膝痹寧通過CPT1調(diào)節(jié)大鼠滑膜氧化還原穩(wěn)態(tài)緩解膝骨關(guān)節(jié)炎疼痛的效應(yīng)機(jī)制

廖太陽，張力，丁亮，李曉辰，吳鵬，梅偉，張農(nóng)山，王培民，張立*

1南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院骨傷科，江蘇 南京 210029；2江蘇省中醫(yī)院骨傷科，江蘇 南京 210029；3南京中醫(yī)藥大學(xué)代謝病中醫(yī)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210023

膝骨關(guān)節(jié)炎(knee osteoarthritis，KOA)患者最強(qiáng)烈、迫切的訴求為緩解疼痛癥狀[1]，以歐洲為例，20%的慢性疼痛是由骨關(guān)節(jié)炎造成的[2]。研究KOA疼痛的機(jī)制發(fā)現(xiàn)，背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganglion，DRG)神經(jīng)元細(xì)胞膜上瞬時(shí)受體電位A1離子通道(transient receptor potential A1 channel，TRPA1)激活可導(dǎo)致Ca2+內(nèi)流，引起痛覺過敏和疼痛，故可作為潛在的藥物作用靶點(diǎn)[3-5]。氧化還原穩(wěn)態(tài)是機(jī)體對(duì)感染、炎癥等不同應(yīng)激的一種生理校正反應(yīng)，維持氧化還原穩(wěn)態(tài)是生物體生存與發(fā)展最基本的需求之一[6]。有研究發(fā)現(xiàn)，由于炎癥、肥胖、代謝等因素，KOA也存在氧化還原穩(wěn)態(tài)失衡的表現(xiàn)[7]，脂肪酸β氧化在其中起著重要作用，而影響脂肪酸β氧化的關(guān)鍵限速酶為肉毒堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶(carnitine palmitoyl transferase 1，CPT1)[8]。既往研究發(fā)現(xiàn)，局部組織的氧化還原穩(wěn)態(tài)失衡會(huì)影響DRG神經(jīng)元的興奮性，從而影響疼痛的敏感性[9-10]。本課題組前期臨床研究發(fā)現(xiàn)，膝痹寧能有效緩解患者平地行走疼痛、晨僵等癥狀，明顯改善膝關(guān)節(jié)活動(dòng)度[11-12]；另有研究發(fā)現(xiàn)，膝痹寧緩解KOA疼痛的機(jī)制可能與抑制破骨細(xì)胞中基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1/CXC型趨化因子受體4型(stromal cell-derived factor 1/CXC chemokine receptor 4，SDF-1/CXCR4)信號(hào)軸的激活、減少疼痛因子的釋放相關(guān)[13]；OA患者的滑膜細(xì)胞脂質(zhì)過氧化增強(qiáng)[14]。本研究旨在探討膝痹寧通過CPT1調(diào)節(jié)滑膜氧化還原穩(wěn)態(tài)緩解KOA疼痛的效應(yīng)機(jī)制，以期為進(jìn)一步探索膝痹寧的治療靶點(diǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 膝痹寧為江蘇省中醫(yī)院骨傷科治療KOA慢性疼痛的經(jīng)驗(yàn)效方、專利成方，由江蘇省中醫(yī)院制劑部提供；預(yù)制膠購自南京艾思易生物科技有限公司；RNA提取試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑、PCR試劑、ECL購自南京Vazyme公司；丙二醛(malonic dialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、CPT1酶活性檢測試劑盒購自深圳Ziker公司；兔CPT1一抗、小鼠GAPDH一抗購自美國ProteinTech公司；兔TRPA1一抗及羊抗兔、羊抗小鼠二抗購自美國Affinity公司；兔肉堿/有機(jī)陽離子轉(zhuǎn)運(yùn)體1(carnitine/organic cation transporters 1，OCTN1)一抗、小鼠βⅢ-微管蛋白(βⅢ-tubulin)一抗購自武漢Bioss公司；兔膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)一抗購自美國Boster公司；大鼠降鈣素基因相關(guān)肽(calcitonin gene related peptide，CGRP)、P物質(zhì)(substance P，SP)試劑盒購自南京金益柏生物科技有限公司；CCK-8購自美國APExBIO公司；TRPA1激動(dòng)劑(Diphenyleneiodonium chloride)購自美國MCE公司；胎牛血清、Ⅰ型膠原酶購自美國Gibco公司；人血漿纖連蛋白、脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)、2',7'-二氯熒光素二乙酸酯購自美國Sigma公司；青霉素-鏈霉素溶液、胰酶購自南京Biosharp公司；Fluo-4 AM、F-127、1M Hepes、抗熒光淬滅封片液、免疫染色封閉液、BCA蛋白檢測試劑盒、RIPA購自上海Beyotime公司；DMEM培養(yǎng)基購自美國Corning公司。冷凍干燥機(jī)購自杭州川一實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；AB7500型實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)購自美國Applied Biosystems公司；蛋白電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀購自美國Bio-Rad公司；LAS4000型超靈敏化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)購自美國GE公司；LSM700型激光共聚焦顯微鏡購自德國Zeiss公司；酶標(biāo)儀購自美國EnSpire公司；DMI3000B型熒光倒置顯微鏡購自德國Leica公司。

