentation broth

2.4 HNLF-44的鑒定

對香蕉?；怄哏牭毒哂袕?qiáng)抑菌活性的HNLF-44菌株進(jìn)行鑒定。HNLF-44菌株在PDA平板上生長緩慢，菌落邊緣不規(guī)則，表面有白色絨毛，菌絲上還附有少量的黃色水珠、菌絲易挑取(圖5:A)。菌落背面為黃色，產(chǎn)色素，在培養(yǎng)過程中可看到基質(zhì)由透明色變?yōu)辄S色(圖5:B)。培養(yǎng)10 d后在顯微鏡下觀察可看到菌絲分支有隔，分生孢子呈淡黃色、倒棒狀，表面有橫隔和縱隔(圖5:C, D)，根據(jù)形態(tài)特點將其鑒定為鏈格孢屬真菌。HNLF-44菌株ITS序列經(jīng)比對后發(fā)現(xiàn)，其ITS序列與Alternariaburnsii(NR136119.1)的相似性為100%，由系統(tǒng)發(fā)育樹圖6可知，HNLF-44菌株與NR136119.1聚在同一個分支上，且可信度為97，結(jié)合形態(tài)特點，將HNLF-44鑒定為鏈格孢屬真菌。

A. 菌落正面; B. 菌落背面; C. 菌絲體; D. 分生孢子。A. Colony front; B. Colony back; C. Mycelium; D. Conidium.圖 5 菌株HNLF-44的菌落及孢子形態(tài)Fig. 5 Morphological characteristics of HNLF-44 strain

3 討論與結(jié)論

植物體內(nèi)具有生物活性的內(nèi)生真菌是天然產(chǎn)物開發(fā)的重要來源，長期生活在藥用植物體內(nèi)的內(nèi)生真菌會趨于與宿主有一致的生物活性，因此藥用植物內(nèi)生真菌是研究中的重點對象(侯曉強(qiáng)等，2015)。為此我們對黃花倒水蓮內(nèi)生真菌的抗氧化活性和抑菌活性進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)黃花倒水蓮內(nèi)生真菌不僅具有抑菌活性還具有抗氧化活性，與丹參種子內(nèi)生真菌具有抑菌活性、抗氧化活性的結(jié)果相似(劉玉嬌等，2020)，表明黃花倒水蓮內(nèi)生真菌具有可開發(fā)利用的基礎(chǔ)。

鏈格孢屬內(nèi)生真菌在拮抗病原菌方面具有良好的作用，能夠通過產(chǎn)生一些交鏈格孢酚、交替那吡酮等物質(zhì)對生物產(chǎn)生毒害作用，是一種很好的生物資源(Puntscher et al., 2019)。本研究發(fā)現(xiàn)，黃花倒水蓮的1株鏈格孢屬內(nèi)生真菌HNLF-44對香蕉?；怄哏牭毒⒏涕贅渲【?、葉點霉病菌等具有良好的拮抗活性，特別是對香蕉專化尖孢鐮刀菌具有91.4%的拮抗活性。這表明HNLF-44菌株在對峙培養(yǎng)的過程中可能產(chǎn)生了一些對植物病原真菌有害的如交鏈格孢酚等物質(zhì)，進(jìn)而抑制了病原真菌菌絲的生長。本研究結(jié)果與現(xiàn)有的鏈格孢屬內(nèi)生真菌對植物病原真菌具有拮抗活性的研究結(jié)果基本一致，周兵等(2011)研究發(fā)現(xiàn)鏈格孢菌的發(fā)酵液產(chǎn)物對小麥赤霉病菌(Fusariumgraminearum)、煙草灰霉病菌(Botrytiscinerea)等植物病原真菌具有一定的抑制活性；翟鳳艷等(2011)認(rèn)為茄鏈格孢菌毒素對小麥赤霉病菌和番茄煤污病菌(Cladosporiumfulvum)的菌絲生長和孢子萌發(fā)均具有抑制作用；陳思杰等(2022)發(fā)現(xiàn)Alternariaalternata的50%濃度發(fā)酵濾液對枸杞根腐病菌(Fusariumoxysporum)的分生孢子抑制率為91.48%，揮發(fā)性物質(zhì)對菌絲生長的抑制率為94.10%；苗智等(2016)從夾竹桃中篩選到1株對白菜黑斑病菌(Cabbageshadinggerms)、番茄灰霉病菌(Botrytiscinerea)等8種病原菌具有抑制作用的鏈格孢屬真菌SPS-04，從其發(fā)酵產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)了交鏈孢酚的存在。此外，鏈格孢屬內(nèi)生真菌還可以產(chǎn)生與宿主相同或相似的抗氧化活性物質(zhì)，如黃酮類物質(zhì)等。李姝諾等(2009)從越橘中發(fā)現(xiàn)了一株可以產(chǎn)黃酮化合物的細(xì)鏈格孢菌(Alternariatenuissima)；寇曉琳等(2020)從藥用植物青柳的內(nèi)生真菌中發(fā)現(xiàn)了3株能夠產(chǎn)生的黃酮類物質(zhì)的鏈格孢屬內(nèi)生真菌。因此，我們認(rèn)為鏈格孢屬真菌HNLF-44菌株具有抗氧化活性的原因可能是其在進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)的過程中產(chǎn)生了諸如黃酮類的抗氧化活性物質(zhì)，這表明HNLF-44在與黃花倒水蓮長期共存的過程中可能獲得了產(chǎn)抗氧化活性物質(zhì)的能力。因此，后續(xù)我們需要對HNLF-44的菌株的次級代謝產(chǎn)物進(jìn)一步研究，找出其中的抗氧化和抑菌活性物質(zhì)。

圖 6 基于ITS序列構(gòu)建的HNLF-44菌株的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig. 6 Phylogenetic tree of HNLF-44 strain constructed based on ITS sequence

綜上所述，本研究從黃花倒水蓮內(nèi)生真菌中發(fā)現(xiàn)的一株鏈格孢屬HNLF-44菌株具有良好的抑菌、抗氧化活性，為后續(xù)從HNLF-44菌株中深入挖掘抑菌、抗氧化活性物質(zhì)奠定了優(yōu)良基礎(chǔ)。