石油污染土壤生物修復(fù)技術(shù)研究進(jìn)展

楊全毅 李宏偉 劉亮德 王 娟 劉熙閱 底國彬

（中國石油工程建設(shè)有限公司華北分公司）

石油作為重要的能源和化工產(chǎn)品，被譽(yù)為現(xiàn)代工業(yè)的血液。 然而石油工業(yè)中勘探、采油、煉化及儲(chǔ)運(yùn)等環(huán)節(jié)往往會(huì)對油區(qū)和周邊生態(tài)環(huán)境帶來負(fù)面影響。 研究表明，每生產(chǎn)1 t 石油就有約2 kg 石油污染物進(jìn)入環(huán)境， 油區(qū)工作范圍20 平方千米的土壤均會(huì)不同程度受到石油污染［1］。 土壤是生態(tài)環(huán)境極為重要的組成部分，也是人類社會(huì)賴以生存的珍貴資源，土壤中的石油污染物除其本身的生物毒性外，還會(huì)嚴(yán)重影響土壤結(jié)構(gòu)與功能，進(jìn)而危害環(huán)境安全、農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)量和安全以及人類健康。 石油污染土壤的修復(fù)和治理是亟待解決的世界性環(huán)境問題之一。 近年來，全球石油污染場地修復(fù)案例中，生物修復(fù)技術(shù)因具有比傳統(tǒng)理化修復(fù)方法多的優(yōu)勢，已獲得愈加廣泛的應(yīng)用，并被認(rèn)為是治理大面積石油污染土壤最具實(shí)際應(yīng)用價(jià)值的技術(shù)。

1 石油污染土壤生物修復(fù)技術(shù)概念與分類

微生物和植物是石油污染土壤生物修復(fù)技術(shù)中最為常用的生物。 利用微生物進(jìn)行石油污染土壤修復(fù)，可分為原位修復(fù)和異位修復(fù)兩類主要方法。 原位修復(fù)即在污染現(xiàn)場進(jìn)行修復(fù)，對土壤結(jié)構(gòu)擾動(dòng)小、工程量小，適合較大規(guī)模的場地修復(fù)。 異位修復(fù)需要將受污染土壤轉(zhuǎn)移至合適地點(diǎn)或生物反應(yīng)器中，通常用于石油污染程度高但面積較小的污染場地，相比原位修復(fù)可避免污染物擴(kuò)散，并可以通過對降解條件的控制縮短修復(fù)周期，提高修復(fù)效率。

1.1 微生物原位修復(fù)技術(shù)

1.1.1 生物強(qiáng)化

生物強(qiáng)化（Bioaugmentation）可分為培養(yǎng)土著微生物的生物培養(yǎng)法和引入外源微生物的投菌法。 生物培養(yǎng)法是定期向石油污染土壤中添加營養(yǎng)物質(zhì)和電子受體（如氧或雙氧水等），以滿足土壤中原有土著微生物的生長需要，提高其對石油污染物的降解能力。 投菌法是將定向篩選馴化培養(yǎng)的外源微生物接入石油污染土壤中，并添加其生長所需營養(yǎng)物質(zhì)，通過外源微生物對石油污染物的降解達(dá)到修復(fù)土壤的目的。

由于土壤中的土著微生物在土壤受石油污染的過程中已逐漸對污染物產(chǎn)生耐受，因此相比外源微生物往往具有更高的適應(yīng)性［2］。 從對污染物耐受性高、降解效率高、不影響當(dāng)?shù)丨h(huán)境多樣性的土著微生物中篩選強(qiáng)化獲得的高效石油污染物降解菌，目前在石油污染土壤生物修復(fù)技術(shù)中廣泛應(yīng)用［3］。

1.1.2 生物通風(fēng)

土壤中微生物對石油污染物的自發(fā)降解通常會(huì)使土壤中的氧氣減少，因此對土壤強(qiáng)制曝氣的生物通風(fēng)（Bioventing）法可促進(jìn)微生物降解石油污染物的生物過程。 該方法通常會(huì)在通入空氣時(shí)適量添加氮、磷等元素，以提高土壤中微生物的降解活性。 這種方法可看作土壤氣相抽提技術(shù)與微生物降解技術(shù)的結(jié)合。

