miR-491-5p對(duì)缺氧誘導(dǎo)的滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用及其機(jī)制

全尚琨，張輝，李昱霖，胡舒彤，盛思琪，張晴，劉達(dá)越，姜怡鄧，李桂忠*

1寧夏醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，寧夏 銀川 750004；2國家衛(wèi)生健康委員會(huì)代謝性心血管疾病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，寧夏 銀川750004；3寧夏血管損傷與修復(fù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，寧夏 銀川 750004

子癇前期(preeclampsia，PE)是一種較為常見的妊娠高血壓疾病類型，其主要臨床表現(xiàn)為妊娠20周后孕婦出現(xiàn)高血壓、蛋白尿、水腫等，是孕產(chǎn)婦和胎兒發(fā)病及死亡的主要原因之一[1]。研究顯示，胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞浸潤(rùn)不足、凋亡過多、螺旋動(dòng)脈重構(gòu)不良是該病的主要病理特征[2-3]。滋養(yǎng)細(xì)胞作為一種來自胚胎外滋養(yǎng)層、具有滋養(yǎng)功能的細(xì)胞，其功能異常和結(jié)構(gòu)變化與妊娠期多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞缺氧是PE發(fā)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。MicroRNAs(miRNAs)是一類廣泛存在于真核細(xì)胞，具有基因表達(dá)調(diào)控功能的內(nèi)源性非編碼RNA。研究顯示，miRNA與多種生物學(xué)功能(細(xì)胞自噬、增殖、凋亡等)有關(guān)[4-5]；PE患者胎盤組織中miRNA表達(dá)多存在異常，提示miRNA可能參與滋養(yǎng)細(xì)胞的功能異常。miR-491-5p與多種癌細(xì)胞的增殖和凋亡有關(guān)[6]，但其對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞的影響尚不明確。本研究復(fù)制滋養(yǎng)細(xì)胞缺氧模型，旨在探討miR-491-5p對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡的影響，并尋找關(guān)鍵靶基因，從而為PE的診斷及治療提供更多依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料及試劑 人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞(HTR-8/SV-neo)購自上海瑞鹿生物技術(shù)有限公司；胎牛血清、RPMI 1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；青霉素-鏈霉素，含酚紅、EDTA胰蛋白酶消化液購自中國Solarbio公司；qRT-PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司；細(xì)胞總RNA提取試劑盒購自中國TIANGEN公司；miR-491-5p mimic、miR-491-5p inhibitor由中國Genepharma公司合成；脂質(zhì)體(LipofectamineTM2000) 購自美國 Invitrogen 公司；雙熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒購自美國Promega公司；miR-491-5p 引物購自生工生物工程(上海)股份有限公司；B-細(xì)胞淋巴瘤因子2樣蛋白2(BCL2L2)抗體購自美國Proteintech公司；B淋巴細(xì)胞瘤-2(Bcl-2)和Bax蛋白抗體購自英國Abcam公司。

1.2 儀器與設(shè)備 超凈工作臺(tái)(蘇州安泰)；CO2培養(yǎng)箱(德國Heraeus 公司)；5415D 型微量臺(tái)式離心機(jī)(德國Eppendorf 公司)；超微量分光光度計(jì)(美國SimpliNano 公司)；垂直電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀、曝光儀(美國Bio-Rad 公司)；BS110S 型精密天平(德國Sartorius 公司)；水平搖床(美國Thermo Fisher 公司)；梯度 RCR 儀(德國Biometra Tone 公司)；熒光定量 PCR 儀(上海楓嶺)；ACEA NovoCyte 流式細(xì)胞儀(美國艾森生物)；激光共聚焦顯微鏡(德國ZEISS公司)。

