外源磷調(diào)節(jié)下銅對(duì)波斯菊種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)的影響

郭曉蕾，王友保

（1.安徽師范大學(xué) 生態(tài)與環(huán)境學(xué)院，安徽 蕪湖 241002；2.廈門(mén)大學(xué) 環(huán)境與生態(tài)學(xué)院，福建 廈門(mén) 361102）

隨著采礦和冶金等行業(yè)的快速發(fā)展，土壤重金屬污染狀況日益嚴(yán)重[1]。例如，銅礦區(qū)礦業(yè)活動(dòng)會(huì)造成重金屬銅進(jìn)入周邊水體和土壤，破壞土壤結(jié)構(gòu)與營(yíng)養(yǎng)，破壞生物生存環(huán)境，進(jìn)而危害人類健康[2]。研究表明，植物體內(nèi)過(guò)量的銅會(huì)危害植物種子萌發(fā)與幼苗生長(zhǎng)，其中植物根系與土壤接觸最為密切，會(huì)最先受到銅毒害，進(jìn)而使植物的生長(zhǎng)發(fā)育受到影響[3]。適當(dāng)增加植物生長(zhǎng)環(huán)境的磷含量可以加速植物生長(zhǎng)并提高產(chǎn)量，因?yàn)榱卓纱龠M(jìn)根系快速生長(zhǎng)，并使植物更早地獲得生長(zhǎng)所需的資源[4]。過(guò)量施用磷肥反而會(huì)造成植物損傷[5]，適當(dāng)施加磷肥才會(huì)對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育有益，尤其是可以促進(jìn)植物根系發(fā)育和提高植物的抗逆性[6-7]。

波斯菊（Cosmos bipinnatusCav.）別名秋英、大波斯菊，為菊科秋英屬一年生或多年生草本花卉，喜光，可以耐受貧瘠的土壤，生命力旺盛。作為一種常見(jiàn)的觀賞花卉，波斯菊已廣泛應(yīng)用于城市園林綠化中。研究證實(shí)，波斯菊能夠在一定程度的重金屬脅迫下生存[8]，而添加適宜濃度的外源磷可有效緩解植物受重金屬脅迫所導(dǎo)致的生長(zhǎng)發(fā)育不良癥狀[9]?；诖?，本文研究了不同濃度的磷對(duì)銅脅迫下波斯菊種子萌發(fā)與幼苗生長(zhǎng)的影響，以期揭示波斯菊的銅脅迫響應(yīng)機(jī)制，并為更好地利用其修復(fù)重金屬污染土壤提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

供試波斯菊種子購(gòu)自于山東濟(jì)南匠人花海；實(shí)驗(yàn)所用的磷為KH2PO4，銅為分析純CuSO4·5H2O。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

選取飽滿無(wú)殘缺的波斯菊種子，先用10%次氯酸鈉溶液消毒10 min，然后用蒸餾水反復(fù)沖洗干凈，最后用濾紙吸干種子表面水分備用。將消毒后的種子均勻地放于鋪有雙層濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)，每皿30粒。參照陳天等的方法[9]，設(shè)置3個(gè)KH2PO4水平（0、2和20 mg/L，以P濃度計(jì)算），并以霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液配置Cu-SO4濃度梯度溶液（0、10、50、100、200、250 mg/L，以Cu2+濃度計(jì)算），共18個(gè)處理，分別對(duì)各組種子添加不同濃度的溶液，每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)平行。于25°C智能光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每天補(bǔ)充適量相應(yīng)濃度的重金屬溶液，使濾紙和種子保持濕潤(rùn)狀態(tài)，且濾紙周?chē)怀霈F(xiàn)任何水膜。若種子出現(xiàn)發(fā)霉則及時(shí)移出，必要時(shí)則更換培養(yǎng)皿和濾紙。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目

實(shí)驗(yàn)周期共12 d。從第3 d 開(kāi)始，連續(xù)每天記錄種子發(fā)芽數(shù)（標(biāo)準(zhǔn)為波斯菊種子的芽長(zhǎng)等于種子長(zhǎng)度的1/2），并計(jì)算發(fā)芽勢(shì)和相對(duì)發(fā)芽勢(shì)；在第12 d 計(jì)算發(fā)芽率和相對(duì)發(fā)芽率，并測(cè)定幼苗株高和主根長(zhǎng)，同時(shí)觀察幼苗的外傷癥狀，并測(cè)定幼苗葉片的丙二醛（MDA）含量。在觀察植物生長(zhǎng)狀況時(shí)，采用目測(cè)估計(jì)法，將植株生長(zhǎng)狀況分為4個(gè)等級(jí)：正常生長(zhǎng)（無(wú)傷害），目測(cè)不到傷害癥狀；輕度傷害：僅中心部位失綠（以明顯淺于正常生長(zhǎng)葉片的綠色作為失綠的判斷依據(jù)，下同）；中度傷害：葉片中心部位及外圍出現(xiàn)不同程度失綠；重度傷害：植株矮小，葉片失綠[10]。葉片MDA含量測(cè)定采用硫代巴比妥酸法[11]。