該方法的局限性在于只適用于多孔結(jié)構(gòu)、滲透性好、不飽和的污染土壤，不適用的土壤結(jié)構(gòu)在運(yùn)用該方法過程中會(huì)導(dǎo)致氧氣與營養(yǎng)元素在污染物未完全降解前就已被完全消耗，從而使修復(fù)效率受到影響［4］。

1.1.3 生物耕作

生物耕作（Biofarming）法指在石油污染土壤中適當(dāng)施肥灌溉并定期進(jìn)行人工或機(jī)械攪拌，使石油污染物與土壤中微生物、營養(yǎng)物質(zhì)和空氣充分接觸， 盡可能為微生物降解提供良好生長環(huán)境，從而增強(qiáng)微生物的代謝活性，促進(jìn)土壤中石油污染物的降解。 生物耕作法通常適用于污染程度較低的淺表層土壤污染，并常常與植物修復(fù)方法聯(lián)合使用，以提高修復(fù)效率。

1.2 微生物異位修復(fù)技術(shù)

1.2.1 預(yù)制床法

預(yù)制床法（Prepared Bed）是在構(gòu)建的防滲平臺(tái)上鋪墊砂石后， 再平鋪150～300 mm 的石油污染土壤，加入營養(yǎng)物質(zhì)和水，必要時(shí)可適量添加表面活性劑等，同時(shí)定期翻動(dòng)土壤為微生物生長提供充足的氧氣，促進(jìn)微生物對土壤中石油污染物的降解［5］。

1.2.2 土壤堆肥法

土壤堆肥法（Composting Pile）是將污染土壤從污染場地挖掘運(yùn)輸?shù)浇?jīng)過防滲處理、設(shè)置通風(fēng)管道等工程準(zhǔn)備的場地堆放，使用多項(xiàng)強(qiáng)化措施（補(bǔ)充水分、控制通氣量、添加營養(yǎng)物質(zhì)或土壤調(diào)理劑等）來保證適宜的堆體環(huán)境以促進(jìn)微生物生長代謝，從而提高微生物對污染物去除效率的修復(fù)方法。 其中肥料、農(nóng)業(yè)廢棄物及木屑等均可作為調(diào)理劑加入到污染土壤中，以提高土壤營養(yǎng)物質(zhì)含量和滲透性。 該方法常用于污染程度較高和難降解有機(jī)物含量較高的石油污染場地修復(fù)中，研究證明該方法具有良好的修復(fù)效果［6，7］。

1.2.3 生物反應(yīng)器

生物反應(yīng)器（Bioreactor）法又稱生物泥漿法，指挖掘出的石油污染土壤與水混合后形成泥漿，將該泥漿接入石油降解微生物，置于生物反應(yīng)器內(nèi)，在對生物降解過程嚴(yán)格控制的條件下對污染物進(jìn)行處理的修復(fù)方法。 該方法以水相作為處理介質(zhì)，使微生物、營養(yǎng)物質(zhì)、溶解氧和污染物在反應(yīng)器內(nèi)均勻分布且充分接觸， 傳質(zhì)速度加快，因此往往可獲得很好的修復(fù)效果， 修復(fù)周期較短。但該方法對處理設(shè)備有一定要求，且因增加了能耗和物料處置、固液分離、水處理等過程，使得工程成本增高，不適用于面源性石油污染土壤的修復(fù)治理。

1.3 植物修復(fù)技術(shù)與微生物-植物聯(lián)合修復(fù)

石油污染土壤的植物修復(fù)（Phytoremediation）除植物自身對土壤中污染物的降解富集外，植物生長過程中根系分泌的營養(yǎng)物質(zhì)、酶等活性物質(zhì)為土壤微生物提供了良好的生存環(huán)境，從而促進(jìn)微生物生長，提高微生物的污染物降解活性。 植物修復(fù)屬于原位修復(fù)技術(shù)，對土壤擾動(dòng)小，修復(fù)成本低， 但受植物生長周期和外界環(huán)境影響較大，往往修復(fù)周期較長。