1.3 研究方法

1.3.1 細(xì)胞分組 選取HTR-8/SV-neo細(xì)胞，設(shè)對(duì)照組和缺氧組，觀察缺氧對(duì)細(xì)胞凋亡、凋亡相關(guān)蛋白(Bcl-2、Bax)和miR-491-5p表達(dá)的影響；另設(shè)缺氧+miR-491-5p mimic組和缺氧+miR-491-5p inhibitor組，觀察miR-491-5p對(duì)缺氧誘導(dǎo)的滋養(yǎng)細(xì)胞 凋亡及BCL2L2、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)的影響。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 (1)細(xì)胞培養(yǎng)：用含有10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)HTR-8/SV-neo細(xì)胞，置于37 ℃、5%CO2環(huán)境中。(2)細(xì)胞轉(zhuǎn)染：將HTR-8/SV-neo細(xì)胞接種于6孔板中，培養(yǎng)過夜，待細(xì)胞密度達(dá)到70%時(shí)，采用RPMI 1640培養(yǎng)基，按照Lipofectamine 2000操作說明進(jìn)行脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染；轉(zhuǎn)染6 h后更換完全培養(yǎng)基，缺氧組細(xì)胞置于缺氧袋中缺氧處理，培養(yǎng)48 h，收取細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 細(xì)胞活力染色觀察細(xì)胞凋亡情況 棄去培養(yǎng)基，PBS清洗3次，按照以下比例配制染料：在15 ml離心管中依次加入5 ml PBS和5 μl NucleiDye、25 μl Dead Dye、3 μl Viable Dye；將3種染料混合后，在每個(gè)培養(yǎng)皿中依次加入200 μl混合染料，于37 ℃孵育30 min后取出，激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡情況。其中紅色(Cy3)提示為凋亡細(xì)胞，綠色(FITC)提示為正常細(xì)胞，藍(lán)色(DAPI)提示為細(xì)胞核。

1.3.4 Western blotting檢測(cè)BCL2L2、Bax、Bcl-2蛋白的表達(dá) 蛋白裂解液收集細(xì)胞蛋白樣品，定量后進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離、轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，室溫下使用BCL2L2抗體(1:2000)、Bax抗體(1:1000)、Bcl-2抗體(1:1000)4 ℃孵育過夜；PBST洗滌3次后加入HRP標(biāo)記的二抗，室溫下孵育2 h；洗滌后加入化學(xué)發(fā)光液顯色，成像后拍照，利用軟件進(jìn)行灰度值統(tǒng)計(jì)。

1.3.5 實(shí)時(shí)定量反轉(zhuǎn)錄PCR(real-time quantitative reverse transcription PCR，Real-Time qRT-PCR)檢測(cè)miR-491-5p的表達(dá) 從各組細(xì)胞中提取總RNA，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA純度和濃度。根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作，擴(kuò)增引物序列如下。miR-491-5p上游引物：5'-GGAGTGGGGAACCCTTCC-3'，下游引物：5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'；內(nèi)參U6上游引物：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游引物：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。取1 μg總RNA作為模板反轉(zhuǎn)錄為cDNA；以cDNA為模板，PCR反應(yīng)條件為：95.0 ℃ 30 s；95.0 ℃ 5 s、61.5 ℃34 s，2～39個(gè)循環(huán)。結(jié)果以2-ΔΔCt法計(jì)算。

1.3.6 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)BCL2L2的表達(dá)通過TargetScan (http://www.targetscan.org/vert_72/)在線預(yù)測(cè)出miR-491-5p與BCL2L2的3'-UTR之間存在堿基互補(bǔ)關(guān)系。構(gòu)建BCL2L2的3'-UTR野生型及突變型載體，分別將miR-491-5p mimic及其對(duì)照物miR-NC與BCL2L2 3'-UTR野生型(WT)和突變型(MUT)載體轉(zhuǎn)染HTR-8/SV-neo細(xì)胞。48 h后收集細(xì)胞，按照雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒操作說明，檢測(cè)細(xì)胞中螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶活性，計(jì)算方法為螢火蟲熒光值/海腎熒光值。

