長垣市副豬嗜血桿菌病分離鑒定、血清分型與耐藥性檢測

嚴洪濤

（長垣市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，河南 長垣 453400）

副豬嗜血桿菌（Hps）是引起豬格拉瑟氏病的重要病原。Hps作為豬上呼吸道的早期常見定殖菌，也是影響豬群健康的條件致病菌。在豬免疫力下降、免疫抑制或者外界應(yīng)激作用下，通常引起病豬全身感染和多發(fā)性漿膜炎、肺炎、腦膜炎和關(guān)節(jié)炎，出現(xiàn)發(fā)熱、呼吸困難、咳嗽、關(guān)節(jié)腫脹和部分神經(jīng)癥狀。此外，Hps感染豬容易繼發(fā)或混合感染豬圓環(huán)病毒、豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬鏈球菌等其他致病微生物，臨床上共染病例多發(fā)。各品種和生長階段的豬均對Hps具有易感性，2～8周齡的仔豬易感性最強，發(fā)病率一般為10%～15%，死亡率可達50%以上［1］，給養(yǎng)豬業(yè)造成重大經(jīng)濟損失。Hps 血清型較多，有關(guān)專家用兔抗血清作免疫擴散試驗對不同Hps 菌株的熱穩(wěn)定抗原制劑進行測試，發(fā)現(xiàn)存在15個不同的血清型，此外，一些血清型還沒有分型。不同血清型菌株之間缺乏交叉保護，存在地區(qū)差異，甚至同一地區(qū)或豬場其血清型也不盡相同［2］。目前，控制這種疾病的主要方法是接種滅活疫苗，這有許多局限性。例如滅活疫苗并不包含在一個地區(qū)傳播的所有毒力血清型病毒。長期以來抗生素在防治Hps 中得到廣泛應(yīng)用，起到了積極效果，但是不合理地使用使得Hps 耐藥性增強，耐藥譜進一步擴大，增加了防治難度。

該試驗對從河南長垣市部分養(yǎng)豬場采集疑似感染Hps病死豬的肺臟、脾臟、關(guān)節(jié)滲出液等組織病料進行Hps常規(guī)分離、血清型分型鑒定及PCR檢測，并對分離菌株藥敏特性試驗，為副豬嗜血桿菌流行情況和臨床篩選藥物提供參考。

1 材料與方法

1.1 病料來源

無菌采集長垣市部分豬場疑似Hps病死豬的肺臟、脾臟、淋巴結(jié)滲出液等組織病料，共35份。

1.2 主要試劑

胰蛋白大豆瓊脂（TSA）培養(yǎng)基，胰蛋白大豆肉湯（TSB）培養(yǎng)基，犢牛血清，煙酰胺嘌呤二核苷酸（NAD），微量生化鑒定試劑管，抗生素藥敏紙片，HPs 1～15型標準血清試劑盒。

1.3 主要儀器

無菌操作臺，高速臺式冷凍離心機，水浴恒溫（搖床）振蕩器，CO2培養(yǎng)箱，高壓蒸氣滅菌鍋，PCR擴增儀。

1.4 細菌純化培養(yǎng)及鏡檢

用無菌接種環(huán)挑取少許病料接種于TSA平板培養(yǎng)基，置于5%CO2培養(yǎng)箱，37 ℃培養(yǎng)48 h 后，再挑取疑似Hps典型菌落接種TSA平板，繼續(xù)進行37 ℃、24 h純培養(yǎng)。挑取菌落制作涂片，革蘭氏染色，顯微鏡下觀察其形態(tài)學(xué)特征。

1.5 細菌NAD依賴性試驗

挑取單菌落分別接種于營養(yǎng)肉湯、普通瓊脂、血瓊脂平板（含0.1%NAD）、TSA 平板（不含小牛血清和NAD）和TSB 培養(yǎng)基（含小牛血清和NAD），置于5% CO2培養(yǎng)箱，37 ℃培養(yǎng)24～48 h，觀察細菌不同培養(yǎng)基上生長情況與菌落特征。

1.6 生化鑒定

挑取純化培養(yǎng)的單個菌落分別接種含有5%的無菌胎牛血清1 μl 和20% NAD 1 μl 的微量生化鑒定管，置于5%CO2培養(yǎng)箱，37 ℃培養(yǎng)24 h。過氧化氫酶試驗：在載玻片上將1滴3%的H2O2溶液和挑取少許的純培養(yǎng)菌落充分混合均勻，觀察是否產(chǎn)生氣泡。氧化酶試驗：將氧化酶試劑直接滴在備檢菌落上，觀察結(jié)果。

1.7 血清型分型鑒定

參考徐引弟等［3］報道的瓊脂擴散試驗方法進行血清分型。取純化培養(yǎng)菌落，以PSB緩沖液稀釋，8 000 r/min，離心3 min，棄去上清液，再加入PSB 緩沖液，高壓滅菌，8 000 r/min，離心3 min，即得分離菌株的分型抗原，用于瓊脂擴散試驗Hps血清分型鑒定。