1.2 膝痹寧凍干粉制備 依據(jù)膝痹寧方臨床使用劑量[11](1劑/d)：淡附片、桂枝、制狗脊、紫河車、山萸肉、巴戟天、川牛膝、生甘草、炒白芍各10 g，生薏苡仁、制何首烏各15 g。稱重上述藥材并混和，加水400 ml浸泡1 h后武火煎煮沸騰，兩次煎煮并合并藥液，最后以文火濃縮藥液至100 ml，則藥物濃度為1.2 g生藥/ml(膝痹寧水煎液)，采用真空冷凍干燥法將藥液水分凍干24 h，得到干燥的膝痹寧凍干粉末。

1.3 成纖維樣滑膜細(xì)胞(fibroblast-like synovial cells，F(xiàn)LS)制備 SPF級(jí)SD雄性大鼠75只，體重160～180 g，2月齡，由杭州醫(yī)學(xué)院提供[動(dòng)物使用許可證號(hào)：SCXK(浙)2019-0002]。實(shí)驗(yàn)過程符合國家和單位有關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的管理和使用規(guī)定。

參照張力等[15]的方法，從大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜中分離培養(yǎng)FLS細(xì)胞。取25只大鼠，脫頸處死，用75%乙醇消毒5 min，取滑膜組織于PBS中沖洗3次，剪碎，用5 mg/ml Ⅰ型膠原酶37 ℃下消化4 h，過濾離心后，用含10%胎牛血清、1%青-鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)基(以下簡稱“完全培養(yǎng)基”)重懸于100 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，在37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中(培養(yǎng)條件下同)培養(yǎng)過夜，24 h后換液。取第3～6代FLS細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，以確保生物特性及細(xì)胞活性。

1.3.1 CCK-8法檢測細(xì)胞存活率 將FLS細(xì)胞接種至96孔板中(1×104個(gè)/孔)，培養(yǎng)24 h。隨機(jī)分為對(duì)照組(含細(xì)胞，不含藥物)與不同劑量膝痹寧組(100、200、400、800 μg/ml)，同時(shí)設(shè)置不含細(xì)胞和藥物的空白對(duì)照組，每組6個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24 h后，各孔加入CCK-8試劑10 μl孵育2 h，使用酶標(biāo)儀檢測450 nm波長處各孔的光密度(OD)值，計(jì)算細(xì)胞存活率。選擇對(duì)細(xì)胞活性無影響的膝痹寧濃度100 μg/ml進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 Real-time PCR檢測CPT1、OCTN1mRNA的表達(dá) 將FLS細(xì)胞接種至6孔板中(1×105個(gè)/孔)，培養(yǎng)24 h。設(shè)置對(duì)照組、KOA組與膝痹寧組(100 μg/ml膝痹寧)，每組3個(gè)復(fù)孔。KOA組和膝痹寧組加入5 μg/ml LPS刺激24 h以誘導(dǎo)KOA炎性細(xì)胞模型，然后膝痹寧組加入含100 μg/ml膝痹寧的完全培養(yǎng)基2 ml，對(duì)照組僅加入等體積無菌PBS，培養(yǎng)24 h。采用RNA提取試劑提取細(xì)胞總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，共40個(gè)循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算目標(biāo)基因mRNA相對(duì)表達(dá)量。引物由上海捷瑞生物工程有限公司提供，序列如表1所示。