1.4 指標(biāo)統(tǒng)計(jì)及計(jì)算

在觀察種子萌發(fā)狀況時(shí)，統(tǒng)計(jì)指標(biāo)主要有發(fā)芽數(shù)、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率、相對(duì)發(fā)芽勢(shì)和相對(duì)發(fā)芽率，測(cè)定方法包括[11]：發(fā)芽勢(shì)（%）為3 d內(nèi)籽粒萌發(fā)數(shù)與相應(yīng)籽?？倲?shù)之比再乘以100；相對(duì)發(fā)芽勢(shì)（%）為重金屬處理組發(fā)芽勢(shì)與對(duì)照組發(fā)芽勢(shì)之比再乘以100；發(fā)芽率（%）為萌發(fā)數(shù)與籽?？倲?shù)之比再乘以100；相對(duì)發(fā)芽率（%）為重金屬處理組萌發(fā)率與對(duì)照組萌發(fā)率之比再乘以100。使用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并使用Excel 2007進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源磷對(duì)銅脅迫下波斯菊種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)指標(biāo)的影響

由表1可知，隨著Cu2+濃度的增加，波斯菊種子的發(fā)芽勢(shì)和相對(duì)發(fā)芽勢(shì)先增加后減少。在Cu2+濃度為50 mg/L和100 mg/L時(shí)，發(fā)芽勢(shì)處于較高值；當(dāng)Cu2+濃度到達(dá)200 mg/L及以上時(shí)，發(fā)芽勢(shì)和相對(duì)發(fā)芽勢(shì)較對(duì)照組明顯降低。隨著外源磷濃度升高，相同Cu2+濃度下的種子發(fā)芽勢(shì)和相對(duì)發(fā)芽勢(shì)基本呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，但當(dāng)Cu2+濃度在50 mg/L和100 mg/L時(shí)，隨外源磷輸入濃度增高，種子發(fā)芽勢(shì)和相對(duì)發(fā)芽勢(shì)也越高。

表1 外源磷對(duì)銅脅迫下波斯菊種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)指標(biāo)的影響

隨著Cu2+濃度增加，波斯菊種子的發(fā)芽率和相對(duì)發(fā)芽率先增加后減少。在Cu2+濃度為100 mg/L時(shí)，發(fā)芽勢(shì)到達(dá)最高值；當(dāng)Cu2+濃度到達(dá)250 mg/L時(shí)，發(fā)芽勢(shì)和相對(duì)發(fā)芽勢(shì)最低，且與對(duì)照組相比明顯降低。同時(shí)，隨著外源磷濃度的提高，種子的發(fā)芽率和相對(duì)發(fā)芽率大致呈不斷降低的趨勢(shì)。在高濃度磷和銅處理的培養(yǎng)皿里，部分已萌發(fā)的種子葉片發(fā)褐、扭曲甚至死亡，意味著高濃度外源磷和銅處理對(duì)種子的初期萌發(fā)是有益的，但隨著時(shí)間推移，種子受到的傷害逐漸累積，最終導(dǎo)致其死亡。當(dāng)Cu2+濃度較低（0 mg/L和10 mg/L）時(shí)，波斯菊幼苗的株高和根長(zhǎng)較大，隨Cu2+濃度增加，幼苗株高和根長(zhǎng)呈降低趨勢(shì)，當(dāng)Cu2+濃度高于200 mg/L時(shí)，幼苗株高和根長(zhǎng)與對(duì)照組相比明顯降低。當(dāng)磷濃度為2 mg/L時(shí)，幼苗株高和根長(zhǎng)比未施加外源磷下銅脅迫的各組幼苗略有增高，而高濃度磷（20 mg/L）則較未施加外源磷處理的降低。