目前植物修復(fù)常與微生物修復(fù)技術(shù)聯(lián)用，通過植物與其根際微生物菌群的協(xié)同和聯(lián)合作用，強(qiáng)化對土壤中石油污染物的降解和吸收。 近年來多項(xiàng)研究表明，相比僅依靠植物修復(fù)，微生物-植物聯(lián)合修復(fù)石油污染土壤的修復(fù)效果和周期均具有明顯優(yōu)勢［8，9］。

2 高效土壤石油污染物降解微生物

2.1 微生物的篩選

自然界中具有石油污染物降解能力的微生物數(shù)量約占環(huán)境總微生物數(shù)量的1%， 當(dāng)環(huán)境中石油污染物過量存在時(shí)，可刺激對其具有降解能力的微生物數(shù)量增加到環(huán)境微生物總量的10%［10］。 通過富集和選擇性培養(yǎng)從石油污染土壤中進(jìn)行分離篩選是獲得高效石油污染物降解菌的傳統(tǒng)微生物學(xué)方法。 目前國內(nèi)外已獲得石油降解菌，包括細(xì)菌、真菌、放線菌共約100 余屬，200多種。 土壤中最常見的石油污染物降解細(xì)菌包括： 無色細(xì)菌屬 （Achromobacter）、 不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）、產(chǎn) 堿 桿 菌 屬（Alcaligenes）、節(jié) 桿菌屬（Arthrobacter）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、棒狀桿菌屬 （Corynebacterium）、 黃桿菌屬（Flavobacterium）、 微球菌屬 （Micrococcus）、 分支桿菌屬（Mycobacterium）、諾卡氏菌屬（Nocardia）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、紅球菌屬（Rhodococcus）等。最常見的石油污染物降解真菌包括：曲霉屬（Aspergillus）、 假 絲酵 母 屬 （Candida）、 被 孢 霉 屬（Mortierella）、毛霉屬（Mucor）、青霉屬（Penicillium）、 紅 酵 母 屬 （Rhodotorula）、 擲 孢 酵 母 屬（Sporobolomyces）、木霉屬（Trichoderma）等［11］。

除傳統(tǒng)微生物學(xué)方法外，利用分子生物學(xué)和基因技術(shù)對土壤中石油污染物降解微生物進(jìn)行基因水平的研究，可克服傳統(tǒng)方法對土壤中“不可培養(yǎng)”微生物分離鑒定的限制，更為全面深入地了解微生物的豐度、 多樣性和結(jié)構(gòu)動(dòng)態(tài)變化。例如VASCONCELLOS S P 等的研究中， 通過建立宏基因組文庫（metagenomic clonelibrary）篩選具有石油烴降解能力的菌株， 通過高通量分析（high throughputassays） 從31 000 個(gè)基因克隆中篩選出72 個(gè)具有十六烷烴降解能力的克隆，后通過氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析（GC-MS）對21 d 培養(yǎng)中十六烷烴降解率進(jìn)行測定，獲得5 個(gè)對十六烷烴降解率超過70%的高效克?。?2］。 由此可見，目前多種分子生物學(xué)技術(shù)在微生物篩選過程中的綜合運(yùn)用大幅提高了從環(huán)境中獲得高效功能微生物菌株的效率和準(zhǔn)確性。