表1 Real-time PCR引物序列Tab.1 Primer sequences of real-time PCR

1.3.3 Western blotting檢測CPT1、OCTN1蛋白的表達(dá) 將FLS細(xì)胞接種至6孔板中(1×105個(gè)/孔)，培養(yǎng)24 h。按照1.3.2方法分組、造模、給藥，培養(yǎng)24 h。使用RIPA裂解液裂解細(xì)胞并提取總蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度，取20 μg上樣行SDS-PAGE電泳，并轉(zhuǎn)至PDVF膜上，以5%脫脂奶粉室溫封閉2 h；加入GAPDH(1:50 000)、CPT1(1:1000)、OCTN1(1:1000)一抗4 ℃孵育過夜；TBST洗膜，加入二抗(1:5000)室溫孵育1 h；TBST洗膜，加入ECL顯色。采用ImageJ軟件分析，以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參蛋白(GAPDH)條帶灰度值的比值為目標(biāo)蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.3.4 CPT1酶活性檢測 將FLS細(xì)胞接種至100 mm培養(yǎng)皿中(5×106個(gè)/皿)，培養(yǎng)24 h。棄去培養(yǎng)基，按照1.3.2方法分組、造模、給藥。培養(yǎng)24 h后，收集細(xì)胞，加入1 ml試劑一(116 mmol/L Tris，2.5 mmol/L EDTA)和10 μl試劑三(0.2% Triton X-100)，混勻后于4 ℃下500 r/min離心5 min，棄沉淀，將上清液移至另一離心管中，4 ℃下12 000 r/min離心10 min；加入200 μl試劑二(2 mmol/L DTNB)和2 μl試劑三，超聲破碎，在96孔板中加入10 μl樣本、220 μl試劑五(1.2 mmol/L左旋肉堿)和10 μl試劑六[1 mmol/L乙酰輔酶A(CoA)]，混勻后，于412 nm波長處記錄20 s時(shí)的初始吸光度A1和2 min 20 s時(shí)的吸光度A2，計(jì)算CPT1酶活性。CPT1酶活性(mmol/min)=355.6×(A2-A1)。

1.3.5 MDA含量及SOD活性檢測 將FLS細(xì)胞接種至100 mm培養(yǎng)皿中(5×106個(gè)/皿)，培養(yǎng)24 h。棄去培養(yǎng)基，按照1.3.2方法分組、造模、給藥。培養(yǎng)24 h后，收集細(xì)胞，嚴(yán)格按相應(yīng)試劑盒說明書步驟操作，MDA記錄532 nm和600 nm處的吸光度值，SOD記錄450 nm處的吸光度值，計(jì)算MDA含量和SOD活性。MDA含量(nmol/ml)=51.6×(A532-A600)；SOD活性(U/ml)=20×抑制百分率/(1-抑制百分率)，其中抑制百分率(%)=(A對(duì)照組-A實(shí)驗(yàn)組)/A對(duì)照組×100%。

1.3.6 活性氧(ROS)水平檢測 使用2',7'-二氯熒光素二乙酸酯檢測ROS水平。將FLS細(xì)胞接種至6孔板中(1×105個(gè)/孔)，培養(yǎng)24 h后，棄去培養(yǎng)基，按照1.3.2方法分組、造模、給藥。培養(yǎng)24 h后，棄去培養(yǎng)基。各孔加入1 ml ROS工作液(10 μmol/L)，37 ℃避光孵育15 min，于熒光倒置顯微鏡下觀察并拍照。