1.8 PCR鑒定

采用水煮法提取分離菌基因組DNA，挑取單個菌落加入裝有100 μl 雙蒸水的離心管內(nèi)，混勻，沸水浴10 min后，-20 ℃冰浴10 min，于4 ℃、10 000 r/min離心3 min，取上清液作為DNA 模板備用。根據(jù)Hps 16S rRNA 序列設(shè)計引物，預(yù)期擴增目的基因片段大小822 bp。PCR 擴增反應(yīng)體系為20 μl：2×Master Mix 10 μl，DNA模板2 μl，上、下游引物各1 μl，補足DEPH 水至20 μl。PCR 反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性4 min；95 ℃變性45 s，61 ℃退火40 s，72 ℃延伸60 s，共30 個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。取10 μl目的擴增片段進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.9 藥敏試驗

應(yīng)用美國國家臨床實驗室標準化委員會（NCCLS）推薦的K-B 瓊脂紙片法，檢測分離菌株對11 種抗生素的敏感性，按照CLSI標準結(jié)果判定，抑菌圈直徑＞30 mm 為敏感（S）、20～30 mm為中介（I）、＜20 mm為耐藥（R）。

2 結(jié)果

2.1 細菌純化培養(yǎng)及鏡檢

分離菌在TSA培養(yǎng)基上長出表面光滑隆起、圓形、濕潤、邊緣整齊、灰白色的菌落，大小為0.5～2 mm。革蘭氏染色為革蘭氏陰性短小菌，菌體呈單個的球狀、細長桿狀、絲鏈狀，形體多樣化。

2.2 細菌NAD依賴性試驗

分離菌營養(yǎng)肉湯、普通瓊脂、TSA平板（不含小牛血清和NAD）培養(yǎng)基上均未見菌落生長，而在TSB培養(yǎng)基（含小牛血清和NAD）血瓊脂平板（含0.1%NAD）長成半透明、露珠狀菌落，無溶血現(xiàn)象，且在含有NAD的TSB培養(yǎng)基中生長良好，表明分離菌生長需要NAD。

2.3 生化鑒定結(jié)果

分離菌氧化酶試驗為陰性，過氧化氫酶試驗為陽性；H2S、脲酶、靛基質(zhì)試驗為陰性；發(fā)酵葡萄糖、蔗糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣；不發(fā)酵賴氨酸、甘露醇。有23株分離菌符合Hps生化特征。

2.4 血清分型鑒定

血清分型試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在23株Hps分離菌中，有Hps血清1型7株，血清4型11株，血清5型2株，未定型3株。

2.5 PCR鑒定結(jié)果

利用特異性引物對分離菌株基因組進行PCR 擴增，得到一條長為822 bp 特異性條帶，符合預(yù)期擴增目的大小，見下圖。綜合細菌培養(yǎng)特性、鏡檢、生化特性以及PCR鑒定結(jié)果，可判斷分離菌為Hps。

圖 分離菌株16S rDNA PCR 檢測結(jié)果

2.6 藥敏試驗結(jié)果

藥敏試驗結(jié)果表明，23株分離菌對頭孢曲松、頭孢他啶、頭孢噻肟敏感性較強，對其他抗生素均有不同程度耐藥性，其中對諾氟沙星、復(fù)方新諾明、磺胺嘧啶耐藥性最強，耐藥率分別為69.57%（16/23）、65.22%（15/23）、69.57%（16/23），見下表。

表 23株分離菌對抗生素敏感性檢測結(jié)果

3 討論

該次研究對來自長垣市部分豬場疑似副豬嗜血桿菌病死豬的35 份病料進行細菌分離純培養(yǎng)、鏡檢、生化試驗以及PCR 鑒定，共得到23 株Hps，通過血清型鑒定，23株Hps血清分屬于1、4、5血清型及未定型血清，其中優(yōu)勢血清型為1 型占30.43%（7/23）和4 型占47.83%（11/23）。蔡旭旺等［4］報道，我國豬場Hps 優(yōu)勢流行菌株血清型主要為4、5、12 和13 型。該次血清型的鑒定可為今后Hps疫苗研制、菌株血清型的選擇提供參考。研究表明，長垣市Hps 在豬場普遍存在，血清型比較多樣化，流行菌株復(fù)雜，應(yīng)引起重視。Hps 具有兼性厭氧和V 因子依賴性生長的特點，其分離培養(yǎng)條件比較特殊。Hps 對營養(yǎng)要求很高，初次分離培養(yǎng)需要供給5%～10%的CO2促進生長，且其生長需要V因子［5］。此外，病料采集盡量來自未使用抗生素治療的病豬和死亡時間在12 h 以內(nèi)的病死豬。

不同地區(qū)、不同血清型Hps 菌株對同一類抗生素的敏感性有所差異。藥敏試驗可以檢測不同Hps 菌株對抗生素的敏感性，以便了解當(dāng)?shù)乜股刂委熜Ч?，為臨床合理使用抗生素提供參考依據(jù)。目前，Hps 疫苗接種和抗生素是防控該病的主要有效措施，但是疫苗菌株與田間流行株存在差異，缺乏交叉保護，有可能導(dǎo)致免疫失敗。抗生素長期濫用引起耐藥性增強以及細菌耐藥機制發(fā)生變化，使得抗生素選擇壓力越來越大。該研究中23 株分離菌對大多數(shù)抗生素均有耐藥性，僅對頭孢曲松、頭孢他啶、頭孢噻肟敏感性較強。這可能與治療Hps 病選用抗生素有關(guān)，也可能與菌株在適應(yīng)環(huán)境生存中產(chǎn)生新的變異株有關(guān)。建議選用敏感性強的抗生素進行防治，且交替使用抗生素，避免耐藥菌株發(fā)生。