1.3.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡率 將各組滋養(yǎng)細(xì)胞用1 ml胰酶消化液消化3 min，預(yù)冷PBS洗滌后4 ℃離心收集細(xì)胞，流式緩沖液重懸細(xì)胞，加入5 μl An-nexin V-FITC混勻，4 ℃避光孵育30 min，加5 μl PI染液，孵育5 min，立即用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。細(xì)胞凋亡率為Q1+Q4區(qū)細(xì)胞所占的比例(Q1位于第一象限，表示晚期凋亡細(xì)胞；Q2位于第二象限，表示機(jī)械損傷細(xì)胞；Q3位于第三象限，表示正常細(xì)胞；Q4位于第四象限，表示早期凋亡細(xì)胞)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用Prism7.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以±s表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)；多組間比較采用One-way ANOVA檢驗(yàn)，進(jìn)一步兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。P＆lt;0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 缺氧對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡的影響 細(xì)胞活力染色結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，缺氧組紅色熒光增多，綠色熒光減少，滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡率(%)明顯增高(74.33±5.84vs.39.54±6.56，P＆lt;0.001)；Western blotting檢測(cè)顯示，與對(duì)照組比較，缺氧組滋養(yǎng)細(xì)胞中Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯降低(0.514±0.003vs.1.000±0.000，P＆lt;0.001)，Bax蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯增高(1.687±0.022vs.1.000±0.000，P＆lt;0.01)，Bax/Bcl-2比值明顯增高(3.927±0.264vs.1.000±0.000，P＆lt;0.001，圖1)。

圖1 缺氧對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡和Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)的影響(n=3)Fig.1 Apoptosis and change of expression level of Bcl-2 and Bax protein in trophoblast cells induced by hypoxia (n=3)

2.2 缺氧對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞中miR-491-5p表達(dá)的影響qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，缺氧組miR-491-5p相對(duì)表達(dá)量明顯增高(2.784±0.214vs.1.000±0.000，P＆lt;0.01)。

2.3 miR-491-5p的靶基因預(yù)測(cè)與BCL2L2表達(dá)檢測(cè) 采用生物信息學(xué)軟件TargetScan(http://www.targetscan.org/vert_72/)預(yù)測(cè)的結(jié)果顯示，miR-491-5p與BCL2L2的3'-UTR之間存在堿基互補(bǔ)關(guān)系(圖2)。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)顯示，與對(duì)照組比較，miR-491-5p mimic組共轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-BCL2L2后熒光素酶活性明顯降低(0.531±0.004vs.1.375±0.080，P＆lt;0.001)，而共轉(zhuǎn)染MUT-BCL2L2后熒光素酶活性與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＆gt;0.05)。

圖2 BCL2L2是miR-491-5p的靶基因預(yù)測(cè)及其表達(dá)檢測(cè)結(jié)果(n=3)Fig.2 Analyzing of the target gene of miR-491-5p and expression of BCL2L2 (n=3)

2.4 轉(zhuǎn)染miR-491-5p mimic和miR491-5p inhibitor對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞中miR-491-5p表達(dá)的影響 qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，miR-491-5p mimic組miR-491-5p表達(dá)水平明顯增高(7659.300±191.300vs.5.467±0.503，P＆lt;0.01，圖3A)，而miR491-5p inhibit組miR-491-5p表達(dá)水平明顯降低(0.139±0.022vs.0.323±0.035，P＆lt;0.05，圖3B)。

圖3 轉(zhuǎn)染miR-491-5p mimic (A)和miR-491-5p inhibitor (B)后滋養(yǎng)細(xì)胞中miR-491-5p的表達(dá)水平(n=3)Fig.3 Expression of miR-491-5p was detected by qRT-PCR after trophoblasts were transfection of miR-491-5p mimic (A) and miR-491-5p inhibitor (B), respectively (n=3)

2.5 miR-491-5p對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞中BCL2L2蛋白表達(dá)的影響 Western blotting檢測(cè)各組BCL2L2蛋白表達(dá)情況，結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，缺氧組BCL2L2蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯降低(0.312±0.007vs.1.000±0.000，P＆lt;0.001)；與缺氧組比較，miR-491-5P mimic組BCL2L2蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯降低(0.211±0.013vs.0.312±0.007，P＆lt;0.01)，miR-491-5p inhibit組BCL2L2蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯升高(0.702±0.047vs.0.312±0.007，P＆lt;0.001，圖4)。