1.4 DRG神經(jīng)元細(xì)胞制備 取50只大鼠，脫頸處死，用75%乙醇浸泡消毒3 min，沿背部正中線剪開皮膚，向兩側(cè)鈍性分離筋膜及肌肉，手術(shù)刀片離斷韌帶，取出脊柱后，PBS沖洗，在體式顯微鏡下取DRG組織并用5 mg/ml Ⅰ型膠原酶水浴消化60～70 min，消化結(jié)束后，過70目細(xì)胞篩，1000 r/min離心8.5 min。在培養(yǎng)皿中滴加1 ml 2%人血漿纖連蛋白溶液包被培養(yǎng)皿1 h，用無菌純水清洗3次，1 ml完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，計(jì)數(shù)后接種至35 mm培養(yǎng)皿內(nèi)，8 h后換液。

1.4.1 βⅢ-tubulin與GFAP免疫熒光染色鑒定DRG神經(jīng)元細(xì)胞 將DRG細(xì)胞接種至35 mm培養(yǎng)皿中(5×105個(gè)/皿)，培養(yǎng)3～5 d，棄去培養(yǎng)基；用4%多聚甲醛溶液固定細(xì)胞，加入2 ml免疫熒光通透液通透細(xì)胞，2 ml免疫染色封閉液封閉1 h；加入βⅢ-tubulin(1:200)、GFAP(1:200)一抗4 ℃孵育過夜；37 ℃下加入羊抗兔二抗(1:250)、羊抗小鼠二抗(1:1000)孵育1 h。滴加適量抗熒光淬滅封片液15 min，于免疫熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.4.2 Real-time PCR和Western blotting檢測TRPA1mRNA和蛋白表達(dá)水平 將DRG神經(jīng)元細(xì)胞接種至35 mm培養(yǎng)皿中(5×105個(gè)/皿)，培養(yǎng)5～7 d。設(shè)置對(duì)照組(用對(duì)照組FLS細(xì)胞上清干預(yù))、KOA組(用KOA組FLS細(xì)胞上清干預(yù))、膝痹寧組(用膝痹寧組FLS細(xì)胞上清干預(yù))，KOA組和膝痹寧組加入5 μg/ml LPS刺激24 h，吸棄液體，然后對(duì)照組、KOA組和膝痹寧組直接加入1.3.2中各組細(xì)胞上清干預(yù)24 h，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，采用Real-time PCR和Western blotting檢測TRPA1mRNA和蛋白表達(dá)水平，操作步驟同1.3.2、1.3.3。引物序列如表1所示。

1.4.3 實(shí)時(shí)熒光鈣成像觀察Ca2+內(nèi)流情況 將DRG神經(jīng)元細(xì)胞接種至35 mm培養(yǎng)皿中(5×105個(gè)/皿)，培養(yǎng)5～7 d。按照1.4.2方法分組、給藥。培養(yǎng)24 h后，各組用含F(xiàn)luo-4(5 μmol/L)及F-127(0.1%)的Hepes(25 mmol/L)緩沖液避光孵育30 min。隨后通過共聚焦顯微鏡觀察，觀察過程中需實(shí)時(shí)加入10 μmol/L的TRPA1激動(dòng)劑(Diphenyleneiodonium chloride)10 μl，在495/518 nm激發(fā)波長處記錄0、20、40、60 s時(shí)Ca2+流入DRG胞內(nèi)引起的平均熒光強(qiáng)度變化情況。