2.2 外源磷對(duì)銅脅迫下波斯菊幼苗外傷的影響

波斯菊幼苗的外傷癥狀與培養(yǎng)液中Cu2+濃度直接相關(guān)。當(dāng)Cu2+濃度不超過(guò)50 mg/L時(shí)，各組幼苗未出現(xiàn)明顯的外傷癥狀，且多株幼苗已長(zhǎng)出心葉，生長(zhǎng)狀況良好。當(dāng)Cu2+濃度達(dá)到100 mg/L時(shí)，幼苗開(kāi)始出現(xiàn)輕度外傷癥狀，有葉片中心失綠的現(xiàn)象。當(dāng)Cu2+濃度到達(dá)200 mg/L時(shí)，幼苗傷害嚴(yán)重，開(kāi)始出現(xiàn)明顯的中度傷害癥狀，且幼苗葉片的中心和外圍有不同程度的失綠，部分葉片開(kāi)始出現(xiàn)紅褐色的斑點(diǎn)，植株也比較矮小。當(dāng)Cu2+濃度達(dá)到250 mg/L時(shí)，幼苗出現(xiàn)重度傷害癥狀，葉片多處有紅褐色斑點(diǎn)，而且有的幼苗嚴(yán)重失綠，葉片呈黃褐色，植株矮小。與此同時(shí)，在高的外源磷濃度（20 mg/L）下，波斯菊受銅脅迫所造成的外傷癥狀也更加嚴(yán)重。

2.3 外源磷對(duì)銅脅迫下波斯菊幼苗丙二醛含量的影響

隨著Cu2+濃度增加，波斯菊幼苗葉片MDA含量不斷升高（圖1）。當(dāng)外源磷濃度相同，而Cu2+濃度為0、10、50 mg/L 時(shí)，葉片MDA 含量無(wú)顯著差異；當(dāng)Cu2+濃度達(dá)到100 mg/L及以上時(shí)，葉片MDA含量隨Cu2+濃度上升而明顯上升。同時(shí)，隨著外源磷濃度的升高，葉片MDA含量呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢(shì)。當(dāng)磷濃度為2 mg/L時(shí)，銅脅迫下各組葉片MDA含量均較另外兩組磷調(diào)節(jié)下葉片MDA含量低。

2.4 種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)的最適磷濃度

將外源磷濃度和各組銅脅迫下波斯菊的發(fā)芽勢(shì)、根長(zhǎng)和葉片MDA含量進(jìn)行回歸分析，并計(jì)算銅脅迫下對(duì)種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)促進(jìn)效果最好的磷濃度平均值。由表2和表3可知，外源磷濃度在6.37 mg/L和9.08 mg/L 時(shí)對(duì)波斯菊發(fā)芽勢(shì)和根長(zhǎng)的促進(jìn)效果最好。由表4 可計(jì)算銅脅迫下各組最佳磷濃度平均值，當(dāng)外源磷為10.65 mg/L時(shí)，葉片MDA含量最低，意味著外源磷緩解銅脅迫對(duì)幼苗危害的效果最好。綜合來(lái)看，在Cu2+濃度低于50 mg/L時(shí)，9.78 mg/L外源磷輸入對(duì)波斯菊的生長(zhǎng)最為適宜；在Cu2+濃度高于100 mg/L時(shí)，5.25 mg/L外源磷對(duì)波斯菊的生長(zhǎng)最佳。

表2 外源磷對(duì)銅脅迫下波斯菊種子發(fā)芽勢(shì)的回歸分析

表3 外源磷對(duì)銅脅迫下波斯菊幼苗根長(zhǎng)的回歸分析

表4 外源磷對(duì)銅脅迫下波斯菊幼苗丙二醛含量的回歸分析

3 討論

土壤本身就含有一定量的重金屬元素，其中的銅元素是植物生長(zhǎng)所必需的微量營(yíng)養(yǎng)元素之一。土壤銅污染主要來(lái)自銅礦山和冶煉廢水[12-13]，只有當(dāng)土壤累積的重金屬濃度超過(guò)植物需求，甚至超出其耐受極限，植物才會(huì)表現(xiàn)出受損傷的癥狀。研究重金屬脅迫下種子發(fā)芽及幼苗生長(zhǎng)情況，觀察其能否在實(shí)驗(yàn)?zāi)M環(huán)境中順利生長(zhǎng)，有利于判斷植物能否在環(huán)境脅迫下繁殖擴(kuò)散，可以為重金屬污染土壤的植物修復(fù)與治理提供理論參考和技術(shù)支撐[14]。