2.2 微生物的馴化

經(jīng)篩選獲得的微生物菌株和菌群通常需要在實(shí)驗(yàn)室條件下針對其石油烴降解能力和環(huán)境適應(yīng)能力進(jìn)行進(jìn)一步的馴化加強(qiáng)。 菌種馴化指通過人工措施使微生物逐步適應(yīng)特定環(huán)境條件，以提高微生物對環(huán)境的耐受性，對環(huán)境中某些特定物質(zhì)的分解、轉(zhuǎn)化、利用能力，或?qū)δ承┐x產(chǎn)物的生產(chǎn)能力。 彭德的研究表明，在對石油污染降解菌株的14 d 適應(yīng)性馴化培養(yǎng)過程中，菌體數(shù)量（cfu/mL）增加了100 倍左右，適應(yīng)性得到了顯著的提高［13］。 鄭瑾等在利用不同組分原油逐級馴化篩選高效石油烴降解菌的研究中，由于稠油中含有較高組分的膠質(zhì)和瀝青，稠油的高黏度在一定程度上會(huì)抑制微生物的生長，降低微生物對原油的降解率［14］。 而相比只通過稀油馴化獲得的混合菌群，經(jīng)稀油和稠油兩種不同組分原油逐級馴化得到的混合菌群對稀油和稠油的降解率分別提高了12.5%和22.0%， 混合菌群對石油重質(zhì)組分的適應(yīng)性、耐受性及其對原油中大分子組分的降解能力均獲得提高。 石油污染場地環(huán)境的復(fù)雜性和石油污染物的難降解性，決定了對菌種和菌群進(jìn)行適應(yīng)能力、降解能力的馴化是石油污染土壤生物修復(fù)微生物制劑研發(fā)過程中十分必要的過程。

2.3 菌群的構(gòu)建

石油由飽和烷烴、芳香烴、瀝青及膠質(zhì)等多種物質(zhì)構(gòu)成，石油污染物的降解過程是眾多微生物及其所產(chǎn)生酶的共同作用，目前尚未發(fā)現(xiàn)能夠降解所有石油組分的單一菌種。 微生物菌群在石油污染物的降解過程中發(fā)生一系列酶促反應(yīng)，同時(shí)降解多種石油組分；此外菌種之間通過協(xié)同作用互利共生，促進(jìn)整體生長代謝與降解活性的提高。 趙碩偉等對7 株高效降解石油微生物菌株進(jìn)行研究表明，7 株菌株對石油不同組分具有不同降解能力， 由其中4 種菌株組成的復(fù)合菌群在5 d 培養(yǎng)中對石油的降解率達(dá)70%左右， 高于任何單一菌株和其他組合菌群［15］。RAHMAN K S M 等從Bambay High 原油污染土壤中存在的130 多種石油降解菌中篩選出由假單胞菌屬、棒狀桿菌屬、微球菌屬、黃桿菌屬和芽孢桿菌屬菌株組成的優(yōu)勢菌群，該菌群在20 d 培養(yǎng)中對1%濃度的石油污染物降解率可達(dá)到78%，顯著高于單一菌種41%～66%的降解率［16］。POI G 等在新加坡地區(qū)應(yīng)用由假單胞菌屬、芽孢桿菌屬、不動(dòng)桿菌屬、產(chǎn)堿桿菌屬、無色桿菌屬、短桿菌屬等22 種細(xì)菌組成的復(fù)合微生物制劑對2 500 t 總石油烴含量在7×103～6×105mg/kg 范圍內(nèi)的石油污染土壤進(jìn)行修復(fù)，研究結(jié)果顯示經(jīng)過17 周（119 d）處理后，發(fā)現(xiàn)各污染物濃度類型土壤中總石油烴含量均降到1 000 mg/kg 安全范圍內(nèi)， 并在3 年后的檢測中達(dá)到7～35 mg/kg 的極低濃度，實(shí)現(xiàn)良好修復(fù)效果［17］。

然而，目前我國石油污染土壤生物修復(fù)工程中所使用的微生物菌群多為隨機(jī)組合，外源微生物與土著微生物之間可能存在拮抗作用，導(dǎo)致修復(fù)效果欠佳。 例如何云馨對從天津港篩選的復(fù)合石油烴降解菌進(jìn)行研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，添加復(fù)合菌劑時(shí)飽和烷烴和芳香烴的降解率顯著低于不添加菌劑時(shí)的自然降解率29.82%和76.89%， 這是由于外源微生物與土著微生物之間的拮抗作用會(huì)導(dǎo)致其相互抑制，進(jìn)而使修復(fù)效果下降［18］。 因此，在石油污染土壤生物修復(fù)技術(shù)中，因地制宜構(gòu)建合適的高效石油污染物降解菌群是保證修復(fù)效果和效率的關(guān)鍵。