1.4.4 ELISA法檢測CGRP、SP表達(dá)水平 將DRG神經(jīng)元細(xì)胞接種至35 mm培養(yǎng)皿中(5×105個(gè)/皿)，培養(yǎng)5～7 d。按照1.4.2方法分組、給藥。培養(yǎng)24 h后，收集上清液。嚴(yán)格按CGRP、SP檢測試劑盒說明書步驟操作，測定450 nm波長處各孔OD值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，使用GraphPad 7.04軟件繪圖。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)(方差齊時(shí))或Dunnett's T3檢驗(yàn)(方差不齊時(shí))。P＆lt;0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 膝痹寧對(duì)FLS細(xì)胞存活率的影響 CCK-8法檢測結(jié)果顯示，與對(duì)照組(100.00%±0.05%)比較，100 μg/ml膝痹寧組細(xì)胞存活率無明顯變化(98.40%±0.08%，P＆gt;0.05)，200、400、800 μg/ml膝痹寧組細(xì)胞存活率明顯降低(87.03%±0.01%、84.18±0.07%、81.10%±0.05%，P＆lt;0.05)。據(jù)此選擇100 μg/ml膝痹寧進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 膝痹寧對(duì)FLS細(xì)胞中CPT1、OCTN1mRNA和蛋白表達(dá)的影響 Real-time PCR和Western blotting檢測結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，KOA組CPT1、OCTN1mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯降低(P＆lt;0.05)；與KOA組比較，膝痹寧組CPT1、OCTN1mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯升高(P＆lt;0.05，圖1)。

圖1 各組大鼠FLS細(xì)胞中CPT1、OCTN1 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量比較Fig.1 Comparison of the mRNA and protein relative expression levels of CPT1 and OCTN1 in FLS cells of rats in each group

2.3 膝痹寧對(duì)FLS細(xì)胞中CPT1、SOD活性及MDA含量的影響 與對(duì)照組比較，KOA組CPT1、SOD活性降低(P＆lt;0.05)，MDA含量升高(P＆lt;0.05)；與KOA組比較，膝痹寧組CPT1、SOD活性升高(P＆lt;0.05)，MDA含量降低(P＆lt;0.05，表2)。

表2 各組大鼠FLS細(xì)胞中CPT1、SOD活性及MDA含量比較(±s, n=3)Tab.2 Comparison of CPT1 and SOD activity and MDA content in FLS cells of rats in each group (±s, n=3)

表2 各組大鼠FLS細(xì)胞中CPT1、SOD活性及MDA含量比較(±s, n=3)Tab.2 Comparison of CPT1 and SOD activity and MDA content in FLS cells of rats in each group (±s, n=3)

FLS.膝關(guān)節(jié)成纖維樣滑膜細(xì)胞；CPT1.肉毒堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶；SOD.超氧化物歧化酶；MDA.丙二醛；KOA.膝骨關(guān)節(jié)炎；與對(duì)照組比較，(1)P＆lt;0.05；與KOA組比較，(2)P＆lt;0.05

組別 CPT1(nmol/min) SOD(U/ml) MDA(nmol/ml)對(duì)照組 11.50±0.21 17.60±0.07 2.77±0.03 KOA組 4.98±0.02(1) 11.38±0.05(1) 3.13±0.02(1)膝痹寧組 7.94±0.21(1)(2) 13.81±0.07(1)(2) 2.87±0.01(1)(2)

2.4 膝痹寧對(duì)FLS細(xì)胞中ROS水平的影響 2',7'-二氯熒光素二乙酸酯作為ROS熒光探針，顯示的綠色熒光強(qiáng)度與細(xì)胞內(nèi)ROS水平呈正比。與對(duì)照組比較，KOA組平均熒光強(qiáng)度升高[(26.46±2.07) AUvs.(5.52±0.78) AU，P＆lt;0.05]；與KOA組比較，膝痹寧組平均熒光強(qiáng)度降低[(14.07±1.41) AU，P＆lt;0.05，圖2]。

圖2 各組大鼠FLS細(xì)胞中ROS熒光表達(dá)情況Fig.2 ROS fluorescence expression in FLS cells of rats in each group