在單一銅脅迫下，隨著Cu2+濃度升高，波斯菊種子的發(fā)芽勢(shì)、相對(duì)發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率、相對(duì)發(fā)芽率、株高和根長(zhǎng)均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，說(shuō)明低濃度的銅不僅不會(huì)對(duì)植物生長(zhǎng)造成損傷，而且有利于其發(fā)芽和生長(zhǎng)[15]。當(dāng)Cu2+濃度低于100 mg/L 時(shí)，其對(duì)波斯菊種子的發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率有促進(jìn)作用，說(shuō)明在萌發(fā)期，適當(dāng)?shù)你~添加有利于提高種子的發(fā)芽率[16]。與此同時(shí)，10 mg/L的Cu2+濃度可以促進(jìn)波斯菊幼苗的長(zhǎng)高和生根，而100 mg/L的Cu2+濃度則對(duì)幼苗株高和根長(zhǎng)有顯著抑制作用，且這種抑制作用在根長(zhǎng)方面比株高更明顯。出現(xiàn)此現(xiàn)象的原因可能是由于根直接接觸銅溶液，銅毒害更容易作用于根部細(xì)胞，從而影響了根細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育[17]。植物受重金屬脅迫的最直接體現(xiàn)就是其外傷癥狀，可以通過(guò)幼苗長(zhǎng)勢(shì)、葉片顏色和形態(tài)來(lái)初步判斷其是否受到脅迫。當(dāng)Cu2+濃度超過(guò)100 mg/L時(shí)，可以明顯觀察到波斯菊幼苗的受害情況，其逐漸表現(xiàn)為中度傷害和重度傷害，葉片有不同程度的失綠和紅褐色斑點(diǎn)，同時(shí)植株矮小且卷曲在一起，有根尖壞死現(xiàn)象。此外，在逆境脅迫下植物往往會(huì)發(fā)生膜脂過(guò)氧化作用，其中MDA是膜脂過(guò)氧化的最后產(chǎn)物，當(dāng)其積累到一定量時(shí)就會(huì)對(duì)生物膜造成傷害[18]。因此，MDA是反映植物體抗氧化能力的重要參數(shù)，測(cè)量波斯菊幼苗MDA含量可以作為考察細(xì)胞受脅迫程度的指標(biāo)之一。當(dāng)Cu2+濃度較低時(shí)，波斯菊幼苗MDA含量變化不明顯，但是當(dāng)Cu2+濃度超過(guò)100 mg/L時(shí)，MDA含量就明顯上升，說(shuō)明了高濃度的Cu2+濃度脅迫會(huì)使幼苗發(fā)生膜脂過(guò)氧化以致于引起膜損傷。

此外，磷是植物生長(zhǎng)過(guò)程所需的一種重要營(yíng)養(yǎng)元素，也是影響植物生長(zhǎng)和產(chǎn)量的主要因素之一，多施磷肥可以促進(jìn)作物生長(zhǎng)[19]。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，低濃度的外源磷輸入對(duì)波斯菊的發(fā)芽勢(shì)、相對(duì)發(fā)芽勢(shì)、株高和根長(zhǎng)等指標(biāo)有促進(jìn)作用，能降低幼苗MDA含量，減輕幼苗膜脂過(guò)氧化傷害。研究表明，添加磷酸鹽會(huì)緩解植物所受到的重金屬脅迫[20]，因此低濃度的外源磷輸入可能會(huì)改善銅污染區(qū)域的植物生長(zhǎng)，減輕高濃度銅脅迫所引起的損傷。但是，隨著外源磷濃度的增加，植物受毒害的現(xiàn)象非但沒(méi)有減輕反而加劇了。本文研究發(fā)現(xiàn)，20 mg/L 磷濃度下波斯菊的發(fā)芽率和相對(duì)發(fā)芽率明顯降低，外傷癥狀加劇，且MDA含量也明顯升高，意味著在高磷水平下輸入銅，波斯菊將受到更嚴(yán)重的脅迫。在施加外源磷肥時(shí)，應(yīng)先考慮土壤受銅污染的程度，以及對(duì)植物發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率最有益的濃度。在低銅或無(wú)銅環(huán)境中，9.78 mg/L外源磷對(duì)波斯菊的生長(zhǎng)最有益；在銅脅迫嚴(yán)重的環(huán)境中，5.25 mg/L外源磷則有利于波斯菊生長(zhǎng)。在植物生命周期中，種子發(fā)芽和幼苗生長(zhǎng)是關(guān)鍵階段，可能受到多種因素的脅迫，當(dāng)環(huán)境中銅濃度較低時(shí)，波斯菊可以忍受較高磷濃度，較高磷濃度更能促進(jìn)其生長(zhǎng)，但是當(dāng)其處于高銅脅迫下，可能較低磷濃度才有利于調(diào)節(jié)其生長(zhǎng)，而過(guò)高磷濃度反而會(huì)和銅協(xié)同對(duì)種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)造成更嚴(yán)重的傷害。因此，在添加外源磷肥來(lái)緩解生長(zhǎng)在銅污染土壤的受害植物癥狀時(shí)，應(yīng)該通過(guò)實(shí)驗(yàn)來(lái)謹(jǐn)慎確定外源磷的含量。