3 石油污染土壤生物修復(fù)特種植物

目前國內(nèi)外已報(bào)道能夠促進(jìn)石油污染物降解的植物有40 多種，包括玉米（Zeamays L.）、紫花 苜 蓿（Medicago sativa）、 向 日 葵（Helianthus annuus）、黑麥草（Cloliumperenne）、蓖麻（Ricinus communis L.）、 堿 蓬 （Suaeda glauca）、 高 羊 茅（Festuca ovina）等［19］。 我國石油污染土壤植物修復(fù)雖起步較晚， 但已有多項(xiàng)研究證明其可行性。如李先梅等對華北油田石油污染土壤植物修復(fù)的研究中，選取墨西哥玉米草（Purus frumentum）、蘇丹草（Sorghum sudanense）、黑麥草和紫花苜蓿4種牧草植物進(jìn)行不同石油污染水平下成活率、生物量和石油去除率的測定，發(fā)現(xiàn)墨西哥玉米草和蘇丹草的根系發(fā)達(dá)，生長過程中對石油污染危害的調(diào)節(jié)能力強(qiáng)，其成活率、株高、生物量受石油污染濃度影響均較小， 且具有較高的石油去除率，適合作為該區(qū)域石油污染土壤修復(fù)植物［20］。李春榮在陜北地區(qū)石油污染場地以玉米、向日葵、苜蓿、大豆為修復(fù)植物進(jìn)行的連續(xù)兩年原位修復(fù)試驗(yàn)表明，150 d 可以使土壤中初始質(zhì)量濃度為10 000 mg/kg的石油烴分別降解42.5%、46.4%、44.7%、40.6%；500 d 分別降解95.5%、96.1%、92.4%、87.6%，修復(fù)效果明顯［9］。 趙首彩等在隴東地區(qū)石油污染地塊用當(dāng)?shù)啬敛葑匣ㄜ俎Ｗ鳛楣┰囍参镞M(jìn)行田間試驗(yàn)，結(jié)果顯示種植苜蓿地塊的石油污染物去除率為90.07%～96.10%，是空白對照組的1.6～5.2 倍， 證實(shí)了紫花苜蓿對當(dāng)?shù)厥臀廴就寥谰哂泻芎玫男迯?fù)效果［21］。

4 石油污染土壤生物修復(fù)條件優(yōu)化

石油污染土壤生物修復(fù)的效果受到土壤性質(zhì)、污染物濃度、土壤中營養(yǎng)物質(zhì)含量等多種因素影響，通過對修復(fù)條件的優(yōu)化可促進(jìn)微生物與植物的生長，提高生物修復(fù)效果。 在制約石油污染物生物降解的環(huán)境因素中， 土壤的氣體滲透率、含水率和土壤中營養(yǎng)物質(zhì)的成分與含量是最主要的因素。

4.1 土壤氣體滲透率

由于用于生物修復(fù)的微生物大多屬于好氧型微生物，且植物根系生長也需要土壤具有良好的孔隙度與透氣性，因此翻耕、添加膨松劑、設(shè)置通風(fēng)設(shè)施等方式均可通過增加土壤氧氣供給提高修復(fù)效率。 董亞明等在使用混合菌對克拉瑪依地區(qū)稠油污染土壤進(jìn)行修復(fù)研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，每隔兩天翻耕1 次的頻率結(jié)合添加稻殼作為膨松劑，經(jīng)過70 d 的生物修復(fù)， 石油烴降解率最高可達(dá)54.07%，是不翻耕且不添加膨松劑對照中石油烴降解率的2.35 倍［22］。

4.2 土壤含水率

微生物與植物生長均需要適宜的水分作為保證，過高或過低的含水率會(huì)對土壤中生物的生存造成脅迫。 土壤中水分含量過高時(shí)，水會(huì)將土壤孔隙中的空氣替換出來，造成缺氧環(huán)境，不利于好氧微生物與植物的生存；土壤中水分含量過低時(shí)，營養(yǎng)微生物傳質(zhì)速度低，也使得水流作用力遷移的微生物的生長較不利。 通常石油污染土壤生物修復(fù)的適宜土壤含水率在25%～30%范圍內(nèi)［23，24］。