2.5 βⅢ-tubulin與GFAP免疫熒光染色鑒定DRG神經(jīng)元細(xì)胞 熒光顯微鏡觀察顯示，培養(yǎng)3 d時(shí)，βⅢ-tubulin標(biāo)記的DRG細(xì)胞呈綠色熒光，表現(xiàn)為胞體呈圓形或橢圓形，軸突之間大量生長并連接成網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)，而GFAP標(biāo)記的衛(wèi)星膠質(zhì)細(xì)胞呈紅色熒光，表達(dá)極少，表明提取的DRG神經(jīng)元細(xì)胞可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)(圖3)。

圖3 大鼠DRG神經(jīng)元細(xì)胞βⅢ-tubulin與GFAP免疫熒光染色(×100)Fig.3 βⅢ-tubulin and GFAP immunofluorescence staining in DRG neuron cells of rats (×100)

2.6 膝痹寧對(duì)DRG神經(jīng)元細(xì)胞中TRPA1mRNA和蛋白表達(dá)的影響 Real-time PCR和Western blotting檢測結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，KOA組TRPA1mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯增高(P＆lt;0.05)；與KOA組比較，膝痹寧組TRPA1mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯降低(P＆lt;0.05，圖4)。

圖4 各組大鼠DRG神經(jīng)元細(xì)胞中TRPA1 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量比較Fig.4 Comparison of the mRNA and protein relative expression levels in TRPA1 of DRG neuron cells of rats in each group

2.7 各組DRG神經(jīng)元細(xì)胞中TRPA1開放后Ca2+內(nèi)流情況 熒光顯微鏡觀察顯示，對(duì)照組、KOA組、膝痹寧組DRG神經(jīng)元細(xì)胞在20 s的共聚焦鈣成像熒光強(qiáng)度分別為(82.31±2.69) AU、(1 2 0.1 4±1.7 2) A U、(9 7.9 3±2.4 3) A U，4 0 s 的熒光強(qiáng)度分別為(9 5.2 1±2.5 8) A U、(127.78±2.22) AU、(110.85±4.87) AU，60 s的熒光強(qiáng)度分別為(97.47±1.86) AU、(150.46±2.12) AU、(140.22±4.39) AU。與對(duì)照組比較，KOA組20、40、60 s的熒光強(qiáng)度升高(P＆lt;0.05)，表明KOA組DRG神經(jīng)元細(xì)胞Ca2+內(nèi)流增強(qiáng)；與KOA組比較，膝痹寧組20、40、60 s的熒光強(qiáng)度降低(P＆lt;0.05)，表明膝痹寧減弱了DRG細(xì)胞神經(jīng)元的Ca2+內(nèi)流(圖5)。

圖5 各組大鼠DRG神經(jīng)元細(xì)胞中TRPA1通道開放后Ca2+內(nèi)流情況(×630)Fig.5 Calcium influx in DRG neuron cells of rats after TRPA1 pathway opening (×630)

2.8 膝痹寧對(duì)DRG神經(jīng)元細(xì)胞上清液中CGRP、S P 表達(dá)的影響 E L I S A 檢測結(jié)果顯示，對(duì)照組、K O A 組、膝痹寧組D R G 神經(jīng)元細(xì)胞上清液中CGR P表達(dá)量分別為(6.34±0.96) ng/L、(30.19±1.58) ng/L、(19.93±1.2) ng/L，SP表達(dá)量分別為(22.64±2.93) ng/L、(123.16±2.95) ng/L、(84.23±1.26) ng/L。與對(duì)照組比較，KOA組DRG神經(jīng)元細(xì)胞上清液中CGRP、SP表達(dá)量明顯升高(P＆lt;0.05)；與KOA組比較，膝痹寧組DRG神經(jīng)元細(xì)胞上清液中CGRP、SP表達(dá)量明顯降低(P＆lt;0.05)。