2.6 miR-491-5p對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡的影響 Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，與缺氧組比較，miR-491-5p mimic組Bcl-2蛋白表達(dá)量明顯降低(0.203±0.011vs.0.415±0.005，P＆lt;0.001)，Bax蛋白表達(dá)量明顯升高(2.362±0.284vs.1.652±0.085，P＆lt;0.01)；而miR-491-5p inhibit組Bcl-2蛋白表達(dá)量明顯升高(0.752±0.055vs.0.415±0.005，P＆lt;0.01)，Bax蛋白表達(dá)量明顯降低(1.221±0.066vs.1.652±0.085，P＆lt;0.05，圖5A)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，與缺氧組比較，miR-491-5P mimic組細(xì)胞凋亡率明顯升高(23.54%±1.233%vs.16.67%±0.750%，P＆lt;0.001)，而miR-491-5p inhibit組細(xì)胞凋亡率(%)明顯降低(11.56%±0.452%vs.16.67%±0.750%，P＆lt;0.01，圖5B)。

圖5 miR-491-5p對(duì)缺氧誘導(dǎo)的滋養(yǎng)細(xì)胞中Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)及細(xì)胞凋亡率的影響(n=3)Fig.5 Effect of miR-491-5p on apoptosis rate and the expression of Bcl-2 and Bax in trophoblast cells induced by hypoxia (n=3)

3 討 論

PE是以孕婦妊娠后因內(nèi)環(huán)境改變導(dǎo)致胎盤功能障礙為主要特征，以高血壓、蛋白尿等為主要臨床表現(xiàn)的妊娠期特有疾病[2]。據(jù)報(bào)道，PE的發(fā)病率為9%～11%，是世界范圍內(nèi)引起孕產(chǎn)婦及圍產(chǎn)兒死亡的主要原因之一[7]；相比健康孕婦，PE患者的胎兒更易出現(xiàn)宮內(nèi)發(fā)育遲緩、早產(chǎn)和宮內(nèi)死亡。因此，PE的發(fā)生和發(fā)展過程及其機(jī)制研究具有重要的臨床意義。胎盤作為妊娠期特有的臨時(shí)器官，承載著母體營養(yǎng)傳輸和母胎屏障等功能，是妊娠期母胎之間適應(yīng)性調(diào)節(jié)的重要紐帶。值得關(guān)注的是，隨著胎兒及附屬物(胎盤等)的娩出，PE患者的臨床癥狀可消失，各項(xiàng)指標(biāo)也恢復(fù)正常，提示胎盤是該疾病的關(guān)鍵靶器官，其功能異常可能是PE發(fā)生的核心和關(guān)鍵[8-9]。滋養(yǎng)細(xì)胞作為胎盤組織的關(guān)鍵組分，其功能異常已成為當(dāng)前研究的焦點(diǎn)[10-11]。為此，本文選取滋養(yǎng)細(xì)胞作為研究對(duì)象，開展PE的相關(guān)機(jī)制研究。

近年來相關(guān)研究顯示，正常妊娠過程中的細(xì)胞凋亡有利于滋養(yǎng)細(xì)胞生理功能(浸潤(rùn)、遷移等)的調(diào)控，但滋養(yǎng)細(xì)胞過度凋亡可致胎盤淺著床、胎盤血液灌注量減少，進(jìn)而導(dǎo)致PE的發(fā)生[12-13]，提示滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡是促進(jìn)PE進(jìn)程的重要機(jī)制[14]。研究顯示，在由缺氧導(dǎo)致PE和胎兒生長(zhǎng)受限的妊娠女性中，胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡的發(fā)生率更高，這提示缺氧促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡可能是PE的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[15-16]。本研究采用體外缺氧處理滋養(yǎng)細(xì)胞，模擬PE的胎盤環(huán)境，結(jié)果顯示，缺氧后滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡率增高，且凋亡相關(guān)蛋白Bax表達(dá)增高，而Bcl-2蛋白表達(dá)降低，提示缺氧可促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[17-18]，但其具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