4.3 土壤中的營養(yǎng)物質(zhì)

碳、氮、磷是微生物生長過程中必不可少的重要營養(yǎng)元素。 在石油污染土壤生物修復(fù)過程中，通過添加營養(yǎng)鹽、肥料、農(nóng)業(yè)廢棄物等方式合理補(bǔ)充土壤中的氮、 磷有利于提高微生物降解率，同時(shí)也可促進(jìn)修復(fù)植物的生長。 樊鵬軍等研究表明添加營養(yǎng)物質(zhì)同時(shí)接種高效石油污染物降解微生物可使降解率比自然條件下提高近50%， 僅添加營養(yǎng)物質(zhì)而不接種外源微生物也可使降解率比自然條件下提高約25%［25］。 國內(nèi)外多項(xiàng)研究均獲得與上述研究一致的結(jié)論，即接入高效石油污染物降解微生物的同時(shí)添加營養(yǎng)物質(zhì)，可獲得比僅添加外源微生物或僅添加營養(yǎng)物質(zhì)更好的石油污染物降解效果［23，26～28］。

美國國家環(huán)保局（U.S.EPA） 公布的數(shù)據(jù)顯示，多數(shù)條件下土壤石油污染物降解微生物生長需要的最佳碳∶氮∶磷比例為100∶10∶1［29］。然而由于石油污染土壤生物修復(fù)過程中土壤性質(zhì)、污染物成分和含量、所使用微生物和植物種類差異的復(fù)雜性，適宜的營養(yǎng)元素種類和添加量需根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行設(shè)定。

5 石油污染土壤生物修復(fù)效果評價(jià)

土壤中石油污染物的含量是生物修復(fù)效果最直接的判斷依據(jù)，然而該單一指標(biāo)并不足以全面評價(jià)生物修復(fù)的效果，尤其對土壤生態(tài)功能的修復(fù)應(yīng)使用生物指標(biāo)進(jìn)行評價(jià)。

土壤中微生物的數(shù)量和多樣性是土壤生態(tài)功能的體現(xiàn)，同時(shí)可在一定程度上反映微生物對石油污染物的降解能力［24］。 此外，隨著石油污染物的降解，土壤毒性降低，土壤中微生物種類變得豐富。 楊茜等的研究顯示，生物修復(fù)后土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)多樣性指標(biāo)辛普森指數(shù)（Simpson’s diversity index） 和香農(nóng)指數(shù) （Shannon’s diversity index） 分別從2.95 增加至3.33， 從0.84 增加至0.88，生物多樣性顯著提高［30］。

土壤酶活性也常被用作石油污染土壤生物修復(fù)的評價(jià)指標(biāo)。 脫氫酶具有氫中間傳遞體的作用， 可作為評價(jià)微生物降解石油烴能力的指標(biāo)；多酚氧化酶可將土壤中的芳香族化合物氧化成醌，促進(jìn)石油降解，因此是體現(xiàn)微生物對石油中芳香烴類物質(zhì)降解能力的指標(biāo)；過氧化氫酶能促進(jìn)過氧化氫分解為水和氧氣，是一種土壤毒性指標(biāo)［31］。 此外，土壤修復(fù)前后植物的種子發(fā)芽率、平均生長指數(shù)、生存率、生物量、葉片超氧化物歧化酶（SOD）活性等也常作為評價(jià)土壤生物毒性和生物修復(fù)效果的指標(biāo)［32，33］。

6 結(jié)束語

筆者基于對石油污染土壤生物修復(fù)技術(shù)相關(guān)文獻(xiàn)調(diào)研，對石油污染土壤生物修復(fù)技術(shù)的概念和分類、高效土壤石油污染物降解微生物的篩選、馴化及菌群構(gòu)建，石油污染土壤生物修復(fù)特種植物，修復(fù)條件優(yōu)化，綜述了修復(fù)效果評價(jià)等技術(shù)的關(guān)鍵點(diǎn)， 為項(xiàng)目研究提供理論框架與依據(jù)。