βⅢ-tubulin GFAP DAPI 合并

3 討 論

KOA作為一種致殘性關(guān)節(jié)疾病遷延不愈，其引起的慢性疼痛是患者就醫(yī)的主要原因[16]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國45歲以上人群癥狀性KOA發(fā)病率高達(dá)8.1%，給患者和社會(huì)帶來了沉重的健康和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[17]。部分患者即使手術(shù)也無法徹底緩解疼痛，分析原因與軟骨退變、骨質(zhì)病變、滑膜炎癥等組織產(chǎn)生一系列致炎因子、疼痛因子有關(guān)[18]。KOA疼痛的產(chǎn)生依賴于外周傷害性刺激，刺激信號(hào)產(chǎn)生后，沿脊髓背角傳遞，經(jīng)由神經(jīng)元傳導(dǎo)到中樞神經(jīng)系統(tǒng)，最終在大腦皮質(zhì)產(chǎn)生疼痛感覺，其中DRG作為初級(jí)感覺神經(jīng)元能將外周疼痛信號(hào)傳遞至脊髓，是疼痛傳導(dǎo)過程的“中繼站”，而DRG神經(jīng)元細(xì)胞膜上TRPA1離子通道的激活引發(fā)Ca2+內(nèi)流，是導(dǎo)致疼痛發(fā)生的重要機(jī)制，因此，DRG上的TRPA1離子通道成為治療疼痛的關(guān)鍵靶點(diǎn)[19]。

肥胖是KOA發(fā)病的高危因素，亦是慢性疼痛發(fā)展的重要危險(xiǎn)因素[16,20]。肥胖癥的特點(diǎn)為脂肪酸水平增高及脂肪酸代謝異常[21]。眾多研究表明，脂肪酸代謝參與了KOA復(fù)雜的病程，調(diào)控脂肪酸代謝有助于緩解關(guān)節(jié)疼痛及改善其功能[22]。脂肪酸代謝的主要途徑是線粒體脂肪酸β氧化，即脂肪酸的分解代謝首先被活化，生成脂酰乙酰CoA，活化的脂酰CoA必須先進(jìn)入線粒體才能氧化，但長鏈脂酰CoA不能直接透過線粒體內(nèi)膜，因此活化的脂酰CoA要借助肉堿才能轉(zhuǎn)運(yùn)入線粒體內(nèi)，而CPT1是這一轉(zhuǎn)運(yùn)過程的催化劑，決定了其轉(zhuǎn)運(yùn)效率[8,23]。此外，氧化還原穩(wěn)態(tài)是機(jī)體在應(yīng)激條件下的一種機(jī)體平衡反應(yīng)，維持氧化還原穩(wěn)態(tài)是生物體生存與發(fā)展最基本的需求之一[6]。作為由于肥胖、代謝等因素造成的疾病，KOA也存在氧化還原穩(wěn)態(tài)失衡的表現(xiàn)[7]，其中，脂肪酸β氧化在氧化還原穩(wěn)態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮了十分重要的作用，而影響脂肪酸β氧化的關(guān)鍵限速酶CPT1可增加進(jìn)入線粒體的脂肪酸通量[8]。目前研究發(fā)現(xiàn)，局部組織的氧化還原穩(wěn)態(tài)失衡會(huì)影響DRG神經(jīng)元的興奮性，從而影響疼痛的敏感性[9-10]。因此，探究組織氧化還原穩(wěn)態(tài)、CPT1調(diào)控下的脂肪酸β氧化與KOA疼痛三者之間的關(guān)系具有重要意義。