miRNA是一類廣泛存在、具有調(diào)節(jié)功能的轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)因子。大量研究顯示，miRNA可通過降解信使RNA(mRNA)來下調(diào)目的基因的表達(dá)，從而參與多種生物學(xué)過程(增殖、凋亡、自噬等)的調(diào)控[19-20]。有研究顯示，PE患者胎盤組織中多種miRNA含量發(fā)生變化，且這些變化可能影響滋養(yǎng)細(xì)胞的功能，進(jìn)而調(diào)節(jié)PE的發(fā)展過程[21]。miR-491-5p是miR-195的成熟體之一，有研究通過基因芯片和功能分析發(fā)現(xiàn)其可調(diào)控VPS28基因在乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)，促進(jìn)癌癥進(jìn)程[22]；有報(bào)道稱miR-491-5p表達(dá)下調(diào)能夠促進(jìn)創(chuàng)傷性腦損傷后血管新生[23]；在人骨肉瘤中的研究顯示，上調(diào)miR-491-5p可靶向癌癥相關(guān)基因FOXP4并抑制其表達(dá)，從而抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡[24]。以上研究提示，miR-491-5p廣泛存在于多種組織細(xì)胞中，可通過調(diào)控細(xì)胞凋亡參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展，但其對(duì)缺氧誘導(dǎo)的滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡的影響尚不明確。本研究通過qRTPCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，缺氧后滋養(yǎng)細(xì)胞中miR-491-5p含量增加，提示其可能參與了缺氧誘導(dǎo)的滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡過程。有研究顯示，miRNA能夠通過作用到靶基因的3'-UTR區(qū)實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因表達(dá)的調(diào)控，從而影響相關(guān)的細(xì)胞生物學(xué)功能[25-26]；BCL2L2蛋白作為Bcl-2蛋白家族的重要成員，有研究顯示其可通過抑制凋亡通路中的關(guān)鍵蛋白——半胱氨酸蛋白酶3和7而發(fā)揮抗凋亡作用[27]。基于此，本研究利用生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)miR-491-5p的靶基因，采用雙熒光素酶報(bào)告基因觀察到，miR-491-5p能夠與BCL2L2結(jié)合，提示BCL2L2可能是miR-491-5p的靶基因，miR-491-5p調(diào)控BCL2L2的表達(dá)可能是促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵機(jī)制。為了進(jìn)一步明確miR-491-5p調(diào)控BCL2L2對(duì)缺氧誘導(dǎo)的滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡的影響，本研究分別過表達(dá)和抑制miR-491-5p后檢測(cè)滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡的變化，結(jié)果顯示，過表達(dá)miR-491-5p后，滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡率增高，且BCL2L2和Bcl-2蛋白表達(dá)降低，Bax蛋白表達(dá)升高，而干擾miR-491-5p后結(jié)果則相反，提示miR-491-5p可通過負(fù)向調(diào)節(jié)BCL2L2蛋白的表達(dá)，促進(jìn)缺氧誘導(dǎo)的滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡。

綜上所述，本研究結(jié)果提示，BCL2L2可能是miR-491-5p的靶基因，miR-491-5p可能是滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵分子，可負(fù)向調(diào)控BCL2L2蛋白的表達(dá)，促進(jìn)缺氧誘導(dǎo)的滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡。滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡是PE的重要環(huán)節(jié)，但其具體的分子機(jī)制尚不清楚。本研究?jī)H在細(xì)胞層面探究了miR-491-5p對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡的影響，其在機(jī)體內(nèi)的具體作用尚待進(jìn)一步驗(yàn)證。關(guān)于miR-491-5p是否在機(jī)體內(nèi)促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡及其可能的調(diào)控機(jī)制可作為后續(xù)進(jìn)一步研究的方向，有望為PE的發(fā)生機(jī)制研究提供新的視角。