本研究首先在FLS細(xì)胞中用5 μg/ml LPS模擬KOA炎癥環(huán)境，發(fā)現(xiàn)LPS誘導(dǎo)的炎癥可抑制CPT1、OCTN1的表達(dá)，與既往研究結(jié)果一致[24-25]。細(xì)胞膜上存在著多種轉(zhuǎn)運(yùn)體，它們在內(nèi)源性化合物如肉堿的體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)中發(fā)揮重要作用，F(xiàn)LS細(xì)胞的炎癥環(huán)境可能影響OCTN1的轉(zhuǎn)運(yùn)過程及CPT1的轉(zhuǎn)運(yùn)效率。本研究結(jié)果顯示，KOA組ROS水平和MDA含量升高，SOD活性下調(diào)，表明LPS處理破壞了FLS細(xì)胞的氧化還原穩(wěn)態(tài)，而用膝痹寧處理后ROS水平和MDA含量降低，SOD活性升高，表明膝痹寧可幫助恢復(fù)被破壞的氧化還原穩(wěn)態(tài)。進(jìn)一步提取、培養(yǎng)及鑒定大鼠DRG神經(jīng)元細(xì)胞，并將FLS細(xì)胞上清加入DGR神經(jīng)元細(xì)胞中，結(jié)果顯示，膝痹寧下調(diào)了TRPA1mRNA和蛋白的表達(dá)；FLS細(xì)胞中被破壞的氧化還原穩(wěn)態(tài)環(huán)境在DRG神經(jīng)元細(xì)胞中可引起Ca2+內(nèi)流強(qiáng)度的變化，伴隨著TRPA1表達(dá)的變化，細(xì)胞上清中CGRP、SP表達(dá)量也發(fā)生變化，而膝痹寧對(duì)于此過程具有干預(yù)效應(yīng)。由此可見，膝痹寧可通過CPT1調(diào)節(jié)滑膜細(xì)胞氧化還原穩(wěn)態(tài)影響DRG神經(jīng)元細(xì)胞膜上TRPA1的Ca2+內(nèi)流及減少疼痛因子的分泌，從而發(fā)揮減輕KOA疼痛的作用。這可為KOA疼痛深層機(jī)制的研究、新靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)提供參考。

本研究存在不足之處：脂質(zhì)代謝通路中某些特定成分和關(guān)鍵調(diào)節(jié)酶的相關(guān)變化及相互作用仍有待研究，靶向TRPA1實(shí)現(xiàn)鎮(zhèn)痛的深層次機(jī)制尚不明確，也未從整體動(dòng)物水平觀察膝痹寧減輕KOA大鼠疼痛的影響及機(jī)制。值得注意的是，本研究采取膝痹寧凍干粉的形式干預(yù)細(xì)胞，是因?yàn)橄ケ詫幗M方及所含化學(xué)成分復(fù)雜，中藥凍干粉的形式可為中藥復(fù)方的質(zhì)量控制提供借鑒，采取這種方式作用于細(xì)胞的研究近幾年逐漸增多[26-27]。此外，復(fù)方水提物凍干粉因?yàn)閲?yán)格按照臨床使用量煎煮、凍干，具有操作時(shí)間短、實(shí)驗(yàn)重復(fù)性好、藥物濃度可控、容易進(jìn)行檢測等優(yōu)點(diǎn)[28]，但并不能真正模擬膝痹寧在體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)，其自身的理化性質(zhì)可能會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生干擾，若采取含藥血清則能反映口服中藥在體內(nèi)的消化吸收、代謝及最后產(chǎn)生的藥理效應(yīng)，但中藥血清藥理學(xué)也存在如動(dòng)物個(gè)體差異(年齡、性別、質(zhì)量等)，給藥方案差異，選擇生理還是病理狀態(tài)下制備的含藥血清，以及含藥血清中的活性成分可能會(huì)干擾細(xì)胞影響藥效的客觀評(píng)價(jià)等問題[29]。未來應(yīng)采取多種中藥干預(yù)方法進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)，深入研究膝痹寧鎮(zhèn)痛的物質(zhì)基礎(chǔ)與療效機(jī)制。

綜上所述，膝痹寧可能通過CPT1調(diào)節(jié)滑膜細(xì)胞氧化還原穩(wěn)態(tài)而影響DRG神經(jīng)元細(xì)胞膜上TRPA1的Ca2+內(nèi)流，減少疼痛因子的分泌，從而發(fā)揮減輕KOA疼痛的作用。該結(jié)果為膝痹寧臨床治療KOA疼痛提供了理論依據(jù)，但膝痹寧治療KOA疼痛的機(jī)制仍待進(jìn)一步研究。